Summary
Этот протокол описывает поколение пациентов полученных ортопедических ксенотрансплантатмоделей моделей внутри-vesically прививая высококачественные клетки уротелиальной клетки карциномы или внутриректично инъекционных колоректальных раковых клеток в нетупозированную диабетическую/ тяжелую комбинированную иммунодефицита (NOD/SCID) мышей для первичного роста опухоли и спонтанных метастазов под воздействием лимфатических узлов стромальных клеток, которые имитируют прогрессирование метастатических заболеваний человека.
Abstract
Онкологические больные имеют плохие прогнозы, когда лимфатический узла (LN) участие присутствует в обоих высококачественных уротелиальных клеток карциномы (HG-UCC) мочевого пузыря и колоректального рака (CRC). Более 50% пациентов с инвазивной мускулистой UCC, несмотря на лечебную терапию для клинически локализованных заболеваний, будут развиваться метастазаи и умирают в течение 5 лет, и метастатическая CRC является ведущей причиной смерти, связанной с раком в США. Ксенотрансплантат модели, которые последовательно имитируют UCC и CRC метастазировать видели у пациентов необходимы. Это исследование направлено на создание пациента полученных ортотопических ксенотрансплантата (PDOX) модели UCC и CRC для первичного роста опухоли и спонтанных метастазов под влиянием Стромальных клеток ЛН имитирует прогрессирование человеческих метастатических заболеваний для скрининга наркотиков. Свежие опухоли UCC и CRC были получены от согласованных пациентов, проходящих резекцию для HG-UCC и колоректальной аденокарциномы, соответственно. Совместно с LN стромальной клетки (LNSC) аналоговые клетки HK, luciferase-tagged UCC клетки были внутри-vesically (IB) привили в женских не-ожирения диабетической / тяжелой комбинированной иммунодефицита (NOD / SCID) мышей, и КЛЕТКи CRC были внутриректированных (IR) вводили в мужские мышей NOD/SCID. Рост опухолей и метастазы отслеживались еженедельно с помощью биолюминесценционной визуализации (BLI). При жертве, первичные опухоли и органы мыши были собраны, взвешены, и формалин-фиксированной для гематаксилина и эозина и иммуногистохимии окрашивания. В наших уникальных моделях PDOX опухоли ксенотрансплантата напоминают предимплантационные опухоли пациента. В присутствии hK-клеток обе модели имеют высокие показатели имплантации опухоли, измеряемые БЛИ и массами опухоли, 83,3% для UCC и 96,9% для CRC, а также высокие показатели метастазов органов (33,3% обнаруженных метастазов печени или легких для UCC и 53,1% для CRC). Кроме того, обе модели имеют нулевую смертность от этой процедуры. Мы создали уникальные, воспроизводимые модели PDOX для человека HG-UCC и CRC, которые позволяют для формирования опухоли, роста и метастазирования исследований. С помощью этих моделей тестирование новых терапевтических препаратов может быть выполнено эффективно и в клинически-миметической манере.
Introduction
Было показано, что метастазы лимфатических узлов (LN) является плохим прогностическом показателем во многих твердых злокачественных новообразований органов, в том числе высококачественной уротелиальной клеточной карциномы (UCC) мочевого пузыря и колоректального рака (CRC)1,2. Более половины пациентов с инвазивной мускулистой UCC (MIUCC), несмотря на лечебную терапию для клинически локализованных заболеваний, будут развивать метастазы и умирают в течение 5 лет. Метастатическая CRC является ведущей причиной смерти, связанной с раком в США.
По оценкам, 81 190 новых пациентов и 17 240 случаев смерти от рака, как ожидается, произойдет в 2018 году в Соединенных Штатах из-за UCC мочевого пузыря3,4. В то время как пациенты будут преимущественно (70%) настоящее время с немышечными инвазивными заболеваниями, 30% будет иметь MIUCC5. Несмотря на лечебную терапию (радикальную цистэктомию с системной химиотерапией или без нее) при клинически локализованном заболевании,у половины пациентов с MIUCC мочевого пузыря все равно разовьется метастазы и они умирают в течение 5 лет 3. Участие лимфатических узлов встречается примерно у 20%-25% пациентов, перенесших RC6,7,8. Пятилетняя выживаемость у положительных пациентов СЛ составляет менее 35% даже после RC, что свидетельствует о том, что участие LN в качестве важнейшего отрицательного предиктора прогноза у пациентов СКК.
Колоректальный рак является третьим наиболее распространенным раком диагностируется у мужчин и женщин в Соединенных Штатах. Исходы пациентов в значительной степени зависят от характеристик опухоли и микроокружения опухоли, таких как глубина вторжения, участие LN, и отдаленные метастазы органа. Хотя смертность в CRC снизилась в последнее десятилетие из-за скрининга и эффективных операций, по оценкам, почти 50% пациентов CRC будет развиваться метастазаили или рецидивирующие заболевания9.
Малые модели животных обеспечивают оперативную, воспроизводимую и модифицируемую платформу для изучения прогрессирования опухоли и различных метастатических моделей. Есть в настоящее время не описанные модели ксенотрансплантата, которые последовательно имитируют CRC и Метастаз UCC видели у пациентов. Основной путь рака отдаленных метастаз через лимфатические распространения. Новые исследования показывают, что LNs обеспечивают опухоли с уникальной микросредой, и не только просто стационарные цели, где раковые клетки временно проходят, но и играют важную роль, взаимодействуя с раковыми клетками в метастатическом процессе. Действительно, наши исследования показали, что, в дополнение к обучению и содействию прогрессирования опухоли и метастазирования, LN стромальной микросреды также несет ответственность за лекарственную устойчивость в CRC10,11. Наша лаборатория недавно подтвердила опухолевые эффекты LN стромальных клеток (LNSCs) на CRC и UCCs с использованием пациента полученных ортотопический ксенотрансплантат (PDOX) модели мыши12,13.
Разработка моделей PDOX является важной платформой для трансляционных исследований рака14,15. Поддерживая основные гистологические и генетические характеристики их донорской опухоли, модели PDOX остаются стабильными через проходы и сделать хорошие платформы для трансляционных исследований рака12,15. Модели PDOX используются для доклинической оценки лекарственных средств, идентификации биомаркеров и доклинической оценки персонализированных стратегий медицины, позволяющих прогнозировать клинические исходы. В настоящее время нет описанных моделей ксенотрансплантата, которые учитывают важность участия LN и способны последовательно воспроизводить первичную опухоль и отдаленные метастазы органов в CRC и UCC. В этом исследовании мы описываем разработку моделей PDOX у мышей NOD/SCID с размножением метастатических заболеваний CRC и UCC с участием LNSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные в этих исследованиях на животных, были проведены в соответствии с утвержденными руководящими принципами Институционального комитета по уходу за животными и использованию системы здравоохранения Ochsner и в соответствии с руководящими принципами исследований на животных. Все опухоли пациентов для этого исследования были собраны у пациентов, перенесённых на операцию по резекции рака в соответствии с Советом по обзору системы здравоохранения Ochsner и этическими стандартами Институционального комитета по правам человека Экспериментов. Сертифицированные патологоанатомы системы здравоохранения Ochsner определили патологические диагнозы образцов пациентов на основе микроскопических особенностей опухолевых клеток, их гистологического типа и уровня класса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол описывает шаги для двух отдельных моделей ксенотрансплантата, модель UCC через электрокаутеризацию стенки мочевого пузыря, чтобы привить клетки UCC и внутриректальную инъекцию клеток CRC для изучения в модели CRC. Все шаги, готовящихся к экспериментам и отслеживая их, идентичны для обеих моделей, в то время как разделы 7 и 8 конкретно описывают процедуру закапывания UCC и инъекций CRC, соответственно.
1. Культивирование клеточных линий
- Выращивайте клетки HK в полной среде RPMI-1640, дополненной 10% сывороткой крупного рогатого скота плода, 2 нМ глутамина, 100 U/mL пенициллина G и 100 мг/мл стрептомицина при 37 градусах по Цельсию в 5% CO2 увлажненного инкубатора.
ПРИМЕЧАНИЕ: HK клетки являются нормальными человеческими фолликулярными дендритных клеток и могут быть выращены и расширены для 15 проходов в пробирке16. - Чтобы подготовиться к эксперименту, попробуйте клетки.
- Удалить средства массовой информации и добавить 2 мл 1% трипсина в сбалансированном солей раствор Хэнка (HBSS) в клетки. Поместите клетки обратно в 5% CO2 увлажненный инкубатор при 37 градусах по Цельсию в течение 4 мин.
- Соберите клетки из тарелки в трубку 15 мл с помощью портативной помощи труба с 10 мл серологического пайпета прилагается. Добавьте 8 мл полной среды RPMI-1640.
- Объедините 40 qL клеток и 40 л трипан синего в одном колодце из 96 хорошо пластины. Добавьте 10 кл/л смеси к гемоситометру и посчитайте живые клетки. Добавьте 1 миллион клеток в 25 мл полной RPMI-1640 среды 150 мм стерильной ткани культуры обработанных блюдо продолжать расти клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: HK подвеска клеток подготовлена в этом шаге должны быть использованы в течение часа, чтобы смешать с опухолевыми клетками для инъекций.
2. Коллекция образцов пациентов
- Соберите опухоли UCC от согласованного пациента 15 (BlCaPt15, pT3b N1 M0) и 37 (BlCaPt37, pT3b pN0 M0) при резекции хирургии.
- Соберите опухоли CRC от согласованного пациента 155 (CoCaPt155, T1 N0 M0) и 302 (CoCaPt302, T1 N0 M0) при резекции хирургии.
3. Расширение опухоли пациента
- Сбор опухолей при операции в холодной стерильной среде Маккой, содержащий пенициллин G (500 U/mL) и стрептомицин (500 мг/мл).
- Имплантирует опухоли непосредственно в левый и правый фланг женщин-самок NOD/SCID.
- Механически фарш ткани на мелкие кусочки (1 мм3) с помощью небольших хирургических ножниц.
- Имплантирование ткани подкожно на левый и правый фланг с помощью 13 G асписации костного мозга биопсии иглы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Имплант общей объемом 8 мм3 делится равномерно с обеих сторон фланга.
4. Пометка и обогащение опухолей с маркировкой люциферазы
- Измеряйте рост опухоли раз в неделю с помощью цифрового калибровки.
- При диаметре 1 см преобразуй опухоль. Непосредственно вводить в опухоль с одной дозой Люк / красный флуоресцентный белок (RFP)-лентивирус (50 Л/ опухоли, 1:30 разбавления из концентрированного высокого титра лентивирусного запаса) с использованием 1 см шприца с 27 G иглы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Опухоль пациента обычно достигает 1 см в диаметре в 1'2 месяцев. Тем не менее, темпы роста чрезвычайно изменчивы и основаны на ряде факторов, включая сорт опухоли и тип. - Мониторинг опухоли еженедельно биолюминесцентной визуализации (BLI) у живых животных.
- Взвесьте мышей. Введите сознательную мышь с 150 мг/кг люциферина интраперитонена и ждать 5 минут для субстрата, чтобы циркулировать в теле мыши.
- Анестезируйка мыши с 2,5% изофлуран в 100% кислорода, 1 л / мин в индукционной камере.
- Поместите мышь на живот в машине визуализации BLI с изофруранте течет и изображение. Возьмите последовательные изображения, чтобы подтвердить наличие Luc /RFP положительных опухолевых регионов (ложноцветное биолюминесцентное изображение). Вернуть мышь в клетку после завершения изображения.
5. Выберите подходящую часть опухоли для ферментативного пищеварения
- В день процедуры UCC или CRC, изображение мыши с люциферазы помечены опухоли, как в шагах 4.3.1 и 4.3.3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность времени для подкожной опухоли расти зависит от скорости роста опухоли и планируемого числа животных, которые будут введены в эксперименте. - Урожай опухоли с мышеловки фланг и изображение.
- Эвтаназия мыши с помощью вдыхания CO2 после визуализации. Поместите мышь в камеру CO 2, включите газ при 1,4 л/мин до остановки дыхания и оставьте на 3 мин. Следуйте этому с вывихом шейки матки.
- Чистая кожа с 70% этанола. Палатка кожи непосредственно над опухолью. С помощью хирургических ножниц сделайте небольшой разрез на коже. Отделить кожу от опухоли ножницами.
- Удалить опухоль и поместить в стерильный петри-блюдо. Изображение всего блюда в аппарате визуализации.
- Используйте стерильные ножницы или скальпель, чтобы отделить люциферазы-отрицательные участки от люциферазы положительных секций в опухоли и повторного изображения.
- Повторяйте до тех пор, пока не останутся только самые положительные опухолевые кусочки.
6. Ферментативное пищеварение опухоли
- Под ламинарным капотом потока, фарш luciferase положительные части опухоли (шаг 5.4) в мельчайшие возможные куски с помощью стерильных хирургических ножниц и положить их в стерильной 50 мл конической трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обнучивание опухоли в мельчайших возможных частей даст больше отдельных клеток. - Приготовьте раствор дайджеста, добавив 10 мл коллагеназы IV (1,5 мг/мл), 80 мл гиалуронидаза (20 мг/мл) и 160 л дезоксирибонулеза I (0,1 мг/мл) до 40 мл HBSS. Смешайте решение путем инвертирования.
- Добавьте 35–40 мл раствора дайджеста в рубленую опухоль. Инкубировать при 37 градусах Цельсия с непрерывным вращением в течение 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Энергично встряхнуть трубку периодически на протяжении инкубации, чтобы предотвратить опухолевые ткани от слипания. - Фильтр всего пищеварения через стерильные 100 мкм ячейки ситечко следуют 40 мкм ячейки ситечко для удаления мусора. Сохранить поток через и отбросить мусора.
- Вымойте свободные клетки, добавив 20 мл HBSS и центрифуги на 329 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и resuspend гранулы в 30 мл HBSS.
- Смешайте 10 злклеетового раствора и 90 зл трипан-голубого в одном колодце пластины из 96 скважин. Считайте живые клетки с помощью гемакитометра.
- Передача 1 х 104 х 1 х 106 опухолевых клеток на мышь в стерильной 15 мл конической трубки. Добавьте 3 х 105 HK-клеток от шага 1.2.3 на мышь, в ту же трубку с опухолевыми клетками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильную коническую трубку 50 мл, если общий объем превышает 15 мл. Всегда вычисляйте больше доз для дополнительных животных в исследовательской группе, чтобы объяснить потерю жидкости во время использования шприца. Например, если группа содержит 5 мышей, сделайте достаточное количество клеток для 6 или 7 мышей. - Центрифуга при 329 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант либо путем аспирации или пипетки.
- Повторное использование ячеек в 50 л на мышь для модели UCC или 10 л на мышь для модели CRC в полных носителях RPMI. Держите клеточной подвески на льду до готовности к использованию.
7. Модель мыши UCC
- Подготовка мышей к процедуре
- Получить шесть-восемь недель женщина NOD / SCID мыши. Бритье нижней части спины мыши с помощью крема для удаления волос. Анестезируйка мыши в индукционной камере с изофлураном (2,5% в 100% кислороде, 1 л/мин).
- После успокоительного, место мыши в положении на спине с мордой в изофларанном носовой конус и голой спиной твердо заземлены на дисперсивный электрод.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь полностью успокоительное, если не реагирует на нос щепотку.
- Привить UCC клетки, подготовленные в шаге 6.9 мочевого пузыря с помощью ангиокатетера(Рисунок 1Aa,Ab).
- Настройка монополярной электрокаутерной машины и установить на мощность 4 W. Lubricate 24 G стерильный ангиокатетер с смазкой желе и вставить через уретру женской мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшое сопротивление может ощущаться. Аккуратно нажмите вперед или удалить ангиокатетер и повторить. Не заставляйте. Если катетер изгибается при входе, вставьте стерильный направляющий провод (см. 7.2.2) на полпути в катетер, чтобы обеспечить стабильность. - Полностью вставьте 0,025 " фиксированной основной прямой провод направляющий 1 мм мимо конца ангиокатетера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проволока помечена лентой перед процедурой, чтобы указать точку остановки 1 мм и обеспечить последовательность. - Держите монополярный штифт на направляющий провод в течение 1 с, что позволяет электрическое раздражение слизистой оболочки мочевого пузыря.
- Прикрепите свежий стерильный ангиокатер на 1 куб-лок шприц и составить 200 л собранных клеток со ступени 6.9.
ПРИМЕЧАНИЕ: По крайней мере, 100 л теряется от ангиокатетера до шприца. Компенсировать объем потерь при расчете объема необходимой подвески клеток. - Удалите направляющий провод и ангиокатетер из мочеиспускательной уретры мыши. Вставьте ангиокатетер со шприцем клеток, прикрепленных в мочеиспускательный уретру.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продвижение должно быть проще, чем раньше. - Привить 50 л клеток в мышеловочный пузырь. Подождите несколько секунд, прежде чем удалить анджокатер, чтобы клетки придерживаться стенки мочевого пузыря.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки остаются в мочевом пузыре и развиваются в первичную опухоль.
- Настройка монополярной электрокаутерной машины и установить на мощность 4 W. Lubricate 24 G стерильный ангиокатетер с смазкой желе и вставить через уретру женской мыши.
- Удалите мышь из изофруранового носового конуса и заземляющей площадки. Наблюдайте мышь в течение 1 ч следующей процедуры. Ищите признаки бедствия, т.е. сгорбившись назад, затрудненное дыхание и т.д.
8. модель мыши CRC
- Анестезия от шести до восьми недель мужчина NOD / SCID мыши с изофлуран (2,5% в 100% кислорода, 1 л / мин) в индукционной камере. Подтвердите успокоите с щепоткой.
- Поместите анестезирующую мышь в положение на спине под рассекающим микроскопом, убедившись, что они закрепят свою мруя к изофларанному носекону и защитите свои передние конечности лентой для стабильности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лупы могут быть использованы вместо расчленяющего микроскопа. Небольшой объект может быть использован для улучшения видимости и угла при размещении под основанием хвоста, поднимая анус. Как правило, небольшие участки марли сворачиваются в цилиндровую форму диаметром 1 дюйм. - Упья анальный канал с изогнутыми смазочными тупыми наконечниками щипцы подвергать дистальной анальной и ректальной слизистой оболочки. Удалите фекалии.
- Используйте стерильную 30 G съемной иглы на 50 л стеклянный шприц, чтобы ввести 10 л опухоли и HK клеток (от шага 6.9) в дистальной задней ректальной субмукозы 1 до 2 мм над анальным каналом. Скобы иглы должны быть покрыты слизистой оболочкой. Будьте осторожны, чтобы не пройти в тазовой полости.
- Удалите мышь из изолюранового носового конуса. Наблюдайте мышь в течение 1 ч следующей процедуры. Ищите признаки бедствия, т.е. сгорбившись назад, затрудненное дыхание и т.д.
9. Биолюминесцентная визуализация
- Мониторинг первичной опухоли, печени и легких метастатического бремени еженедельно с помощью биолюминесцентной системы визуализации для люциферазы деятельности.
- Получить мышь из UCC или CRC эксперимент и взвешивать. Введите 150 мг/кг люциферина интраперитоневого и ждать 5 минут для субстрата циркулировать в теле мыши.
- Анестезируйская мышь с 2,5% изофлуран омовением в 100% кислороде, 1 л/мин в индукционной камере.
- Поместите мышь в машину BLI Imaging с носом, закрепленным в носеконе. При разоблачении для изображения, убедитесь, что область интереса сталкивается с камерой. Для инъекций UCC и CRC, брюшная сторона должна смотреть на камеру для каждого изображения. Изображение мыши в положении на спине.
10. Сбор органов и опухоли
- Когда первичное сияние люминесценции опухоли достигает 1 х 1011 фотонов или если мыши проявляют признаки бедствия (т.е. потеря веса, сгорбившись назад, суровое/трудиться дыхание и т.д.), эвтаназии мышей с помощью вдыхания CO2 (как в шаге 5.2.1) после люциферина инъекции и визуализации всего тела.
- Удалить печень и легкие, место в чашку Петри и изображение для выявления любых метастазах. Удалить опухоль, взвесить и изображение. Исправить органы и опухоли в 10% нейтральный буферный формалин для 48 ч при температуре окружающей среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите / протрите ножницами и щипками между каждым органом, чтобы избежать передачи ткани.
11. Гистологическая оценка
- Встраивайте формалин фиксированными тканями в парафин и нарезайте ткани толщиной 5 мкм на микротоме для гематоксилина и эозина (Н и Е) и иммуногистохимического (IHC) окрашивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все Н И E окрашивание парафина слайды было сделано в лаборатории патологии Ochsner системы здравоохранения, и все IHC окрашивания в этой работе была выполнена в исследовательской лаборатории Системы здравоохранения Ochsner после высокотемпературных антигенов поиска с помощью Ki67 и цитокератин 20 антител, а затем биотинилаповые вторичные антитела, и авидуин-биотин-пероксидаза комплексов в соответствии с инструкциями производителя13,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В модели UCC PDOX, Клетки BlCaPt15 или BlCaPt37 пациентов UCC были внутривилистически (IB) привиты в присутствии клеток HK в женский МООН/SCID мышиный мочевой пузырь(рисунок 1A). Двадцать пять из тридцати (83,3%) животные генерировали первичные опухоли и отображали зависящий от времени первичный рост опухоли на основе еженедельного BLI(рисунок 1B,C и Таблица 1). Аналогичным образом, в модели CRC PDOX 31 из 32 (96,9%) мышей вырос первичной опухоли, когда внутри-ректально (ИК) вводили с пациентами CoCaPt155 или CoCaPt302 клеток плюс HK клеток(Рисунок 1D-F и таблица 1). В зависимости от опухоли пациента, рост опухоли мыши имел другой период задержки, что отражает разницу в клинических характеристиках пациента(рисунок 1C, F).
В обоих IB и ИК-моделей, инъекции опухолевых клеток не только генерируется ортотопические первичные опухоли(Рисунок 2A, B, синие стрелки), но многие мыши испытания также разработали печени и / или легких метастазов. В 10 из 30 (33,3%) и 17 из 32 (53,1%) мышей, привитых клетками UCC и CRC с клетками HK, соответственно, мы обнаружили отдаленные метастазы органа через ex vivo BLI(Рисунок 2A,B и Таблица 1).
Для подтверждения подобной морфологии тканей, H и E и IHC окрашивания были выполнены сравнения ксенотрансплантатов и первичных опухолей пациента. Гистопатология рака мочевого пузыря пациента поддерживалась в ксенотрансплантатах от BlCaPt15 и BlCaPt37(рисунок 3A). Результаты показывают, ксенотрансвтат опухоли, соответствующие мышечной инвазивной модели роста первичных опухолей пациентов. Антитела, характерные для маркера пролиферации клеток человека Ki67, использовались в IHC. Положительное ядерное окрашивание Ki67 указывает на высокопроникативные, быстрорастущие опухолевые клетки человека. Результаты окрашивания от ксенотрансплантатов были аналогичны исходным хирургическим биопсиям. Аналогичным образом, в иК-модели окрашивание Н и E указывает на сходство архитектуры между ксенотрансплантатами и опухолями пациентов как CoCaPt155, так и CoCaPt302. IHC с использованием антител против цитокератина 20 также показали аналогичную картину роста опухоли в обеих моделях PDOX(Рисунок 3B). Таким образом, наша модель PDOX резюмировала клиническую прогрессию пациента UCC и CRC.
Рисунок 1: ортотопические модели мыши UCC и CRC. (A-C) Внутривезикл (IB) закапывание клеток UCC в мышеловочный пузырь13. (Аа) Ангиокатетер был вставлен в мочевой пузырь женщины NOD / SCID мыши и электрокаутерный шок был нанесен на стенку мочевого пузыря через направляющий провод. (Аб) Luciferase помечены UCC опухолевых клеток, BlCaPt15 (2 х 104 клетки), или BlCaPt37 (5 х 105 клеток) с добавлением 3 х 105 LN стромальных hK клеток, были внушены в NOD / SCID мыши мочевого пузыря через ангиокатетер. (D-F) Внутриректальное (ИК) инъекция клеток CRC в подмукозный слой ткани прямой кишкимыши 17. (D) Анальный канал был расширен с смазкой тупыми наконечниками щипцы, чтобы обеспечить доступ к дистальной анальной и ректальной слизистой оболочки и 30 G иглы был вставлен в дистальный задний ректальный submucosa 1'2 мм над анальным каналом, пока сбелине не был покрыт до инъекция происходит. Люцифераза помечены CRC опухолевых клеток, CoCaPt155 (5 х 105 клеток), или CoCaPt302 (1 х 104 клетки) с добавлением 3 х 105 HK клеток были введены. Опухолевое бремя отслеживалось и оценивалось с помощью биолюминесцентной визуализации (BLI; B и E). Рост опухоли luciferase помечены UCC или CRC клетки отслеживаются кинетически через BLI и проанализированы с помощью программного обеспечения анализа изображений (C и F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Модели PDOX производят спонтанные отдаленные метастазы органов. Представитель мышей (верхние панели) из тех же экспериментов, как в Рисунке 1, например, привили внутри-vesically с люциферазы помечены UCC опухолевых клеток, BlCaPt15 или BlCaPt37 клеток с HK клеток (A) или внутри-ректально с luciferase помечены опухоли CRC клетки, CoCaPt155 или CoCaPt302 клетки с HK клетки (B) показаны. желтые стрелкиуказывают на мышеловачный пузырь (A ). Фотографии, сделанные во время жертвоприношения, указывают на ортотопические образования опухолей (синие стрелки). Печень, легкие и опухоли (средние панели), собранные при некропсии и их ex vivo BLI (нижние панели) показали метастазы печени и легких, а также опухоли с активностью люциферазы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Опухоли ксенотрансплантата напоминают опухоли предимплантации пациента. Парафин встроенных опухолевых тканей из опухоли пациента или опухолей, собранных у мышей в тех же экспериментов, как в Рисунке 1 были разделены и окрашенные Н И Е (A и B) или IHC с антителами против человека Ki67 (A) или цитокератин 20 (CK20; B). Коричневый цвет указывает на положительное окрашивание. Н И окрашивание показывает опухолевые гнезда рассекается в гладкие мышечные пучки (A). Фотографии были сделаны с помощью цифрового деконволутирующего микроскопа и проанализированы с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Шкала баров: 100 мкм. Все изображения были сделаны в оригинальном увеличении на 200 ". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Опухолевый имплантат (%) | Метастазирования легких и печени (%) | Смертность (%) | |
| UCC, n'30 | 83,3 | 33.3.2.2.2.2.2 | 0.00 |
| CRC, n'32 | 96,9 | 53.1 | 0.00 |
Таблица 1: Резюме образования опухолей, метастаз и смертности в IB и ИК-моделях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метастатическое заболевание является причиной большинства случаев смерти больных раком. В доклинических терапевтических тестах крайне важно установить модели мыши, которые наиболее точно эмулируют рост опухоли человека спонтанными дистанционными метастазами органов. Использование моделям мурин с имплантированной опухоли пациента производных раковых клеток (xenografts) позволяет лучше понять биологии опухоли и прогностических биомаркеров, а также тестирование и прогнозирование антинеопластических эффектов новых методов лечения18. Многие модели были использованы, чтобы показать UCC и CRC метастаз в экспериментах murine, таких как внутривенные инъекции хвостовой вены, показывающие способность производить болезни легких19 или подкожной имплантации опухолевых клеток или фрагментов опухоли в фланг для локализованный рост опухоли20,21. Одна лаборатория ранее сообщила мочевого рака мурина модель с помощью соляной кислоты лечения успешно содействовать поглощения опухоли22. Хотя эти методы производят надежный локальный рост и могут продемонстрировать некоторые метастатические действия, они специально не напоминают естественное течение рака, разработанных у людей и не используют метастатического механизма видели у пациентов18, 23. Другие модели мурин, как сообщается, имитировать рост опухоли путем введения опухолевых клеток непосредственно в органы, такие как печень или мезонтерии, но они несут риски утечки опухолевых клеток и не производят значительные метастаза.
Ранее мы продемонстрировали корреляцию между содержанием раковых клеток в первичной опухоли и LN участие24 и роль раковых клеток / LN стромального взаимодействия в ходе первичной прогрессии опухоли метастатического заболевания10 , 12 Лет , 17. Включая нашу предыдущую работу о влиянии стромальной микросреды LN в метастатической прогрессии, мы установили ортотопические модели (особенно модели PDOX), которые имитируют естественный ход метастатического распространения, являются технически воспроизводимый, сохранить неоднородность оригинальных опухолей пациента, и генерировать последовательные первичные опухоли и метастатические результаты12,13,17. Использование опухолевых эффектов Стромальной микросреды LN имеет важное значение, поскольку она обеспечивает аналогичную микроокружение опухоли в человеческих UCC и CRC, развивает все шаги в метастатическом каскаде, уменьшает количество раковых клеток, необходимых в модели мыши, которая сводит к минимуму количество ксенотрансвтатных проходов, и приводит к надежной модели, которая тесно имитирует рост опухоли и метастазов в человеке.
Мы создали уникальный метод электростимуляции IB с использованием совместного внушения клеток HK, который производит надежную модель для разработки MIUCC. Наша модель имитирует естественный ход прогрессирования UCC путем имплантации опухоли, начиная с слизистой оболочки, что приводит к мышечной, а затем метастазирование в легкие13.
Наши результаты также показывают, что ИК-модель безопасна, воспроизводима и успешна. Ортотопическая модель мыши CRC имеет первичный рост опухоли и спонтанные отдаленные метастазы12,17. ИК-процедура быстрая, легкая в освоении, технически проста в исполнении и не слишком напряженная на животных. Группы IB и IR имели нулевую смертность(таблица 1) в послеоперационном периоде до окончательного измерения BLI. Тем не менее, техника требует практики. Если внутриректальная инъекция успешно, не должно быть видимых "пузырь", который образуется, как жидкость вводится в ректальной субмукозы и приведет к первичному росту опухоли, которая в конечном итоге станет ощутимым, как показано на рисунке 1. Если опухоль была введена слишком глубоко в тазовой полости, она будет не привязана к колоректального тракта и растет очень большой, чтобы заполнить таз, иногда вызывая обструкцию. Если инъекция слишком мелкой или не входит в ректальный подмукозный слой на всех, она будет утечка в результате сокращения или отсутствия первичной опухоли бремя.
Мы создали уникальные, воспроизводимые модели PDOX для человека HG-UCC и CRC. Эти модели позволяют для формирования опухоли и метастазических исследований. Теперь мы можем использовать эти модели в качестве основного метода для дальнейшего изучения стромальной микросреды LN и ее взаимодействия с первичными опухолями пациента. Эти модели также позволят нам исследовать методы лечения, которые мешают про-опухолевого воздействия LNSC на первичной опухоли. С помощью этих моделей тестирование новых терапевтических препаратов может быть выполнено эффективно и в клинически-миметических манерах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Это исследование было частично поддержано Ochsner Translational Medicine Research Initiative Grant 2014. Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят Брайана Ройтера, Даниэль Бертони, Питера Миллера и Шеннона Маккесни, которые помогли начать эти исследования за отличную техническую поддержку. Авторы также благодарят Хизер Грин Матрана, Маргарет Вариано, Сунила Талвара и Марию Латис за помощь в согласовании пациентов и предоставлении опухолевых образцов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Avidin-biotin-peroxidase | Vector Labs Inc | PK-6100 | |
| Biotinylated secondary antibody | Vector Labs Inc | BA-1000 | |
| Collagenase IV (1.5 mg/mL) | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) | Sigma | D4263 | |
| D-Luciferin (150 mg/kg) | Perkin Elmer | 122796 | |
| Formalin (10% neutral buffered) | Leica | 46129 | |
| glutamine (2 nM) | Fisher Scientific | 35050061 | |
| Hair Removal Cream | Church & Dwight Co., Inc | 1 (800) 248-8820 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | SH30016.02 | |
| Hyaluronidase (20 mg/mL) | Sigma | H3884 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 108333 | |
| Luc/RFP-lentivirus | From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018). | ||
| McCoy’s medium | Life Technologies | 110862 | |
| penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL) | Fisher Scientific | 15140-122 | |
| RPMI-1640 Medium | American Type Culture Collection | 110636 | |
| Trypan Blue | Sigma | T6146 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas | |||
| 100% Oxygen | Airgas Inc | OX USP200 | |
| 100% CO2 | Airgas Inc | CD USPE | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (male) | Jackson Lab | 001303 | |
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (female) | Jackson Lab | 001303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Hematoxylin | Sigma | GHS232 | |
| Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody | Thermo Scientific | RM-9106-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools | |||
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 100 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 15 mL Conical Tube | Sarstedt | 11799 | |
| 50 mL Conical tube | Sarstedt | 15762 | |
| 150 mm Tissue Culture Dish | USA Scientific Inc | CC7682-3614 | |
| 96 Well plate | USA Scientific Inc | CC7682-7596 | |
| Forceps | Symmetry Surgical Inc | 06-0011 | |
| Surgical scissors | Symmetry Surgical Inc | 02-2011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5% CO2 humidified incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| Bioluminescent (BLI) Imaging Machine | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| BLI Imaging Machine Software | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Centrifuge | Beckman | 366830 | |
| Deconvoluting Microscope | Intelligent Imaging Innovations | Marianas | |
| Deconvoluting Microscope Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | +1 (303) 607-9429 x1 | |
| Digital caliper | Fowler Tools and Instruments | 54-115-330 | |
| Dissecting microscope | Precision Instruments LLC | (504) 228-0076 | |
| Electrosurgical generator | ValleyLab | FORCE1C20 | |
| Isoflurane Induction Chamber | Perkin Elmer | 119038 | |
| Microtome | American Optical Corporation | 829 | |
| Pipet Aid | Fisher Healthcare | 13-681-15E | |
| Serological pipet (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.001 |
References
- Sundlisaeter, E., et al. Lymphangiogenesis in colorectal cancer--prognostic and therapeutic aspects. International Journal of Cancer. Journal international du cancer. 121, 1401-1409 (2007).
- Gout, S., Huot, J. Role of cancer microenvironment in metastasis: focus on colon cancer. Cancer Microenvironment. 1, 69-83 (2008).
- National Cancer Institute. SEER Stat Fact Sheets: Bladder Cancer. , Available from: http://seer.cancer.gov/statfacts/html/urinb.html (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 68, 7-30 (2018).
- Hautmann, R. E., de Petriconi, R. C., Pfeiffer, C., Volkmer, B. G. Radical cystectomy for urothelial carcinoma of the bladder without neoadjuvant or adjuvant therapy: long-term results in 1100 patients. European Urology. 61, 1039-1047 (2012).
- Stein, J. P., et al. Radical cystectomy in the treatment of invasive bladder cancer: long-term results in 1,054 patients. Journal of Clinical Oncology. 19, 666-675 (2001).
- Lerner, S. P., et al. The rationale for en bloc pelvic lymph node dissection for bladder cancer patients with nodal metastases: long-term results. The Journal of Urology. 149, discussion 764-755 758-764 (1993).
- Poulsen, A. L., Horn, T., Steven, K. Radical cystectomy: extending the limits of pelvic lymph node dissection improves survival for patients with bladder cancer confined to the bladder wall. The Journal of Urology. 160, 2015-2019 (2020).
- National Cancer Institute. SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. , Available from: http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html (2017).
- Margolin, D. A., et al. Lymph node stromal cells enhance drug-resistant colon cancer cell tumor formation through SDF-1alpha/CXCR4 paracrine signaling. Neoplasia. 13, 874-886 (2011).
- Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12, 468-476 (2010).
- Margolin, D. A., et al. The critical roles of tumor-initiating cells and the lymph node stromal microenvironment in human colorectal cancer extranodal metastasis using a unique humanized orthotopic mouse model. FASEB Journal. 29, 3571-3581 (2015).
- Gills, J., et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729 (2018).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy. Oncotarget. 7, 71696-71702 (2016).
- Kim, H. S., Zhang, X., Klyushnenkova, E., Choi, Y. S. Stimulation of germinal center B lymphocyte proliferation by an FDC-like cell line, HK. The Journal of Immunology. 155, 1101-1109 (1995).
- Hite, N., et al. An Optimal Orthotopic Mouse Model for Human Colorectal Cancer Primary Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Diseases of the Colon and Rectum. 61, 698-705 (2018).
- Jager, W., et al. Ultrasound-guided intramural inoculation of orthotopic bladder cancer xenografts: a novel high-precision approach. PloS One. 8, e59536 (2013).
- Schirner, M., et al. Integrin alpha5beta1: a potent inhibitor of experimental lung metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 16, 427-435 (1998).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445, 111-115 (2007).
- Todaro, M., et al. Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Cell. 1, 389-402 (2007).
- Lee, J. S., et al. Tumor establishment features of orthotopic murine bladder cancer models. Korean Journal of Urology. 53, 396-400 (2012).
- Hadaschik, B. A., et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
- Silinsky, J., et al. CD 133+ and CXCR4+ colon cancer cells as a marker for lymph node metastasis. The Journal of Surgical Research. 185, 113-118 (2013).
