En detaljert instruksjon er beskrevet på hvordan bygge et sterkt tilbøyelig feide flis (HIST) mikroskop og bruksområdene for single-molekylet bildebehandling.
Single-molekylet bildebehandling har sterkt avanserte vår forståelse av molekylære mekanismer i biologiske studier. Men er det utfordrende å få store felt-of-view, høy kontrast bilder i tykke celler og vev. Her introduserer vi sterkt tilbøyelig feiet flis (HIST) mikroskopi som overvinner dette problemet. Et par sylindriske linser ble gjennomført for å generere en langstrakt eksitasjon strålen som ble skannet over et stort tenkelig område via en rask galvo speil. En 4f konfigurasjon ble brukt til å plassere optisk komponenter. En vitenskapelig complementary metal oxide semiconductor kamera oppdaget fluorescens signalet og blokkert ut-av-fokus bakgrunnen med et dynamisk AC confocal slit synkronisert med strålen feiende. Vi presenterer en trinnvis instruksjon bygge HIST mikroskopet med alle grunnleggende komponenter.
Single-molekylet fluorescens imaging spiller en viktig rolle i mange biologiske studier som avslører ultrastructures, dynamikk og antallet biomolecules1,2,3. Imidlertid har det vært utfordrende for å studere single-molekyler innenfor eller vev. Mens AC confocal mikroskopi gir høy snitting evne4, er det ikke egnet for enkelt-molekylet bildebehandling på grunn av alvorlig photobleaching av høy eksitasjon intensitet eller tenkelig treghet. Widefield mikroskopi bruker svakere belysning, men lider av en dårlig signal til bakgrunnen forholdet (SBR)5. Lys arks mikroskopi, derimot, kunne vise gode snitting og lav photobleaching6; Imidlertid er tilgjengelige numeriske blenderåpning (NA) sterkt begrenset av kravet til ortogonalt plassert mål7. Alternativt, det krever spesiell belysning og prøve kamre8,9.
For disse grunner, har svært tilbøyelig og laminert optisk ark (HILO) mikroskopi vært mye brukt for 3D single-molekylet imaging10. Når en tilbøyelig stråle møter et grensesnitt av to medier (glass og vann, for eksempel), er strålen brytes ifølge Snells lov. Viktigere, refracted strålen blir tynnere og tykkelse er beskrevet som dz = R/tan(θ) hvor R er diameteren på tilbøyelig strålen og θ er brytning vinkelen på overført strålen. Denne enkel implementering gir en god snitting evne. Likevel, dette forholdet angir at en tynn belysning (dvs. høyt snitt kapasitet) krever en liten R og/eller en stor θ. For eksempel, når R = 20 µm og θ = 72 grader, kan man få dz = 6,5 µm. Det er en praktisk grense for å øke brytning vinkelen for å image dypt inne celler og unngå total intern refleksjon, er det en sterk kopling med belysning diameter og strålen tykkelsen. Derfor viser HILO imaging en relativt liten felt-of-view (FOV) som sterkt begrenser dens søknadene i flercellet bildebehandling.
Nylig har vi løse dette problemet ved svært tilbøyelig feiet flis (HIST) mikroskopi der FOV er skilt fra strålen tykkelsen i en svært enkel måte11. Først genereres en bjelke langstrakte i én retning via et par sylindriske linser. Denne strålen, betegnes som en brikke, produserer en tynn belysning med dz ~ 4 µm mens dens FOV er 130 x 12 µm2. Deretter er flisen blåst over utvalget med et roterende galvo speil. I mellomtiden er fluorescens bildet lagret på en vitenskapelig complementary metal oxide semiconductor (sCMOS)-kamera som filtrerer effektivt ut-av-fokus bakgrunn i en rullende nedleggelse modus som fungerer som tunable AC confocal slit gjenkjenning. På denne måten kan HIST mikroskopi enkelt-molekylet bildebehandling med et større synsfelt (~ 130 x 130 µm2) og en tynnere belysning enn HILO bildebehandling. Vi brukte dette nye imaging teknikk for å oppdage RNA utskrifter med en enkelt sonde i celler eller et par sonder i musen hjernen vev, som har et betydelig potensial for å studere genuttrykk og sykdommer. I motsetning til andre tilnærminger, HIST har bare et enkelt høy numeriske blenderåpning mål uten en ekstra illuminator eller ekstern oppdagelsen mål og er fullt kompatibel med invertert mikroskop. Fordelene med en stor FOV og høy kontrast vil gjøre HIST mikroskopi et fremtredende verktøy i biologi og medisin. Vi presenterer detaljerte instruksjoner om instrumentering av HIST mikroskopet, og hvordan å teste og kalibrere ytelsen som nedenfor.
Det er to avgjørende skritt i denne protokollen. Den første er riktig plassering av L4 i trinn 3.3, sikre at hendelsen strålen går gjennom midten av linsen og en perfekt luftige disk mønster dannet på taket. Plasseringen av L4 bestemmer plasseringen av alle de andre optisk komponentene, inkludert M5, L3, GM og L2. Det andre kritiske trinnet er synkroniseringsprosessen. For å avslå ute av fokus bakgrunn, synkroniseres aktive piksler som effektive sporingsbredde tilsvarer flis bredde med strålen feiende. Derfor er det nødvendig å mål vidden effektiv belysning av en flis bredde (trinn 5.6) og angi kameraenes parametere tilsvarende i trinn 6.4.
Når imaging med stor FOV, viser metoden presentert en økt bakgrunn på en side i forhold til den andre siden. Dette tilskrives litt annerledes vinkler av belysning forskjellige tenkelig posisjoner. Implementere en andre galvo speilet i stedet for M5 lindrer problemet som demonstrert før av synkront justere plasseringen og skanning vinkel11. I stedet for rett akromatisk doublets, vil en telesentrisk skannelinsen også være nyttig. Men for imaging et < 8,080 µm2, enkelt galvo speil feiende var tilstrekkelig. HIST mikroskopi har en grense på tenkelig dybden, men det er kunne få en god SBR når imaging opptil ~ 15 µm med en 12 µm flis bredde og en NA 1.45 olje nedsenking linsen11.
I denne protokollen brukte vi en bjelke komprimering av 8 for å gjøre en flis bredde. En tynnere belysning kan brukes i HIST mikroskopi for å oppnå høyere SBR, som kan være kraftig for single-molekylet vev imaging11. Men i dette tilfellet bør photobleaching effekt vurderes av en økt eksitasjon intensitet mens gjeldende strålen komprimeringsforholdet viste redusert photobleaching i 3D imaging forhold til Epi11. Sammenlignet med lys arks mikroskop med to ortogonalt plassert mål, er HIST mikroskopi enkel å implementere og kompatibel med konvensjonelle eksempel forberedelser. Den forbedrede SBR og store FOV av HIST mikroskopi er egnet for å studere samhandling og dynamikken i ett biomolecules i flere celler og kan brukes mer i super-oppløsning bildebehandling og enkelt-molekylet sporing.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Defense Advanced Research prosjekter Agency (DARPA) (HR00111720066) og National Science Foundation (NSF) (1805200). Vi takker Michael Serge i Andor teknologi for sjenerøst låne sCMOS kameraet.
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-060-A-ML | Collimator |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-100-A-ML | L1,L2 |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-300-A-ML | TL |
1" Broadband Dielectric Mirrors | Thorlabs | BB1-E02-10 | M1~M7 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1363RM-A | CL1 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1695RM-A | CL2 |
1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-857 | For dichroic mirror mounting |
1" Threaded Cage Plate | Thorlabs | CP02 | For holding other lenses |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-150-A-ML | L3 |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-400-A-ML | L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01 | For holding L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01T | For holding L3 |
2% Bis Solution | Bio Rad | 64085292 | hydrogel component |
20 nm fluorescent beads | Thermo Fisher | F8782 | For testing imaging |
30 mm Cage Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KCB1 | For objective & camera mounting |
30mm Cage System Iris | Thorlabs | CP20S | |
3-Axis NanoMax Stage | Thorlabs | MAX311D | |
40% Acrylamide Solution | Bio Rad | 64148001 | hydrogel component |
405 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
50x TAE buffer | Bio-Rad | 161-0743 | hydrogel component |
561 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-DPL | |
638 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | hydrogel component |
Beam alignment tool | custom made | ||
BNC terminal blocks | Natural Instruments | BNC-2110 | |
Cage plate with M9 x 0.5 internal threads | Thorlabs | CP1TM09 | For holding aspheric lens |
Cage System Rods | Thorlabs | SR series | |
Cell culture & smFISH | See a reference [11] | ||
Double side tape | Scotch | 515182 | Flow chamber |
Epoxy | Devcon | 14250 | Flow chamber |
Galvo mirror | Thorlabs | GVS211 | GM |
Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | |
Half wave plate | Thorlabs | WPH10M-405/561/633 | Power adjustment |
long-pass dichroic mirror | Chroma | T550lpxr | For combining lasers |
Microscope slides | Fisherbrand | 12549-3 | Flow chamber |
Mikroskopische Deckglaser | Hecht Assistent | 990/5024 | Flow chamber |
Mounted Frosted Glass Alignment Disk | Thorlabs | DG10-1500-H1-MD | For double pinhole system |
Mounted rochester aspheric lens | Thorlabs | A230TM-A | |
Multi-band dichroic mirror | Semrock | Di03-R405/488/561/635-t3 | DM; 3 mm thickness |
Multi-band filter | Semrock | FF01-446/523/600/677-25 | BF |
Multimode fiber | Thorlabs | M31L02 | MMF |
N,N,N',N'-tetramethyl ethylenediamine | Sigma | T7024-25ML | hydrogel component |
NI-DAQ board | Natural Instruments | PCI-6733 | |
Ø1" Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KM100 | For holding mirrors |
Objective lens | Olympus | PLANAPO N 60X | 60X 1.45NA oil |
Pedestal Base Clamping Forks | Newport | 9916 | |
Pedestal Pillar Posts | Thorlabs | RS1P8E | |
Piezo controller | Thorlabs | BPC303 | |
Polarized beam splitter | Thorlabs | PBS251 | For combining lasers |
RMS-SM1 adapter | Thorlabs | SM1A3TS | For objective lens |
Rod holder | custom made | ||
Rotation cage mount | Thorlabs | RSP1/CRM1/CRM1P | For HWP & cylindrical lens mounting |
sCMOS camera | Andor | Zyla-4.2P-CL10 | |
Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | Beam collimation test |
Single mode fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | SMF |
SM1 Lens Tubes | Thorlabs | SM1S25 | For double pinhole system |
SM1 Slotted Lens Tube | Thorlabs | SM1L30C | For double pinhole system |
Stage mount | custom made | ||
threaded fiber adapter | Thorlabs | SM1FC | |
Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | Fiber coupling |