Una instrucción detallada se describe en cómo construir una muy inclinada de barrido microscopio de azulejo (HIST) y su uso para la proyección de imagen de una sola molécula.
Proyección de imagen de una sola molécula ha avanzado grandemente nuestra comprensión de los mecanismos moleculares en estudios de biología. Sin embargo, ha sido difícil obtener imágenes de gran tamaño campo de visión y de alto contraste en los tejidos y células de espesor. Aquí, presentamos muy inclinada teja barrida (HIST) microscopía que supera este problema. Un par de lentes cilíndricas se implementó para generar un haz de excitación alargado que fue analizado en una gran superficie de proyección de imagen vía un espejo galvo rápido. Una configuración de 4f fue utilizada para colocar componentes ópticos. Una cámara científica semiconductor complementario de óxido metálico había detectado la señal de fluorescencia y bloquea el fondo fuera de foco con la ranura confocal dinámica sincronizada con el barrido del haz. Presentamos una instrucción paso a paso en la construcción del microscopio HIST con todos los componentes básicos.
Proyección de imagen de fluorescencia de una sola molécula desempeña un papel importante en muchos estudios biológicos que revelan ultraestructuras, dinámica y la cantidad de biomoléculas1,2,3. Sin embargo, ha sido difícil estudiar solo las moléculas dentro de células o tejidos. Mientras que la microscopía confocal proporciona alta capacidad de seccionamiento4, no es conveniente para la proyección de imagen de una sola molécula por photobleaching severa por la intensidad de excitación alta o baja velocidad de proyección de imagen. Microscopia de campo amplio utiliza iluminación más débil pero sufre de una pobre señal a fondo ratio (SBR)5. Microscopía de luz de hoja, por el contrario, podría demostrar buenas secciones y photobleaching baja6; sin embargo, la disposición apertura numérica (NA) grandemente está limitada por el requisito de objetivos colocados ortogonalmente7. Por otra parte, requiere iluminadores especiales y muestra cámaras8,9.
Por estas razones, la microscopia hoja óptica altamente inclinada y laminado (HILO) ha sido ampliamente utilizada para 3D sola molécula imagen10. Cuando una viga inclinada encuentra con una interfaz de dos medios (vidrio y agua, por ejemplo), el rayo se refracta conforme a la ley de Snell. Lo importante, la viga refractada es más delgada, y su grosor se describe como dz = R/tan(θ) donde R es el diámetro de la viga inclinada y θ es el ángulo de refracción del haz transmitido. Esta sencilla aplicación da como resultado una buena capacidad de seccionamiento. Sin embargo, esta relación indica que requiere de una iluminación fina (es decir, alta capacidad de seccionamiento) una R pequeña o una grande θ. Por ejemplo, cuando R = 20 μm y θ = 72 grados, uno puede obtener dz = 6,5 μm. Puesto que hay un límite práctico para aumentar el ángulo de refracción para la imagen profunda dentro de las células y evitar la reflexión interna total, hay un acoplamiento fuerte de la iluminación de diámetro y el espesor de la viga. Por esta razón, la proyección de imagen de HILO muestra una relativamente pequeño campo de visión (FOV) que limita mucho sus aplicaciones en imagen multicelular.
Recientemente, hemos superado este problema por microscopia altamente inclinada teja barrida (HIST) donde el FOV es disociado del espesor de la viga en una forma muy simple11. En primer lugar, se genera un haz de luz alargado en una dirección mediante un par de lentes cilíndricas. Este rayo, como un azulejo, produce una iluminación fina con dz ~ 4 μm mientras que su campo de visión es de 130 x 12 μm2. Entonces, el azulejo se barre a través de la muestra utilizando un espejo giratorio del galvo. Mientras tanto, la imagen de fluorescencia se graba en una cámara científica semiconductor complementario de óxido metálico (sCMOS) que filtra eficientemente fuera de enfoque fondo funcionando en un modo de obturador rodante que sirve de detección ajustable abertura confocal. De esta manera, HIST microscopía permite proyección de imagen de una sola molécula con un mayor campo de visión (~ 130 x 130 μm2) y una sensibilidad más fina que la proyección de imagen de HILO. Aplicamos esta imagen nueva técnica para detectar las transcripciones del RNA con una sola sonda en las células o con unas puntas de prueba en los tejidos de cerebro de ratón, que tiene gran potencial para estudiar enfermedades y expresión génica. A diferencia de otros enfoques, HIST emplea sólo un objetivo de apertura numérica alta sola sin un iluminador adicional u objetivos de detección remota y es totalmente compatible con los microscopios invertidos. Estas ventajas junto con un FOV grande y alto contraste hará HIST microscopia una herramienta importante en biología y medicina. Presentamos instrucciones detalladas con respecto a la instrumentación del microscopio HIST y cómo probar y calibrar su funcionamiento como abajo.
Hay dos pasos críticos en este protocolo. La primera es la colocación adecuada de L4 en el paso 3.3, asegurando que el rayo incidente pasa por el centro de la lente y se forma un patrón perfecto disco luminoso en el techo. La posición de L4 determina la ubicación de todos los otros componentes ópticos, incluyendo GM, M5, L3 y L2. El segundo paso crítico es el proceso de sincronización. Para rechazar la salida del fondo focus, píxeles activos cuya anchura eficaz de detección es igual a la anchura de la baldosa deben ser sincronizados con el barrido del haz. Por lo tanto, es necesario medir la anchura de iluminación eficaz de un azulejo de la viga (paso 5.6) y parámetros de la cámara ajustado en consecuencia paso 6.4.
Cuando proyección de imagen con gran campo de visión, el método presentado muestra un fondo mayor en un lado respecto al otro lado. Esto se atribuye a ángulos ligeramente alterados de iluminación en diferentes posiciones de proyección de imagen. Implementación de un segundo espejo galvo en vez de M5 alivia este problema como lo demuestra antes de forma sincrónica ajustando la posición y el ángulo barrido11. En lugar de Dobletes acromáticos estándar, una lente de telecentric la exploración será también útil. Sin embargo, para un área de la proyección de imagen < 8.080 μm2, galvo solo barrido del espejo era suficiente. HIST microscopia tiene un límite de la profundidad de la proyección de imagen, sin embargo, es capaz de obtener una buena SBR cuando proyección de imagen a ~ 15 μm con un haz de azulejo 12 μm y un NA 1.45 aceite inmersión objetivo11.
En este protocolo, se utilizó una relación de compresión de la viga de 8 para hacer una viga de azulejo. Una iluminación más delgada puede utilizarse en HIST microscopia para lograr mayor SBR, que pueden ser de gran alcance para el tejido de una sola molécula de11. Sin embargo, en este caso, efecto de fotoblanqueo se debe considerar por una intensidad de excitación creciente mientras que la actual relación de compresión de la viga reducida fotoblanqueo en imágenes en 3D en comparación con el Epi11. Comparado con microscopios de luz-hoja con dos objetivos colocados ortogonalmente, HIST microscopia es simple de implementar y compatible con las preparaciones de muestras convencionales. El SBR mayor FOV grande de microscopía HIST es adecuado para el estudio de las interacciones y las dinámicas de las biomoléculas individuales en varias celdas y puede utilizarse más en proyección de imagen de súper resolución y seguimiento de una sola molécula.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por defensa avanzada investigación proyectos agencia (DARPA) (HR00111720066) y National Science Foundation (NSF) (1805200). Agradecemos a Michael Serge en Andor Technology para prestar generosamente la cámara sCMOS.
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-060-A-ML | Collimator |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-100-A-ML | L1,L2 |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-300-A-ML | TL |
1" Broadband Dielectric Mirrors | Thorlabs | BB1-E02-10 | M1~M7 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1363RM-A | CL1 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1695RM-A | CL2 |
1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-857 | For dichroic mirror mounting |
1" Threaded Cage Plate | Thorlabs | CP02 | For holding other lenses |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-150-A-ML | L3 |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-400-A-ML | L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01 | For holding L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01T | For holding L3 |
2% Bis Solution | Bio Rad | 64085292 | hydrogel component |
20 nm fluorescent beads | Thermo Fisher | F8782 | For testing imaging |
30 mm Cage Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KCB1 | For objective & camera mounting |
30mm Cage System Iris | Thorlabs | CP20S | |
3-Axis NanoMax Stage | Thorlabs | MAX311D | |
40% Acrylamide Solution | Bio Rad | 64148001 | hydrogel component |
405 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
50x TAE buffer | Bio-Rad | 161-0743 | hydrogel component |
561 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-DPL | |
638 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | hydrogel component |
Beam alignment tool | custom made | ||
BNC terminal blocks | Natural Instruments | BNC-2110 | |
Cage plate with M9 x 0.5 internal threads | Thorlabs | CP1TM09 | For holding aspheric lens |
Cage System Rods | Thorlabs | SR series | |
Cell culture & smFISH | See a reference [11] | ||
Double side tape | Scotch | 515182 | Flow chamber |
Epoxy | Devcon | 14250 | Flow chamber |
Galvo mirror | Thorlabs | GVS211 | GM |
Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | |
Half wave plate | Thorlabs | WPH10M-405/561/633 | Power adjustment |
long-pass dichroic mirror | Chroma | T550lpxr | For combining lasers |
Microscope slides | Fisherbrand | 12549-3 | Flow chamber |
Mikroskopische Deckglaser | Hecht Assistent | 990/5024 | Flow chamber |
Mounted Frosted Glass Alignment Disk | Thorlabs | DG10-1500-H1-MD | For double pinhole system |
Mounted rochester aspheric lens | Thorlabs | A230TM-A | |
Multi-band dichroic mirror | Semrock | Di03-R405/488/561/635-t3 | DM; 3 mm thickness |
Multi-band filter | Semrock | FF01-446/523/600/677-25 | BF |
Multimode fiber | Thorlabs | M31L02 | MMF |
N,N,N',N'-tetramethyl ethylenediamine | Sigma | T7024-25ML | hydrogel component |
NI-DAQ board | Natural Instruments | PCI-6733 | |
Ø1" Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KM100 | For holding mirrors |
Objective lens | Olympus | PLANAPO N 60X | 60X 1.45NA oil |
Pedestal Base Clamping Forks | Newport | 9916 | |
Pedestal Pillar Posts | Thorlabs | RS1P8E | |
Piezo controller | Thorlabs | BPC303 | |
Polarized beam splitter | Thorlabs | PBS251 | For combining lasers |
RMS-SM1 adapter | Thorlabs | SM1A3TS | For objective lens |
Rod holder | custom made | ||
Rotation cage mount | Thorlabs | RSP1/CRM1/CRM1P | For HWP & cylindrical lens mounting |
sCMOS camera | Andor | Zyla-4.2P-CL10 | |
Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | Beam collimation test |
Single mode fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | SMF |
SM1 Lens Tubes | Thorlabs | SM1S25 | For double pinhole system |
SM1 Slotted Lens Tube | Thorlabs | SM1L30C | For double pinhole system |
Stage mount | custom made | ||
threaded fiber adapter | Thorlabs | SM1FC | |
Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | Fiber coupling |