Summary
Ayrıntılı bir talimat nasıl son derece eğimli kurmak için kiremit (HIST) mikroskop ve onun kullanım için tek molekül düşsel süpürüldü açıklanmıştır.
Abstract
Tek molekül görüntüleme anlayışımız biyolojik çalışmalarda moleküler mekanizmaları büyük ölçüde ilerlemiştir. Ancak, kalın hücre ve dokulara büyük görünüm alanı, yüksek kontrastlı görüntüler elde etmek için zor olmuştur. Burada, bu sorunun üstesinden gelir son derece eğimli ok açılı tipler kiremit (HIST) mikroskopi tanıtmak. Silindirik lensler bir çift hızlı galvo ayna aracılığıyla geniş bir görüntüleme alanı üzerinden taranmış bir uzun uyarma ışını oluşturmak için uygulanmıştır. 4f yapılandırması optik bileşenleri konumlandırmak için kullanıldı. Bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarı iletkeni kamera Floresans sinyal algılandı ve odak arka plan ışın süpürme ile senkronize dinamik bir confocal yarık ile engellendi. Biz bir adım-adım öğretim tüm temel bileşenleri HIST mikroskopla bina mevcut.
Introduction
Tek molekül Floresans görüntüleme ultrastructures, dynamics ve biomolecules1,2,3sayısını ortaya birçok biyolojik çalışmalarda önemli bir rol oynar. Ancak, bu tek-moleküllerin hücre veya doku içinde çalışmaya zor oldu. Confocal mikroskobu yüksek parça yeteneği4sağlarken, şiddetli photobleaching yüksek uyarma yoğunluğu veya yavaş görüntüleme hızı nedeniyle tek molekül görüntüleme için uygun değildir. Widefield mikroskobu zayıf aydınlatma kullanır ama zavallı bir sinyal arka plan oranı (SBR)5' e uğrar. Işık sayfalık mikroskobu, öte yandan, iyi kesit ve düşük photobleaching6gösterilebilir; Ancak, mevcut sayısal diyafram (NA) büyük ölçüde uygun yerleştirilmiş hedefleri7şartı ile sınırlıdır. Alternatif olarak, özel Lombozlar ve camlama, örnek odaları8,9gerektirir.
Bu nedenlerden dolayı son derece eğimli ve lamine optik levha (HILO) mikroskopi yaygın 3D tek molekül görüntüleme10için kullanılmıştır. Eğimli bir ışını bir arabirim iki medya (cam ve su, örneğin) karşılaştığında, ışın Snell yasasına göre kırılan. Önemlisi, kırılmış kiriş tiner alır ve kalınlığı dz anlatılan nerede R eğimli ışın çapı ve θ iletilen ışın kırılma açısı R/tan(θ) =. Bu basit uygulama bir iyi parça yeteneklilik içinde sonuçlanır. Yine de, bu ilişki ince aydınlatma (yani, yüksek parça yeteneği) küçük bir R ve/veya büyük θ gerektirdiğini gösterir. Örneğin, ne zaman R 20 µm ve θ = 72 derece, bir-elde etmek dz = 6.5 µm. Derin hücrelerin içinde görüntü ve toplam iç yansıma önlemek için kırılma açısı artan pratik bir sınırı olduğundan, aydınlatma çapı ve kiriş kalınlığı güçlü bir bağlantı vardır. Bu nedenle, HILO görüntüleme bir nispeten küçük alan uygulamaları çok hücreli görüntülemede büyük ölçüde sınırlayan görüş (FOV) gösterir.
Son zamanlarda, son derece eğimli ok açılı tipler kiremit (HIST) mikroskopi nerede FOV kiriş kalınlığı çok basit bir şekilde11dan decoupled tarafından bu sorunun üstesinden geldiler. İlk olarak, bir yönde uzamış bir ışın silindirik lensler bir çift ile oluşturulur. Bir taşı adlandırılan bu ışın dz ile ince bir aydınlatma üreten ~ onun FOV 130 x 12 µm2ise 4 µm. Sonra döşeme dönen galvo ayna kullanarak örnek üzerinde süpürüldü. Bu arada, floresan görüntü fotoğraf makinesinde ayarlanabilir confocal yarık algılama hizmet çalışırken bir çekim modunda çalışan tarafından etkili bir şekilde out-of-odak arka plan uygulayan bir bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (sCMOS) kaydedilir. Bu şekilde, bir daha geniş görüş alanı (~ 130 x 130 µm2) ve HILO görüntüleme daha ince bir aydınlatma ile tek molekül görüntülemede HIST mikroskobu sağlar. Biz bu yeni görüntüleme gen ekspresyonu ve hastalıklar için önemli potansiyele sahip hücreleri tek bir soruşturma veya fare beyin dokularında, birkaç probları ile RNA transkript algılamaya tekniği uygulanır. Diğer yaklaşımların aksine HIST sadece ek bir ışığı olmadan bir tek yüksek sayısal diyafram amaç veya uzaktan algılama hedefleri istihdam ve ters mikroskoplar ile tam olarak uyumludur. Bu avantajlar bir büyük FOV ve yüksek karşıtlık ile birlikte HIST yapacak mikroskobu Biyoloji ve tıp önemli bir araç. HIST mikroskop ve nasıl test ve aşağıdaki gibi performans ayarlama araçları ile ilgili ayrıntılı yönergeler sunmak.
Protocol
1. mikroskop, lazerler ve hizalama araçlar kadar ayarlama
- Mikroskop oluşturmadan önce optik, optomechanics ve Malzemeler tabloiçinde listelendiği gibi elektronik de dahil olmak üzere gerekli tüm bileşenlerin hazırlayın.
- Mikroskop gövdesi çoğunlukla oluşan iki bölümden hazırlamak: bir RMS dişli bağlantı noktası ve bir piezo-sahne ile bir objektif sahibi monte alüminyum blokta (şekil 1A).
Not: Özel yapım mikroskop vücut rahatlık ve esneklik araçları12için kullanılır. Herhangi bir ticari olarak mevcut mikroskop vücut HIST mikroskopi için kullanılabilir. - Birden fazla lazer satır birleştirerek ve onları bir tekli mod fiber kaplin
- Yükleme 405, 561, 638 nm lazerler optik üzerine tablo ve şekil 1' deBgösterildiği gibi ışınları polarize bir ışın ayırıcı ve bir uzun taramalı dikroik ayna aracılığıyla birleştirmek. Tüm lazer ışınları hizalama araç iğne başarılı emin olun. Güç ayarı için yarım dalga tabak yerleştirin.
Not: göz koruması için koruyucu gözlük giymek ve kiriş-bloklar istenmeyen lazer ışınları absorbe için kullanın. - Bir lif kaplin lens yüklemek (f = 4,5 mm) ve bir lif bağdaştırıcısı bir kafes sistemi ile z ekseni çevirmen.
- Multimod fiber (MMF, Ø 62.5 µm) fiber adaptöre bağlayın. Her lazer kaplin verimliliği % 95'den daha yüksek olana her çifti direksiyon ayna ve z-çevirmen ayarlayın. Çıkış ışını çevre Gauss şeklindeki sahip benek desenleri vardır.
- Multimod fiber götürün ve bir tekli mod fiber (SMF) bağlayın. MMF, benzer ince ayarlarını yapmak ve üç lazer kaplin verimliliğini en üst düzeye çıkarmak.
- Yükleme 405, 561, 638 nm lazerler optik üzerine tablo ve şekil 1' deBgösterildiği gibi ışınları polarize bir ışın ayırıcı ve bir uzun taramalı dikroik ayna aracılığıyla birleştirmek. Tüm lazer ışınları hizalama araç iğne başarılı emin olun. Güç ayarı için yarım dalga tabak yerleştirin.
- Işın uyum içinde uyarma ve algılama yolları için kullanılan collimated bir ışık kaynağı bir araya getirin. Bu aygıt geçici tutarlı bir ışık kaynağı oluşmaktadır (561 nm) SMF, fiber adaptörü, achromatic objektif bağlı (f = 60 mm), Iris ve Ø1 "spacer bir kafes sistemi (şekil 1C) tüp. Fiber bağdaştırıcısı ve kolimasyon emin olmak için bir kesme Girişmölçeri kullanarak lens arasındaki mesafeyi ayarlamak.
- Bir ışın hizalama araç (şekil 1D) hazırlayın. Bu yükseklikte 2" yüzeyden hızlı ve hassas ışın hizalamasını sağlayan optik tablo, iğne ile alüminyum mesajların bir çift var.
- Hangi oluşmak-iki Ø1 bir çift iğne deliği sistemi montajı "zemin cam hizalama diskler her tarafında ve iki Ø1" lens tüpler (alttaki yarıklı) şekil 1'Egösterildiği gibi.
2. algılama yolunu ayarlama
- Amaç almak ve collimated ışık kaynağı yükleyin. Çıktı ışın--dan mikroskop kabaca masanın üzerinde dişli delikler ile paralel olarak optik masa yüksekliği ve hizalanmış ayna (M1) düğmeleri altında objektif sahibi ayarlamak. Şekil 2 için optik her bileşen detaylı pozisyonlar için bakın.
- Çok bantlı dikroik ayna (DM) takın ve ışın 90 derece yansıtacak. İris en büyük boyutunu kullanın ve ışını dikroik ayna kırpma olmadan ortasına geçer emin olun.
- Sızdıran ışını dikroik ayna aracılığıyla geçen algılama yol hizalama kılavuzunu kullanın. Bir sCMOS fotoğraf makinesini kiriş yerleştirin ve ışın iki aynalar (M2 ve M3) kullanarak kamera çip ortasına isabet emin olun.
- Bir tüp lens takın (TL; f = 300 mm) yaklaşık 300 mm kamera uzak.
- Collimated ışık kaynağı kaldırmak ve tavanda bir desen açıkça kamera tarafından çözülene kadar tüp objektif ve kamera göreli aralıklarını ayarlayın.
- Çoklu bant geçiren Filtre (BF) tüp objektif önce çok renkli floresan görüntüleme için ekleyin.
3. uyarma yolunu ayarlama
- Collimated ışık kaynağı üzerinde objektif sahibi eski mevkiini geri vermek. Bir kat-ayna (ışın çıkışı yeniden yönlendirmek için M4) 90 derece--dan mikroskop yer. Işın ışın hizalama aracı iğne delikleri aracılığıyla geçene kadar dikroik ayna ve kat-ayna kolları yinelemeli olarak ayarlayın.
- Collimated ışık kaynağı bağlantısını kesin ve ışın doğru mikroskop beden puan tablosu, yükleyin. Bir ışın hizalama araç ve bir çift iğne deliği sistemi kullanarak ışın hizalayın.
- Bir lens L4 Ekle (f = 400 mm; Ø 2"=) optik yol yaklaşık 400 mm objektif sahibi uzak için. Objektif lens yükleyin ve mükemmel havadar yuvarlak yüzey deseni tavanda oluşan kadar optik eksen boyunca L4 konumunu ayarlamak.
Not: objektif eklerken, lens aracılığıyla geçen ışın pozisyonu değişmeden tutulmalıdır. Objektifin L4 kolayca/60 mm'den SM2 dişli kafes plaka müstakil bağlı olmasını sağlayan bir SM2 iş parçacığı vardır. - Objektif sökün ve açık bir iris ile collimated ışık kaynağı yeniden yükleyin. Kartvizit mikroskopla ışın çıktısı aşağı izleme. Işın boyutunu en küçük nerede yerde bir ayna M5 dağ ve yaklaşık 400 mm L4, uzak olan bir konjüge görüntü (CIP) uçağıdır.
- Bir ayna M6 yüklemek ve ışın 90 derece yansıtmaktadır. M5 ve M6 yinelenen ışın hizalama araç ile ayarlayın.
- Bir lens L3 Ekle (f = 150 mm) yaklaşık 150 mm M5 uzak. Bir kesme Girişmölçeri çıktı ışın kolimasyon emin olmak için kullanın.
- Geçici olarak L4 ve ışın aşağı izleme L3 odak konumunu bulmak için götürmek. Konjuge geri odak düzlemi (cBFP) olan bir tek eksen galvo ayna bu noktada, koydum. 0 volt galvo aynaya tedarik ve böylece 90 derece ışın yansıtır galvo ayna tutucu döndürün.
- Bir kat-ayna M7 yerleştirin. Düzgün L2 yere (f = 100 mm) adım 3.6 olarak aynı şekilde.
- Nesne sahibinden collimated ışık kaynağı kaldırın. Kolimasyon objektif L1 yüklemek (f = 100 mm), fiber bağdaştırıcısı ve Iris. Tekli mod fiber adaptörüne bağlayın ve görüntüleme sistemi ışını gönderin.
- L4 yeniden takın ve mükemmel havadar yuvarlak yüzey deseni tavanda görünene kadar ince ayar sistem.
4. silindirik mercekler kurma
- Silindirik bir lens takın (CL1, f = 400 mm) sonra L1 ve silindirik objektif x ekseni boyunca ışını odaklanır emin olun.
- Başka bir silindirik lens takın (CL2, f = 50 mm) ışın yolu için. Bir kesme Girişmölçeri çıktı ışın collimated emin olmak için kullanın.
Not: 450 mm iki silindirik lens arasındaki mesafedir. Çıktı ışın 8 sıkıştırma oranına sahip ve bir uzun oval şekilli havadar disk desen tavanda kurdu.
5. test kiremit görüntüleme
- 3D hidrojel örnek hazırlamak. Mix 20 nm % 12'si acrylamide:bisacrylamide (29:1), %0.2 (v/v) TEMED ve % 0.2 (w/v) amonyum persülfat 0,75 x TAE tampon oluşan bir hidrojel çözüm ile koyu kırmızı boncuk. Karışık çözüm 50 µL başka bir yerde11açıklandığı gibi bir akış odanın içine enjekte. 10 dakika sonra 3D hidrojel örnek görüntüleme için hazır.
- Örnek örnek tutucu koymak. 638 nm lazer üzerinde açmak ve ayarlamak için güç < 1 mW için örnek uyarma.
- Kamera kontrol yazılımı çalıştırın. Kamera satın alma-ayar panelinde iç tetik modu seçin ve ücretsiz modunda çalışan video al ' ı tıklatın.
- Böylece 0 volt uygulandığı zaman galvo ayna görüntü kamera Merkezi'nde bulunur biraz kamera konumunu ayarlayın.
- Ayna M5 son derece eğimli bir aydınlatma elde etmek için yatay topuzu döndürün.
Not: aydınlatma açısı bir artış ile hidrojel görüntü olarak daha ince ışın alır bu Epi görüntü daha netleşiyor. Ancak, görüntü hemen hemen aynı pozisyonda tutar. - Karo resmi kaydedin. Etkili aydınlatma Genişlik11hesaplayın. Örneğin, şekil 3 12 µm etkili aydınlatma genişliğini gösterir.
6. tarih görüntüleme
- Klemensleri ile bağlı veri edinme Sedye hazırlayın. Kullanıcı 1 BNC konnektör ile P0.0 bir elektrik tellerden bağlayın. Kullanıcı 1 sCMOS kamera harici tetikleme için dijital bir çıktı olarak kullanın. Bir analog bağlantı galvo ayna şoför AO0 çıktı.
- TTL darbe trenler özel yapım programı (şekil 4A) kullanarak P0.0 oluşturmak ve koymak belgili tanımlık dönem zaman = 400 ms ve t_ON = 2 Bayan kullanıcı 1 BNC terminal oluşturulan darbeleri dijital osiloskop tarafından kontrol ve BNC kablo kameraya bağlayın Dış tetikleyici bağlantı noktası.
Not: Bu yazıda kullanılan kontrol yazılımı istek üzerine mevcuttur. Farklı kamera kare hızlarında Imaging zaman dönem zaman buna göre ayarlanmalıdır. - Özel yapım programı yoluyla bir galvo ayna süpürmeye başlayın. V-500 mVmin ve Vmax 500 ayarlamak için tam FOV düşsel mV. Bu işlem'in altında 3D hidrojel örnekleri hala yüksek arka plan benzer Epi aydınlatma göstermek olduğunu unutmayın.
- Kamera satın alma ayarını değiştirme.
- Dış tetik modu ve (ardıl) LightScan artı aþaðý açýlan menüsünde şekil 4Bgösterildiği gibi seçin.
Not: bir tetikleyici sinyal açık sürece bu ayarda kamera görüntüleri almaz. - İnceden inceye gözden geçirmek hız kontrolü için pencere yüksekliği ve çizgi maruz kalma zamanı Denetimi'ni tıklatın ve 180 satır ve 28 ms, sırasıyla olduğu için değerleri ayarlayın.
Not: bir kiremit Genişlik (Weff) 180 satırları (12 µm) ve bir entegrasyon zaman her satırda (Tint) 28 ms olduğunda satırları (TD) arasındaki gecikme süresi TD belirlenir Tint/Weff = 2.048 x görüntüleme için 0,156 Bayan = 2.048 piksel, 2.048 x TD + Tint toplam edinme zamanı ~2.9 kareye karşılık gelen 346 ms =.
- Dış tetik modu ve (ardıl) LightScan artı aþaðý açýlan menüsünde şekil 4Bgösterildiği gibi seçin.
- Biraz Vmax ve Vdk daha net görüntüler elde etmek için ayarlayın.
- 3B yığın görüntüleri 3B yığın ON üzerinde anahtarlama ve yığınlar ve adım boyu sayısını belirten özel yapım programı kullanarak elde edilir.
Representative Results
Örnek olarak, 638 bir uyarma dalga boyu ile Atto647N ile Etiketlenmiş tek iplikçikli DNA görüntüsü bir 3D hidrojel nm. DNA hidrojel ağ üzerinden bir acrydite yan jel polimerizasyon sırasında demirli. Görüntüleri, şekil 5biriçinde gösterildiği gibi yüzey üzerinde 5 mikron alındı. HIST görüntü içinden arka plan oranı sinyal molekülünü noktalar HIST görüntünün çoğu ise 1.9 ± 0.7 zar zor Epi tarafından tespit edilemedi olmak hesaplanmıştır Epi görüntü kıyasla çok daha az arka plan gösterdi.
Tek molekül RNA Floresans in situ hibridizasyon (smFISH) içinde 4 ile gerçekleştirilen balık sondalar. Şekil 5 b smFISH görüntülerini AlexaFluor 647 A549 hücreleri üzerinde yapılan görüntüleme bir arabellek ile etiketli EEF2 (ökaryotik çeviri uzama faktör 2) görüntüler (önceki çalışmalarımız ile ilgili örnek hazırlama11bakın). Maksimum yoğunluk projeksiyon 20 z-5 µm kalınlık için karşılık gelen sıra yığınının üstündeki gerçekleştirildi. HIST görüntü sadece daha gelişmiş SBR ama Epi görüntüye göre de daha fazla Tekdüzen aydınlatma gösterdi. HIST entegrasyonu görüntüleme için zaman satır başına 32 ms, ikisi de 7.5 aynı aydınlatma gücü vardı Epi görüntüleme için çekim hızı 400 ms iken, mW ölçülen hedefi daha önce. Epi ve HIST görüntüleme hızı saniyede 2.5 kare çekim vardı.
Resim 1 . Mikroskop gövdesi, lazerler ve hizalama araçlar. (A)amaç ve örnek sahibi. Lazer sistemleri (B) fotoğraf. LP, uzun taramalı dikroik ayna; Λ/2, yarı-dalga plakaları; PBS, polarize beamsplitter. (C) Collimated ışık kaynağı. (D) kiriş hizalama araç iki ekleyebilme iğne delikleri ile. (E) çift iğne deliği sistem. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Son derece eğimli ok açılı tipler kiremit (HIST) mikroskopi için ayrıntılı kurulum. Fotoğraf(a)ve şematik (B) HIST mikroskop sistemi. BF, çoklu bant geçiren Filtre; CL1-2, silindirik mercekler; DM, dikroik ayna; GM, galvo ayna; BF, bant geçiren Filtre; M1-7, aynalar; L1-4, lensler; SMF, tekli mod fiber; TL, tüp objektif. CIP, konjuge görüntü uçak; cBFP, Birleşik geri odak düzlemi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Döşeme bir sıkıştırma oranı ile aydınlatma 8. (A)floresan görüntü 3D hidrojel 20 nm boncuk. Ölçek çubuğu, 20 µm. (B) standart sapma projeksiyon A 10 veri noktalarıyla düzeltti, y yönünü boyunca. Kırmızı ok bir etkili aydınlatma genişliğini 12 µm. gösterir Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Ön panel denetimi ve görüntüleme yazılımı. (A) A ısmarlama LabVIEW program zaman uyumlu olarak denetler galvo ayna, sCMOS kamera başlangıç edinimi ve piezo sahne hareketi tarama. (B) fotoğraf makinesi satın alma ayarı kontrol paneli. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5. (A)DNA'epi ve HIST aydınlatmalı 3D hidrojel Atto647N resimleri etiketli. (B) smFISH 4 kullanarak EEF2 görüntülerini balık Epi ve HIST mikroskobu tarafından A549 hücreleri üzerinde sondalar. DAPI leke mavi renkle gösterilir. Ölçek çubukları, 20 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Bu protokol için iki önemli adım vardır. İlk adımda 3.3, olay ışın lens merkezinden geçer ve mükemmel havadar yuvarlak yüzey deseni tavanda oluşan sağlanması olan L4 uygun yerleşimdir. M5, L3, GM ve L2 de dahil olmak üzere tüm diğer optik bileşenler, L4 konumunu belirler. İkinci önemli adım eşitleme işlemidir. Odak arka plan dışı reddetmek için etkin piksel olan etkili algılama genişliği döşeme genişliği eşittir ışın süpürme ile eşitlenmelidir. Bu nedenle, bu döşeme kiriş (Adım 5.6) etkili aydınlatma genişliğini ölçmek gereklidir ve set kamera parametrelerini buna göre 6.4 içinde adım.
Çok büyük FOV ile görüntüleme, sunulan yöntem bir taraftan diğer tarafa göre artan bir arka plan gösterir. Bu aydınlatma farklı görüntüleme pozisyonlarda biraz değişmiş açılarla atfedilir. M5 yerine ikinci bir galvo yansıtmayı uygulama bu sorun zaman uyumlu olarak konumu ve tarama açısı11ayarlayarak daha önce gösterildiği şekilde azaltır. Hazır akromatik birini yerine bir telemerkeze tarama lens de yardımcı olacaktır. Ancak, bir bölümünü görüntüleme için < 8,080 µm2, tek galvo ayna süpürme yeterli. HIST mikroskobu görüntüleme derinliği bir sınırı vardır, ancak, ne zaman bir 12 µm döşeme kiriş ve NA 1,45 yağı daldırma objektif lens11ile 15 ~ µm Imaging iyi SBR elde etmek mümkün.
Bu protokol için biz bir ışın 8 döşeme kiriş yapmak için kullanılan sıkıştırma oranını. Daha ince bir aydınlatma HIST mikroskobu yüksek SBR, hangi-ebilmek var olmak için tek molekül doku11Imaging güçlü elde etmek için kullanılabilir. Geçerli ışın sıkıştırma oranı az photobleaching 3D görüntülemede Epi11' e göre gösterdi ise ancak, bu durumda, photobleaching etkisi bir artan uyarma yoğunluk tarafından dikkate alınmalıdır. Işık sayfalık mikroskoplar iki uygun yerleştirilmiş hedefleri ile karşılaştırıldığında, HIST mikroskobu uygulamak basit ve geleneksel örnek hazırlıkları ile uyumlu. Gelişmiş SBR ve büyük HIST mikroskobu ve FOV etkileşimleri ve birden fazla hücreyi tek biomolecules dinamikleri eğitimi için uygundur ve daha fazla kullanılabilir süper kararlılık düşsel ve tek molekül izleme.
Disclosures
Central Florida Üniversitesi bu yazıda açıklanan iş kapsayan bir patent başvurusu şikayetçi oldu.
Acknowledgments
Bu eser savunma ileri araştırma projeleri Ajansı (DARPA) (HR00111720066) ve Ulusal Bilim Vakfı (NSF) (1805200) tarafından desteklenmiştir. Michael Serge Andor teknolojisinde cömertçe sCMOS kamera ödünç verdiğin için teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-060-A-ML | Collimator |
| 1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-100-A-ML | L1,L2 |
| 1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-300-A-ML | TL |
| 1" Broadband Dielectric Mirrors | Thorlabs | BB1-E02-10 | M1~M7 |
| 1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1363RM-A | CL1 |
| 1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1695RM-A | CL2 |
| 1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-857 | For dichroic mirror mounting |
| 1" Threaded Cage Plate | Thorlabs | CP02 | For holding other lenses |
| 2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-150-A-ML | L3 |
| 2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-400-A-ML | L4 |
| 2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01 | For holding L4 |
| 2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01T | For holding L3 |
| 2% Bis Solution | Bio Rad | 64085292 | hydrogel component |
| 20 nm fluorescent beads | Thermo Fisher | F8782 | For testing imaging |
| 30 mm Cage Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KCB1 | For objective & camera mounting |
| 30mm Cage System Iris | Thorlabs | CP20S | |
| 3-Axis NanoMax Stage | Thorlabs | MAX311D | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad | 64148001 | hydrogel component |
| 405 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
| 50x TAE buffer | Bio-Rad | 161-0743 | hydrogel component |
| 561 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-DPL | |
| 638 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | hydrogel component |
| Beam alignment tool | custom made | ||
| BNC terminal blocks | Natural Instruments | BNC-2110 | |
| Cage plate with M9 x 0.5 internal threads | Thorlabs | CP1TM09 | For holding aspheric lens |
| Cage System Rods | Thorlabs | SR series | |
| Cell culture & smFISH | See a reference [11] | ||
| Double side tape | Scotch | 515182 | Flow chamber |
| Epoxy | Devcon | 14250 | Flow chamber |
| Galvo mirror | Thorlabs | GVS211 | GM |
| Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | |
| Half wave plate | Thorlabs | WPH10M-405/561/633 | Power adjustment |
| long-pass dichroic mirror | Chroma | T550lpxr | For combining lasers |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12549-3 | Flow chamber |
| Mikroskopische Deckglaser | Hecht Assistent | 990/5024 | Flow chamber |
| Mounted Frosted Glass Alignment Disk | Thorlabs | DG10-1500-H1-MD | For double pinhole system |
| Mounted rochester aspheric lens | Thorlabs | A230TM-A | |
| Multi-band dichroic mirror | Semrock | Di03-R405/488/561/635-t3 | DM; 3 mm thickness |
| Multi-band filter | Semrock | FF01-446/523/600/677-25 | BF |
| Multimode fiber | Thorlabs | M31L02 | MMF |
| N,N,N',N'-tetramethyl ethylenediamine | Sigma | T7024-25ML | hydrogel component |
| NI-DAQ board | Natural Instruments | PCI-6733 | |
| Ø1" Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KM100 | For holding mirrors |
| Objective lens | Olympus | PLANAPO N 60X | 60X 1.45NA oil |
| Pedestal Base Clamping Forks | Newport | 9916 | |
| Pedestal Pillar Posts | Thorlabs | RS1P8E | |
| Piezo controller | Thorlabs | BPC303 | |
| Polarized beam splitter | Thorlabs | PBS251 | For combining lasers |
| RMS-SM1 adapter | Thorlabs | SM1A3TS | For objective lens |
| Rod holder | custom made | ||
| Rotation cage mount | Thorlabs | RSP1/CRM1/CRM1P | For HWP & cylindrical lens mounting |
| sCMOS camera | Andor | Zyla-4.2P-CL10 | |
| Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | Beam collimation test |
| Single mode fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | SMF |
| SM1 Lens Tubes | Thorlabs | SM1S25 | For double pinhole system |
| SM1 Slotted Lens Tube | Thorlabs | SM1L30C | For double pinhole system |
| Stage mount | custom made | ||
| threaded fiber adapter | Thorlabs | SM1FC | |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | Fiber coupling |
References
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361, 880-887 (2018).
- Lerner, E., et al. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Forster resonance energy transfer. Science. 359, (2018).
- Raj, A., van Oudenaarden, A. Single-Molecule Approaches to Stochastic Gene Expression. Annual Review of Biophysics. 38, 255-270 (2009).
- Wilson, T. Resolution and optical sectioning in the confocal microscope. Journal of microscopy. 244, 113-121 (2011).
- Sase, I., Miyata, H., Corrie, J. E., Craik, J. S., Kinosita, K. Real time imaging of single fluorophores on moving actin with an epifluorescence microscope. Biophysical Journal. 69, 323-328 (1995).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nature Methods. 8, 1047 (2011).
- Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12, 641 (2015).
- Gustavsson, A. K., Petrov, P. N., Lee, M. Y., Shechtman, Y., Moerner, W. E. 3D single-molecule super-resolution microscopy with a tilted light sheet. Nature Communications. 9, 123 (2018).
- Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5, 159-161 (2008).
- Tang, J., Han, K. Y. Extended field-of-view single-molecule imaging by highly inclined swept illumination. Optica. 5, 1063-1069 (2018).
- Han, K. Y., Kim, S. K., Eggeling, C., Hell, S. W. Metastable Dark States Enable Ground State Depletion Microscopy of Nitrogen Vacancy Centers in Diamond with Diffraction-Unlimited Resolution. Nano Letters. 10, 3199-3203 (2010).
- Sinkó, J., Szabó, G., Erdélyi, M. Ray tracing analysis of inclined illumination techniques. Optics Express. 22, 18940-18948 (2014).
