Her presenterer vi en protokoll kultur menneskelige enteroid eller colonoid monolayers som har intakt barriere-funksjonen til å studere vert epithelial bakterieflora samhandlinger på mobilnettet og biokjemiske.
Menneskelige 3-dimensjonale (3D) enteroid eller colonoid kulturer avledet fra krypten base stamceller er den mest avanserte ex vivo modellen av intestinal epitel. Deres lukkede strukturer og betydelig støtte ekstracellulær matrix er 3D kulturer ikke ideelt for vert-patogen studier. Enteroids eller colonoids kan dyrkes som epithelial monolayers på permeable vev kultur membraner som tillater manipulering av både luminal og basolateral celle overflater og tilhørende væsker. Denne forbedrede luminal overflaten tilgjengelighet muliggjør modellering bakteriell vert epithelial interaksjoner som Slim-nedverdigende mulighet av enterohemorrhagiske E. coli (EHEC) på colonic epitel. En metode for 3D kultur fragmentering, monolayer frø og transepithelial motstand (TER) mål å overvåke fremdriften mot confluency og differensiering er beskrevet. Colonoid monolayer differensiering gir utskilles Slim som kan studeres ved immunofluorescence eller immunoblotting teknikker. Mer generelt, enteroid eller colonoid monolayers aktiverer en fysiologisk relevante plattform å evaluere bestemt celle populasjoner som kan målrettes av patogene eller commensal bakterieflora.
Intestinal organoids, enteroids og colonoids har ført til mange fremskritt i å forstå stamcelleforskningen atferd, intestinal utvikling, barriere/transport funksjon og differensiering. 1 men 3D kultur begrenser studiet av verten epithelial-patogen samhandling fordi lumen er ikke direkte tilgjengelig for bakterier eller virulens faktorer med mindre de lukkede strukturene er utsatt for microinjection. 2 , 3 i tillegg utskilles materialer som små molekyler, proteiner, eller Slim kan ikke være lett samplet fra 3D kultur for nedstrøms. Virkningen av patogene agenter på epithelial barriere funksjonen4 og ion transport5 er evaluert i 3D kultur med fluorescerende fargestoffer og time-lapse mikroskopi, men monolayers dyrket på permeable vev kultur støtter er mottakelig for flere teknikker som TER måling og Ussing kammer/spenning klemme innspilling. 6 , 7
Flere publikasjoner har beskrevet protokoller for 2D- eller monolayer kulturen i enteroids/colonoids. Materialer seg for å fremme tarmepitelet vedlegg inkluderer kollagen hydrogels,8,9 0,1% gelatin,10 tynne lag murine sarkomspesialitet-avledet kjelleren membran matrix (BMM),11,12, 13 og menneskelige kollagen IV. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 , 17 såing tilnærmingsmåtene er mekanisk fragmentering av pipettering6,14,15 og/eller av celle vedheft faktorer bruke trypsin,10,11 dispase,13 eller EDTA. 9 noen protokoller bruker ikke-porøse vev kultur plasticware for såing, men dette begrenser tilgang til basolateral, så de fleste programmer avhenger permeable vev kultur setter inn. Dokumentasjon av stabile confluent monolayer dannelsen og vedlikeholdet varierer blant publikasjonene. Dessuten vekst og differensiering media komposisjoner for menneskelige kulturer varierer for ulike grupper og fortsette å utvikle seg som flere forskere vedta og justere metodikken deres program og tilgjengelige ressurser.
For å løse begrensningene for 3D intestinal epithelial kultur i vert-patogen samhandling studier, presenterer vi en endret protokoll for å konvertere 3D menneskelig enteroids eller colonoids til en monolayer. Etter å oppnå confluency i en krypt-lignende umodne tilstand, fører tilbaketrekking av vekstfaktorer WNT3A, RSPO1 og hemmere A-83-01 og SB 202190 til differensiering representative for små intestinal villus eller overflate colonic epitel. Vi beskriver den ideelle matrise, menneskelige kollagen type IV pels som setter inn og få uniform enteroid eller colonoid fragmenter for plating. Vi viser at denne protokollen gir en confluent monolayer med et høyt TER. Colonoid monolayers skiller ut et tykt apikale Slim lag, slik at ex vivo studier av patogen Slim kommunikasjon via immunoblotting eller immunostai. En modifisert fiksering prosedyre å bevare colonic Slim laget for immunostai-er også beskrevet. Denne metoden tar sikte på å gi en tett modell for å studere de tidligste intestinal vert-patogen interaksjonene ved infeksjon.
Kritiske parametere for vellykket dannelsen av enteroid/colonoid monolayers inkluderer 1) frisk, voksende 3D kulturer som starter materiale; 2) belegg celle kultur sett inn overflaten med menneskelige kollagen IV før monolayer frø; 3) fragmentering av 3D kulturer enten mekanisk eller enzymatisk, men ikke enkelt cellenivå.
Under isolasjon av 3D enteroids/colonoids, kan optimal risting hastigheten variere avhengig av roterende diameteren på en gitt shaker modell. Hensikten er å ikke bare agitere platen for en effektiv blanding, men også unngå spruting celle suspensjon på plate omslag eller i tilstøtende brønner. Inkubasjon perioder < 30 min kan gi gjenværende BMM klamrer seg til celler som kan hindre vedlegg og dannelse av uniform celle monolayers når belagt på innlegg. Omfattende inkubering (≥ 1t) vil gi betydelig redusert celle levedyktighet.
Omfanget av føden må distansere 3D enteroids/colonoids kan variere stempelet stivhet og bruker fingerferdighet. Periodiske eksamen godt innholdet på kontrast lys mikroskop anbefales å finne fragment ensartethet under føden, med et mål om lag 30 celler per fragment. I stedet for eller i tillegg til føden, kan suspensjon bli fordøyd kort med trypsin å få mindre ensartet fragmenter. Trypsin oversikten kan være ønskelig hvis monolayers inneholder en stor andel av 3D-lignende strukturer blant en ellers enkelt epiteliale lag. Imidlertid er avstandtagen til enkeltceller ikke ønskelig som dette reduserer betydelig celle levedyktighet. En brønn av enteroids/colonoids kultivert i en 35 μL BMM dråpe vil normalt være nok til å fylle ut 2-3 innlegg, men denne faktoren kan variere avhengig av antall og gjennomsnittlig størrelse på enteroids/colonoids.
Colonoid monolayers kan absorbere en betydelig mengde apikale mediet som de skille. Dette kan omgås ved å bruke flere DM til øvre sett inn chamber (150-200 μL), selv om delvis tørking av den øvre kammeret ikke synes å påvirke monolayer levedyktighet eller funksjon i nedstrøms analyser. Etter ca 4-5 dager med differensiering utvikle colonoid monolayers ekstracellulære Slim som kan være synlig som tykk/geléaktige materiale på cellens overflate etter forsiktig aspirasjon av DM.
For EHEC interaksjon med ytre Slim laget bruker vi rutinemessig bakteriell titer og inkubasjon perioden angitt i protokollen. Imidlertid bør unik bakteriell stammer først bli assayed på flere konsentrasjoner og inkubasjon perioder å finne de riktige parametrene for den ønskede effekten.
Under Slim fiksering, vil aspirating apikale mediet trolig fjerne mesteparten av ekstracellulære fristilt Slim laget. Derfor er det viktig å nøye helle ut mediet. Hvis mediet beholdes i sette inn av overflatespenning, bruke hjørnet av en foldet laboratorium vev å bryte overflatespenningen og veken vekk de fleste av mediet. Etter fiksering og flekker, kan Slim laget utilsiktet forskyves eller flat mens montering en coverglass over sett inn filteret. For å bevare Slim høyde, plasser filteret på en dråpe montering media og forsiktig plassere coverglass på filteret. Ikke trykk eller trykke ned på coverglass som dette kan betydelig flat Slim laget.
For å danne en polarisert monolayer fra celler i 3D kultur, er det nødvendig å reprodusere samspillet mellom basolateral membran integrins av intestinal epitelceller og ekstracellulær matrix (EFM) proteiner. Laminin, kollagen IV, fibronectin og en rekke proteoglycans utgjør intestinal epithelial ECM. 21 , 22 vi sammenlignet menneskelige celle-avledet laminin, fibronectin, collagen IV og Trouble-avledet BMM som sett inn belegg. Bare kollagen IV støttes dannelsen av stabil, langsiktig (opptil 4 uker) confluent enteroid/colonoid monolayers (tall 1-2). Små flekker av monolayer-lignende vekst ble oppnådd på hver av de andre testet matriser, men disse områdene ikke videre til confluency. Bruk av menneskelige kollagen IV som ECM surrogat har en rekke fordeler. BMM avledet fra Engelbreth-Holm-sverm (EHS) murine sarkomspesialitet celler ikke er menneskets opprinnelse, mens menneskelige kollagen IV er kommersielt tilgjengelig og generelt mer kostnadseffektive. I tillegg til BMM er en kompleks blanding av proteiner med iboende variasjon, og kan inneholde vekstfaktorer utskilles av sarkomspesialitet som påvirker genuttrykk. 23
Interaksjoner mellom intestinal epitelceller og underliggende ECM i intestinal epithelial hvile er fortsatt ufullstendig forstått. Betydningen av kollagen IV, men ikke laminin, som en vedheft ligand for menneskelig colonocytes24 og enhancer intestinal krypten epithelial celle hvile25 har blitt foreslått bruker antistoffer mot kollagen IV som forhindret vedlegg . Epithelial uttrykt β1-integrin synes å være viktig for ECM interaksjon, som et antistoff som er spesifikke for β1-integrin betydelig blokkert vedheft av colonocytes skrive IV kollagen. 24 mens kollagen IV gir en pålitelig ECM for enteroid/colonoid monolayer formasjon på inserts, epithelial ombygging av ECM over tid ikke ennå blitt evaluert i denne modellen, eller har innflytelse mer komplekse og definerte ECM blandinger av kollagen IV, laminin og fibronectin.
Menneskelige enteroids/colonoids i monolayer-format (tall 1-4) aktiverer manipulasjoner og prøvetaking som ville være tungvint eller umulig å oppnå med 3D matrix-embedded kulturer. 3D enteroids/colonoids varierer i størrelse, strukturelle kompleksitet og luminal volum, og dermed microinjection av mikrober eller små molekyler er vanskelig å nøyaktig quantitate. I tillegg, i motsetning til monolayers (tabell 1) hindre 3D kulturer direkte tilgang til både luminal og basolateral overflater å måle ioner, næringsstoffer, cytokiner eller utskilles faktorer assosiert med fysiologiske eller pathophysiologic . Confluency (tall 1-2) er en av de viktigste egenskapene til enteroid/colonoid monolayer nødvendig for å etablere ikke bare fysiologiske gradienter av næringsstoffer, ioner, og andre makromolekyler,16 men også skape riktig barriere luminal bakterieflora og sterile mesenchymal/immun celle befolkede serosal miljøer. Disse fasetter er viktig å vurdere for fremtidige studier som innlemme enteroid/colonoid monolayers med mesenchymal, immun eller nevrale celletyper å bygge mer komplekse fysiologiske modeller.
Kjente begrensninger i celle kultur sett inn modellen beskrevet her inkluderer mangel på fysiske kreftene som flytende skjæring stress og mekanisk strekk/komprimering (peristalsis), og fraværet av en anaerob apikale miljø vanligvis oppleves av intestinal epithelia i vivo. Disse elementene har potensial til å bli behandlet med mer avanserte microphysiological plattformer,26 , men de krever også ekstra kostnad, utstyr og ekspertise til å implementere. Både 3D og monolayer kulturer er også uten interaksjon med eller bidrag fra intestinal microbiome stromal celle populasjoner og immunsystemet med mindre disse komponentene er målbevisst lagt.
Fremtidige anvendelser av enteroid/colonoid-monolayer på kollagen IV-belagt celle kultur setter kan inneholde andre studier av patogene eller commensal mikrobiell samhandling, narkotika eller nærings-opptak, toksisitet, metabolisme, barriere-funksjonen, og funksjonelle ekstrautstyr katalysert av co kultur med ekstra intestinal celletyper. Evalueringer kan gjøres ikke bare innen epithelia sunn givere, men også fra personer med genetiske mutasjoner eller tarm lidelser, forutsatt av i vivo fenotyper opprettes bevart i ex vivo enteroid/colonoid kultur.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd P01 AI125181 K01 DK106323 (JGI) og K01 DK113043 (JFA). Vi takker James Kaper (University of Maryland, Baltimore, MD, USA) for å gi E. coli belastning HS og EHEC. Vi erkjenner også integrert fysiologi og Imaging kjerner Hopkins Conte fordøyelsessystemet sykdom grunnleggende Translational Core-forskningssenter (P30 DK089502) og Johns Hopkins massespektrometri og Proteomikk kjernen.
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol | Sigma | T4661 | Tris base, Component of lysis buffer |
A-83-01 | Tocris | 2939 | ALK4/5/7 inhibitor |
Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38 | |
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | Component of growth medium |
Alexa Fluor 488 phalloidin | Life Technologies | A12379 | Fluorescent probe for F-actin |
Antibiotic/antimycotic cocktail | Invivogen | ant-pm-2 | Primocin (100x) |
B27, 50x | Life Technologies | 17504-044 | Component of growth medium |
Cell culture inserts | Corning | 3470 | Transwell, PET membrane, 0.4 μm pore, 24-well plate |
CHIR 99021 | Tocris | 4423 | GSK3β inhibitor |
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life Technologies | C10639 | |
Collagen IV, from human placenta | Sigma | C5533 | |
Cultrex Organoid Harvesting Solution | Trevigen | 3700-100-01 | Depolymerizes basement membrane matrix |
Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) | Kaper lab, University of Maryland | ||
Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
Epithelial voltohmmeter electrode | World Precision Instruments | STX3 | |
Escherichia coli strain HS | Kaper lab, University of Maryland | ||
Ethanol, absolute | Pharmco | 111000200 | |
FluorSave mounting medium | Millipore | 345789 | For mounting insert membrane on microscope slide |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 200 mM |
HEK293T/Noggin-Fc cell line | van den Brink lab, Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research | For production of Noggin conditioned medium | |
HEK293T/RSPO1-Fc-HA cell line | Trevigen | 3710-001-K | For production of Rspondin-1 conditioned medium |
HEPES, 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Component of growth medium |
Heraeus Multifuge X1R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004250 | |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Fluorescent nuclear dye |
Human epidermal growth factor (EGF) | R&D Systems | 236-EG-01M | Component of growth medium |
IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | Component of lysis buffer |
Inverted cell culture light microscope | Olympus | CKX51 | |
LB broth | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
L-WNT3A cell line | ATCC | CRL-2647 | For production of Wnt3a conditioned medium |
Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356231 | Basement membrane matrix for 3D culture |
Mini cell scraper | United BioSystems | MCS-200 | |
MUC2 antibody, mouse monoclonal | Abcam | ab11197 | Use at 1:100 for immunostaining, 1:500 for immunoblotting |
MUC2 shRNA lentiviral particles | GE Dharmacon | RHS4531 | GIPZ lentiviral shRNA, ID: 4583 |
Orbital shaker | Grant Instruments | PSU-10i | |
Penicillin-streptomycin, 100x | Life Technologies | 15140-122 | Component of growth medium |
Phosphate buffered saline | Corning | 21-031 | |
Probe sonicator with microtip | Branson Ultrasonics | 450 | |
Protease inhibitor cocktail for mammalian cells | Sigma | P8340 | Component of lysis buffer |
SB 202190 | Tocris | 1264 | p38 MAPK inhibitor |
Sodium chloride | Sigma | S3014 | Component of lysis buffer |
Sodium dexoycholate | Sigma | D6750 | Component of lysis buffer |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L3771 | Component of lysis buffer |
TrypLE Express, 1x | Life Technologies | 12605-010 | Trypsin, for digesting enteroid/colonoid fragments |
Vinculin antibody, rabbit monoclonal | Abcam | ab129002 | Use at 1:1000 for immunoblotting |
Water, tissue culture grade, sterile filtered | Corning | 25-055 | |
Y-27632 | Tocris | 1254 | RhoA/ROCK inhibitor |