इन विट्रो माइक्रोन्यूक्लियस परख जीनोटॉक्सिसिटी और साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है, लेकिन मैनुअल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके परख स्कोरिंग कठिन है और विषयपरकता और अंतर-स्कोर परिवर्तनशीलता से ग्रस्त है। यह कागज बहुस्पेक्ट्रल इमेजिंग प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके परख का एक पूर्ण स्वचालित संस्करण करने के लिए विकसित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।
इन विट्रो माइक्रोन्यूक्लियस (MN) परख अक्सर cytotoxicity और जीनोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन मैनुअल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से परख स्कोरिंग कठिन है और स्कोरर के बीच परिवर्तनशीलता के कारण परिणामों में अनिश्चितता का परिचय. इसे ठीक करने के लिए, स्कोरर पूर्वाग्रह को दूर करने और थ्रूपुट में सुधार करने के प्रयास में स्वचालित स्लाइड-स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के साथ-साथ पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री विधियों को पेश किया गया है। हालांकि, इन विधियों की अपनी अंतर्निहित सीमाएं हैं जैसे सेल के कोशिकाद्रव्य की कल्पना करने में असमर्थता और प्रवाह साइटोमेट्री के साथ दृश्य MN सत्यापन या छवि डेटा संग्रहण की कमी। मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री (एमआईएफसी) में इन सीमाओं को दूर करने की क्षमता है। MIFC सांख्यिकीय मजबूती और पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री की गति के साथ माइक्रोस्कोपी के उच्च संकल्प फ्लोरोसेंट कल्पना को जोड़ती है। इसके अतिरिक्त, सभी संग्रहीत इमेजरी को खुराक-विशिष्ट फ़ाइलों में संग्रहीत किया जा सकता है. यह काग़ज़ MIFC पर MN परख का एक पूरी तरह से स्वचालित संस्करण करने के लिए विकसित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। मानव लिम्फोब्लास्टोबाइड TK6 कोशिकाओं एक hypotonic समाधान (75 एमएम KCl) का उपयोग कर बढ़े थे, 4% formalin के साथ तय की और परमाणु सामग्री Hoechst 33342 के साथ दाग था. सभी नमूने MIFC पर निलंबन में चला रहे थे, परख के लिए आवश्यक सभी प्रमुख घटनाओं के उच्च संकल्प छवियों के अधिग्रहण की अनुमति (जैसे binucleated कोशिकाओं के साथ और एमएन के बिना के रूप में के रूप में अच्छी तरह से mononucleated और polynucleated कोशिकाओं). छवियाँ स्वचालित रूप से पहचान की गई, वर्गीकृत और MIFC डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में गणना, दोनों cytotoxicity और genotoxicity के स्वचालित स्कोरिंग के लिए अनुमति देता है. परिणाम प्रदर्शित करता है कि MIFC का उपयोग करने में इन विट्रो MN परख प्रदर्शन करने के लिए सांख्यिकीय महत्वपूर्ण वृद्धि की अनुमति देता है MN आवृत्ति में cytotoxicity के कई विभिन्न स्तरों पर पता लगाया जा करने के लिए जब विलायक नियंत्रण TK6 कोशिकाओं के जोखिम के बाद की तुलना में Mitomycin सी और Colchicine, और है कि MN आवृत्ति में कोई महत्वपूर्ण वृद्धि मैनिटॉल के संपर्क के बाद मनाया जाता है.
इन विट्रो माइक्रोन्यूक्लियस (MN) परख एक आमतौर पर इस्तेमाल किया परीक्षण के लिए इस तरह के रासायनिक और दवा के विकास के रूप में अध्ययन के कई क्षेत्रों में एक स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में cytotoxicity और जीनोटॉक्सिसिटी का आकलन करने के लिए के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विभिन्न व्यक्तियों के संपर्क में मानव biomonitoring है पर्यावरण, व्यावसायिक या जीवन शैली कारक1,2,3. एम.एन. में कोशिका विभाजन के दौरान उत्पन्न गुणसूत्र के टुकड़े या संपूर्ण गुणसूत्र होते हैं जो दो मुख्य पुत्री नाभिकों में से किसी एक में समाविष् ट नहीं होते हैं। टेलोफेज के बाद, यह गुणसूत्र सामग्री कोशिका द्रव्य के अंदर एक व्यक्ति, गोल शरीर में होती है जो मुख्य नाभिक2में से किसी से अलग होती है। इसलिए, MN डीएनए क्षति के प्रतिनिधि हैं और जीनोटॉक्सिसिटी परीक्षण4में एक समापन बिंदु के रूप में कई वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया है। MN को मापने के लिए सबसे उपयुक्त विधि साइटोकिनेसिस-ब्लॉक माइक्रोन्यूक्लियस (सीबीएमएन) परख है। CBMN परख का उपयोग करना, binucleated कोशिकाओं में MN की आवृत्ति (BNCs) नमूने में Cytochalasin बी (Cyt-B) को शामिल करके रन बनाए जा सकते हैं. Cyt-B परमाणु विभाजन की अनुमति देता है, लेकिन सेलुलर विभाजन को रोकता है और इस प्रकार, MN के स्कोरिंग BNCs है कि केवल एक बार5विभाजित किया है करने के लिए प्रतिबंधित करता है.
माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री दोनों का उपयोग करने वाले प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं और उन्हें मान्य किया गया है और इन विट्रो एम एन परख6,7,8,9 ,10, 11,12,13,14. माइक्रोस्कोपी लाभ नेत्रहीन पुष्टि करने में सक्षम होने से कि MN वैध हैं, लेकिन समय लगता है और स्कोरर15के बीच परिवर्तनशीलता के लिए प्रवण है. इसका समाधान करने के लिए, स्लाइडकोस्कैन को स्कैन करने और नाभिक ों की छवियों को कैप्चर करने के लिए स्वचालित माइक्रोस्कोपी विधियों को विकसित किया गया था ,17,18,19, लेकिन कोशिकाद्रव्य की कल्पना नहीं की जा सकती है, जिससे इसे बनाया जा सकता है यह निर्धारित करना कठिन है कि क्या कोई MN वास्तव में किसी विशिष्ट कक्ष से संबद्ध है. इसके अलावा, इन विधियों में पॉलीन्यूक्लिएट (पाली) कोशिकाओं (त्रि-तथा चतुष्कोणीय कोशिकाओं सहित) की पहचान करने में कठिनाई होती है जो साइट-बी9का उपयोग करते समय साइटोटॉक्सिसिटी की गणना के लिए आवश्यक होती हैं। एम एन परख करने के लिए विकसित प्रवाह साइटोमेट्री विधियों में फ्लोरोसेंट के साथ-साथ आगे और साइड स्कैटर तीव्रता को रोजगार दिया जाता है ताकि न्यूक्लियस और एमएन दोनों की आबादी की पहचान की जा सके जिन्हें लाइसिस20,21 के बाद सेल से मुक्त किया गया है। ,22. यह डेटा कुछ ही मिनटों में कई हजार कोशिकाओं से प्राप्त किया जा करने के लिए अनुमति देता है और स्वचालित विश्लेषण23परमिट; हालांकि, कोशिकाओं कल्पना करने में असमर्थता यह असंभव है कि रन बनाए घटनाओं वास्तविक हैं की पुष्टि करने के लिए बनाता है. इसके अतिरिक्त, कोशिका झिल्ली lysing Cyt-B के उपयोग को रोकता है और साथ ही एक निलंबन है कि इस तरह के गुणसूत्र समुच्चय या apoptotic निकायों के रूप में अन्य मलबे शामिल है बनाने और MN24से इन अंतर करने के लिए कोई रास्ता नहीं है.
इन सीमाओं के प्रकाश में, Multispectral इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री (MIFC) MN परख प्रदर्शन करने के लिए एक आदर्श प्रणाली है क्योंकि यह सांख्यिकीय मजबूती और पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री की गति के साथ माइक्रोस्कोपी के उच्च संकल्प फ्लोरोसेंट कल्पना को जोड़ती है. MIFC में, सभी कोशिकाओं को एक fluidics प्रणाली में पेश कर रहे हैं और फिर hydrodynamicly एक प्रवाह सेल cuvette के केंद्र में ध्यान केंद्रित कर रहे हैं. सभी कोशिकाओं के Orthogonal रोशनी एक brightfield के उपयोग के माध्यम से पूरा किया है (BF) प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी), एक पक्ष तितर बितर लेजर और (कम से कम) एक फ्लोरोसेंट लेजर. फ्लोरोसेंट फोटॉनों तीन में से एक (20x, 40x या 60x) उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य लेंस द्वारा कब्जा कर रहे हैं और फिर एक वर्णक्रमीय अपघटन तत्व के माध्यम से गुजरती हैं. फोटॉनों तो प्रवाह सेल के माध्यम से पारित है कि सभी कोशिकाओं के उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए एक चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरे पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। धुंधला या लकीर से बचने के लिए, सीसीडी समय देरी एकीकरण (TDI) मोड जो पंक्ति से पिक्सेल सामग्री को प्रवाह में सेल के वेग के साथ सिंक्रोनी में सीसीडी नीचे पंक्ति को स्थानांतरित करके पटरियों में चल रही है. पिक्सेल जानकारी तो पिक्सेल की अंतिम पंक्ति से एकत्र की है. TDI इमेजिंग वर्णक्रमीय अपघटन के साथ संयुक्त अप करने के लिए अनुमति देता है 12 छवियों (2 BF, 10 फ्लोरोसेंट) प्रवाह सेल के माध्यम से गुजर सभी कोशिकाओं से एक साथ कब्जा कर लिया. सभी पर कब्जा कर लिया इमेजरी नमूना-विशिष्ट डेटा फ़ाइलों में संग्रहीत की जाती है, जिससे एमआईएफसी डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके किसी भी समय विश्लेषण करने की अनुमति दी जाती है. अंत में, डेटा फ़ाइलें सभी द्विचर भूखंडों पर सेलुलर छवियों और डॉट्स के बीच लिंक बनाए रखने. इसका मतलब यह है कि एक पारंपरिक द्विचर साजिश पर किसी भी डॉट पर प्रकाश डाला जा सकता है और इसकी इसी BF और फ्लोरोसेंट कल्पना25प्रदर्शित किया जाएगा .
हाल ही में, MIFC आधारित तरीकों दोनों triage विकिरण biodosimetry26,27,28,29,30,31 और आनुवंशिक के लिए MN परख प्रदर्शन करने के लिए विकसित किया गया है विष विज्ञान32,33 परीक्षण. इस कार्य से यह पता चला है कि मुख्य नाभिक, एम एन और कोशिकाद्रव्य की कोशिकीय छवियों को अन्य विधियोंकीतुलना में अधिक थ्रूपुट के साथ छविित किया जा सकता है। विश्लेषण के लिए आवश्यक सभी सेल प्रकार, MONO कोशिकाओं सहित, BNCs (के साथ और MN के बिना), और POLY कोशिकाओं, स्वचालित रूप से MIFC डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में पहचाना जा सकता है, और Fenech एट अल द्वारा विकसित स्कोरिंग मापदंड के कार्यान्वयन के माध्यम से पूरा किया है विभिन्न गणितीय एल्गोरिदम6,34का उपयोग करें। बायोडोसिमेट्री के परिणामों से पता चला है कि खुराक अनुक्रिया अंशांकन वक्र साहित्य में अन्य स्वचालित विधियों से प्राप्त किए गए वक्रों के परिमाण में समान थे जब बी एन सी29प्रति एम एन की दर की मात्रा निर्धारित की गई थी . इसके अतिरिक्त, toxicology में हाल ही में काम से पता चला है कि MONO कोशिकाओं की छवियों, BNCs (के साथ और MN के बिना) और POLY कोशिकाओं को स्वचालित रूप से कब्जा कर लिया जा सकता है, की पहचान की, वर्गीकृत और MIFC का उपयोग कर गणना. प्रोटोकॉल और डेटा विश्लेषण ने टी के 6 कोशिकाओं को कई क्लैस्टोजन और एन्युजेन्स32में उजागर करने के बाद साइटोटॉक्सिसिटी और जीनोटॉक्सिसिटी की गणना को सक्षम किया .
इस पत्र में प्रस्तुत प्रोटोकॉल MIFC का उपयोग करइन विट्रो MN परख करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। इस काम में इस्तेमाल नमूना प्रसंस्करण तकनीक एक एकल नमूना प्रक्रिया करने के लिए कम से कम 2 एच की आवश्यकता है और अपेक्षाकृत अन्य तरीकों की तुलना में प्रदर्शन करने के लिए आसान है। MIFC विश्लेषण सॉफ्टवेयर में डेटा विश्लेषण जटिल है, लेकिन विश्लेषण टेम्पलेट का निर्माण इस कागज में उल्लिखित चरणों का पालन कुछ ही घंटों में पूरा किया जा सकता है. इसके अलावा, एक बार टेम्पलेट बनाया गया है, यह स्वचालित रूप से किसी भी आगे के काम के बिना सभी एकत्र डेटा के लिए लागू किया जा सकता है। प्रोटोकॉल Clastogens और aneugens के लिए TK6 कोशिकाओं को बेनकाब करने के लिए आवश्यक सभी चरणों की रूपरेखा, संस्कृति, प्रक्रिया और कोशिकाओं को दाग करने के लिए कैसे का वर्णन करता है, और दर्शाता है कि कैसे उच्च संकल्प कल्पना MIFC का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए. इसके अलावा, इस कागज MIFC सॉफ्टवेयर में डेटा का विश्लेषण करने के लिए स्वचालित रूप से पहचान और MONO कोशिकाओं, BNCs, और POLY कोशिकाओं दोनों cytotoxicity और जीनोटॉक्सिसिटी की गणना के प्रयोजनों के लिए स्कोर करने के लिए वर्तमान सर्वोत्तम प्रथाओं दिखाता है.
हाल ही में एक प्रकाशन में वर्मा एट अल एक प्रणाली है कि डेटा और छवि विश्लेषण35के छवि भंडारण लाभ के साथ प्रवाह साइटोमेट्री के उच्च थ्रूपुट लाभ को जोड़ती है विकसित करने के महत्व को रेखांकित किया. इस पत्र में वर्णित इन विट्रो एम एन परख में एमआईएफसी इस उद्धरण को हल करता है और माइक्रोस्कोपी और प्रवाह साइटोमेट्री विधियों में ऊपर उल्लिखित कई चुनौतियों को दूर करने की क्षमता है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल दर्शाता है कि दोनों cytotoxicity और genotoxicity MIFC का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है. नमूना तैयारी, सेलुलर धुंधला और डेटा संग्रह सीधा कर रहे हैं, लेकिन वहाँ प्रोटोकॉल है कि हमेशा लागू किया जाना चाहिए में कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं. कोशिकाओं में पोटेशियम क्लोराइड (केसीएल) के अलावा कोशिकाओं को प्रफुल्लित करने के लिए महत्वपूर्ण है, मुख्य नाभिक के बीच जुदाई पैदा. यह सुनिश्चित करता है कि मास्किंग एल्गोरिथ्म BNCs और पाली कोशिकाओं (पाली कोशिकाओं) जो उनके गणना के लिए आवश्यक है में सभी व्यक्तिगत नाभिक की पहचान कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, केसीएल नाभिक और एमएन के बीच पृथक्करण प्रदान करता है, जो सटीक एमएन मास्किंग और परिमाणीकरण के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, केसीएल के अलावा के बाद Formalin का उपयोग centrifugation के दौरान lysing से कोशिकाओं को रोकता है. Cytochalasin बी के अलावा TK6 कोशिकाओं है कि एक से अधिक परमाणु विभाजन आया है काफी बड़ी होने का कारण बनता है. एक परिणाम के रूप में, कोशिका द्रव्य नाजुक हो जाता है और lyse कर सकते हैं अगर centrifugation के तुरंत बाद KCl के अलावा किया जाता है. इसके अलावा, यह नमूने में कोशिकाओं की संख्या के अनुसार नमूना करने के लिए Hoechst परिचय और एक अंतिम एकाग्रता के अनुसार नहीं बहुत महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, Hoechst के 10 g/mL की एक अंतिम एकाग्रता समान रूप से 1 x 106 कोशिकाओं का एक नमूना दाग होगा, लेकिन पर्याप्त रूप से एक नमूना युक्त दाग नहीं हो सकता है 5 x 106 कोशिकाओं और dimly दाग नाभिक के साथ कई कोशिकाओं में परिणाम कर सकते हैं, विश्लेषण मुश्किल बना रही है. यह भी ध्यान दें कि Hoechst ऐसे DAPI के रूप में एक और डीएनए डाई के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है अगर MIFC 405 एनएम उत्तेजना लेजर या DRAQ5 के साथ सुसज्जित है अगर MIFC 488 एनएम और / यदि परमाणु दाग को संशोधित करने, यह आवश्यक / वांछित लेजर शक्ति के लिए उपयुक्त एकाग्रता खोजने के लिए दाग titrate करने के लिए महत्वपूर्ण है।
MIFC पर डेटा एकत्रित करते समय यह ग्रेडिएंट RMS सुविधाओं के लिए इष्टतम क्षेत्र सीमाओं का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत सीमाओं MIFC उपकरणों के बीच कुछ मामूली बदलाव के कारण समायोजन की आवश्यकता हो सकती है. डेटा संग्रह के दौरान इस सुविधा का अनुप्रयोग यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि अत्यधिक केंद्रित इमेजरी कैप्चर की गई है. डेटा फ़ाइलों में कई धुंधला या uncentriced छवियों होते हैं, यह संभव है कि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में मास्किंग एल्गोरिदम गलत तरीके से धुंधला क्षेत्रों में धुंधला कलाकृतियों पर प्रकाश डाला जाएगा, झूठी सकारात्मक कलाकृतियों की एक उच्च संख्या के लिए अग्रणी MN के रूप में रन बनाए जा रहा है. हालांकि यहाँ वर्णित छवि प्रसंस्करण तकनीक मुश्किल हो सकता है, एक बार एक विश्लेषण टेम्पलेट MIFC सॉफ्टवेयर में विकसित किया गया है, बैच प्रसंस्करण डेटा फ़ाइलों के लिए स्वचालित रूप से विश्लेषण किया जा करने के लिए अनुमति देता है, उपयोगकर्ता हस्तक्षेप को नष्ट करने और इसलिए, स्कोरर पूर्वाग्रह. इसके अलावा, अगर TK6 कोशिकाओं के अलावा किसी अन्य सेल लाइन परख करने के लिए उपयोग किया जाता है, यह मास्क और क्षेत्र सीमाओं को संशोधित करने के लिए आवश्यक हो जाएगा के रूप में morphological गुण (जैसे, आकार) कोशिकाओं के TK6 कोशिकाओं के उन लोगों से अलग होगा.
यहाँ प्रस्तुत परिणाम (चित्र 5) एम एन प्रेरण में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाने के लिए जब Mitomycin सी और Colchicine की विभिन्न खुराक के लिए TK6 कोशिकाओं को उजागर. विलायक नियंत्रण की तुलना में एम एन की आवृत्ति में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि दोनों रसायनों में कई खुराकों के लिए मनाया गया. इसके अलावा, मैनिटॉल की कोई खुराक 30% से अधिक एक साइटोटॉक्सिसिटी प्रेरित, और न ही विलायक नियंत्रण की तुलना में एम एन की आवृत्ति में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि, जैसा कि उम्मीद थी। इन विट्रो MN परख प्रदर्शन करने के लिए MIFC का उपयोग कर इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल दोनों सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण रसायनों से अपेक्षित परिणाम देता है. एम एन की आवृत्ति के साथ-साथ साइटोकिनेसिस ब्लॉक प्रसार सूचकांक (सीबीपीआई) दोनों के आधारभूत मूल्यों को विकसित करने के लिए विलायक नियंत्रण और ऋणात्मक नियंत्रण रसायनों दोनों का उपयोग करके कई प्रयोग करना बहुत महत्वपूर्ण है। जनविषता के लिए, एम एन आवृत्ति में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि आधार रेखा एम एन आवृत्तियों जो सेल प्रकार का इस्तेमाल किया जा रहा के लिए अच्छी तरह से जाना जाना चाहिए की तुलना के माध्यम से निर्धारित कर रहे हैं. इसके अलावा सभी cytotoxicity गणना नियंत्रण नमूनों के सीबीपीआई पर आधारित हैं और इसलिए, मोनो, BNCs और POLY कोशिकाओं की आधारभूत दरों को नियंत्रण में अच्छी तरह से मात्रा निर्धारित किया जाना चाहिए।
एम एन परख के संदर्भ में एमआईएफसी के उपयोग की अनेकसीमाएं और लाभ पिछले कार्य 29,32में वर्णित किए गए हैं . मुख्य सीमाओं कम MN आवृत्तियों चिंता जब माइक्रोस्कोपी की तुलना में, जो शायद लचीलापन की कमी से दोनों का परिणाम है जब विश्लेषण सॉफ्टवेयर में स्कोरिंग मापदंड को लागू करने के साथ ही MIFC के क्षेत्र की सीमित गहराई. अच्छी तरह से समोच्च मास्क सही मुख्य नाभिक की पहचान करने के लिए बनाया जा सकता है, लेकिन MN कि छू रहे हैं (या बहुत करीब) मुख्य नाभिक BNC मुखौटा के भीतर कब्जा कर लिया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, बहुत छोटे MN कि बल्कि आसानी से माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर रन बनाए जा सकते हैं शायद गलत तरीके से याद कर रहे हैं जब MIFC का उपयोग कर MN मुखौटा के क्षेत्र पैरामीटर पर कम सीमा के कारण छोटे कलाकृतियों स्कोरिंग से बचने के लिए. छवि आधारित डेटा विश्लेषण में मौजूद कठिनाइयों के अलावा, इसके डिजाइन के कारण, MIFC तीन आयामी सेलुलर वस्तुओं के दो आयामी प्रक्षेपण छवियों को प्राप्त करता है. यह संभावना कुछ MN ध्यान की एक अलग गहराई पर कब्जा कर लिया है कि दो मुख्य MN, उन्हें बहुत मंद और un-scorable मास्किंग का उपयोग कर दिखाई देता है का कारण बनता है. इसके अलावा, MN का एक छोटा सा अंश दो मुख्य नाभिकों में से एक के पीछे रह सकता है, जिससे उन्हें कल्पना करना और स्कोर करना असंभव हो जाता है। इसलिए, इन कठिनाइयों पर विचार, सावधानी का उपयोग किया जाना चाहिए जब कम खुराक पर MN आवृत्ति में महत्वपूर्ण वृद्धि की व्याख्या.
इन कमियों के बावजूद, MIFC विधि यहाँ वर्णित अन्य तकनीकों पर कई लाभ प्रदान करता है. Fenech एट अल प्रस्तावित मानदंड और दिशा निर्देशों कि जब MN assays36के लिए स्वचालित प्रणाली और तरीकों के विकास पर विचार किया जाना चाहिए . ये शामिल हैं, लेकिन तक सीमित नहीं हैं, मुख्य नाभिक और कोशिका द्रव्य के प्रत्यक्ष दृश्य, रासायनिक या एजेंट की विभिन्न खुराक से एमएन की आवृत्ति का निर्धारण परीक्षण किया जा रहा है और आकृति विज्ञान की मात्रा और सभी की स्थिति निर्धारित करने की क्षमता नाभिक और MN सुनिश्चित करने के लिए वे कोशिका द्रव्य के भीतर हैं. इस पत्र से पता चलता है कि MIFC विधि इन विट्रो MN परख संतुष्ट करने के लिए विकसित (या संतुष्ट करने की क्षमता के पास) इन मानदंडों. विशेष रूप से, नाभिक और एमएन की छवियों फ्लोरोसेंट लेज़रों द्वारा कब्जा कर लिया जा सकता है, जबकि कोशिकाद्रव्यी कल्पना बीएफ एलईडी का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है. सामान्य परमाणु आकृति विज्ञान के साथ कोशिकाओं की छवि स्वचालित रूप से उन्नत मास्क और सुविधाओं का एक संयोजन का उपयोग अनियमित आकृति विज्ञान के साथ उन कोशिकाओं से विभेदित किया जा सकता है. कोल्चिसिन और मिटोमाइसिन सी के लिए प्रस्तुत परिणामोंसे पता चलताहै कि विलायक नियंत्रणों की तुलना में जीनोटॉक्सिसिटी और साइटोटॉक्सिसिटी दोनों का मूल्यांकन विभिन्न खुराकों पर किया जा सकता है और सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण एम एन आवृत्तियों को देखा जाता है जहां अपेक्षित. इसके अलावा, ओईसीडी टेस्ट गाइडलाइन 487 साइटोटॉक्सिसिटी9निर्धारित करने के लिए प्रति परीक्षण एकाग्रता के साथ कम से कम 500 कोशिकाओं के साथ जीनोटॉक्सिसिटी का निर्धारण करने के लिए एमएन की उपस्थिति का आकलन करने के लिए परीक्षण एकाग्रता प्रति 2,000 BNCs स्कोर करने की सिफारिश की; यह मैनुअल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर 1 एच से अधिक ले जा सकते हैं। प्रोटोकॉल और इस पत्र में परिणाम बताते हैं कि के बारे में 6,000 BNCs, 16,000 मोनो कोशिकाओं, और 800 POLY कोशिकाओं के एक औसत पर कब्जा कर लिया और के बारे में 20 मिनट में परीक्षण एकाग्रता के प्रति रन बनाए थे. डेटा अधिग्रहण की तेजी से दर और इतने कम समय में बनाए गए उम्मीदवार कोशिकाओं की उच्च संख्या इन विट्रो एमएन परख करने के लिए एमआईएफसी को रोजगार देने के एक अन्य महत्वपूर्ण लाभ को उजागर करती है।
जबकि इस पत्र में प्रस्तुत परिणाम उत्साहजनक हैं, वे एक प्रारंभिक सबूत के अवधारणा विधि के प्रतिनिधि हैं. इस काम के बाद एक बड़ा, अधिक विविध रासायनिक सेट है कि कई वर्गों और जीनोटॉक्सिसिटी और cytotoxicity के तंत्र को शामिल किया गया है जैसे कि Kirkland एट अल द्वारा सुझाए गए उन लोगों के द्वारा और अधिक गहन जांच द्वारा पीछा किया जाना चाहिए37 ऐसे अध्ययनों का आयोजन कर रहे हैं समय लेने वाली और श्रम गहन, और इस कागज के दायरे के बाहर गिर हालांकि, इन बड़े पैमाने पर अध्ययन विधि की क्षमता में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए मज़बूती से कमजोर genotoxic एजेंटों की पहचान करेगा. यहाँ प्रस्तुत पद्धति अभी तक एक microwell प्रारूप है, जो एक बड़ी खुराक रेंज भर में और अधिक तेजी से और कुशल स्क्रीनिंग की अनुमति होगी करने के लिए miniaturized नहीं किया गया है. इस प्रकार, अपने वर्तमान रूप में, MIFC आधारित इन विट्रो MN परख यहाँ प्रस्तुत सबसे अच्छा श्रम गहन अनुवर्ती अध्ययन या अच्छी प्रयोगशाला प्रथाओं में अनुसंधान के लिए उपयुक्त हो सकता है. हालांकि, विधि अनुकूलित और मान्य किया जा करने के लिए जारी रहेगा, और आकृति विज्ञान से संबंधित रासायनिक विशिष्ट घटनाओं का पता लगाने में वृद्धि हुई लचीलापन के लिए अनुमति देने की क्षमता के पास, इस तरह के aneugen जोखिम है कि के साथ कोशिकाओं के अनुपात बढ़ जाती है के रूप में अभी भी स्कॉरेबल38हैं कि गैर-वृत्तीय नाभिक । अंत में, MIFC विधि MN प्रेरण के तंत्र का एक अधिक व्यापक दृश्य प्रदान करने के लिए MN परख (जैसे kinetochore धुंधला) में अतिरिक्त biomarkers शुरू करने का अवसर प्रस्तुत करता है.
The authors have nothing to disclose.
लेखक धन्यवाद क्रिस्टीन Probst (Luminex निगम) डेटा विश्लेषण टेम्पलेट के पिछले रूपों के विकास में उसके प्रयासों के लिए, साथ ही डॉ हैली Pugsley (Luminex निगम) और डॉ फिल Morrissey (Luminex निगम) की समीक्षा करने और संपादन के लिए पांडुलिपि.
15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
Colchicine | MilliporeSigma | 64-86-8 | |
Corning bottle-top vacuum filter | MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 um filter, 500 mL bottle |
Cytochalasin B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | 5 mg bottle |
Debubbler – 70% Isopropanol | EMD Millipore | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ Free |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL solution |
Mannitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
MIFC – ImageStreamX Mark II | EMD Millipore | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006 |
MIFC analysis software – IDEAS | EMD Millipore | 100220 | The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII) |
MIFC software – INSPIRE | EMD Millipore | 100220 | This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII) |
Mitomycin C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
NEAA Mixture 100X | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | Gibco | 15070063 | |
Potassium Chloride (KCl) | MilliporeSigma | P9541 | |
Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | You can use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
RPMI-1640 Medium 1X | HyClone | SH30027.01 | |
Sheath – PBS | EMD Millipore | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X Ca++MG++ free. Fill container with 900mL of Sheath. |
Sterile water | HyClone | SH30529.01 | |
Sterilizer – 0.4-0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
System Calibration Reagent – SpeedBead | EMD Millipore | 400041 | Each tube holds ~10 mL. https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav |
T25 flask | Falcon | 353109 | |
T75 flask | Falcon | 353136 | |
TK6 cells | MilliporeSigma | 95111735 |