详细介绍了如何建立高倾斜的扫描瓷砖 (HIST) 显微镜及其在单分子成像中的应用。
单分子成像极大地促进了我们对生物学研究中分子机制的理解。然而, 在厚细胞和组织中获得大的视场、高对比度图像一直是一项挑战。在这里, 我们引入高度倾斜的扫描瓷砖 (HIST) 显微镜, 以克服这个问题。为了产生一个拉长的激发光束, 通过快速的 galvo 反射镜在一个大的成像区域上进行扫描, 实现了一对圆柱形透镜。使用了 4f配置来定位光学元件。一个科学的互补金属氧化物半导体相机检测到荧光信号, 并通过与光束清扫同步的动态共聚焦缝隙阻断了焦距外的背景。我们提出了一个逐步建设 HIST 显微镜与所有基本组件的指导。
单分子荧光成像在揭示超微结构、动力学和生物分子1, 2,3的数量的许多生物学研究中发挥着重要作用。然而, 研究细胞或组织内的单分子一直是一个挑战。共聚焦显微镜提供了较高的切片能力4, 但由于高激发强度或成像速度较慢, 严重的光漂白, 不适合单分子成像。Widefield 显微镜使用较弱的照明, 但由于信号与背景的比率 (SBR)5的缺点。而光片显微镜则能表现出良好的切片和较低的光漂白6;然而, 现有的数值孔径 (NA) 在很大程度上受到正交放置目标7要求的限制。或者, 它需要特殊的照明器和样品室8,9。
由于这些原因, 高倾斜层压光学片 (HILO) 显微镜已被广泛用于三维单分子成像10。当斜梁遇到两个介质 (例如玻璃和水) 的界面时, 光束会根据 Snell 定律进行折射。重要的是, 折射光束变得更薄, 其厚度被描述为 dz = rp (), 其中 R 是斜梁的直径, 是透射光束的折射角。这个简单的实现产生了良好的切片能力。然而, 这种关系表明, 薄照明 (即高切片能力) 需要一个小 R 和/或一个大的。例如, 当 R = 20μm 和 = 72 度时, 可以获得 dz = 6.5μm。由于增加折射角以成像细胞内部深处以避免总内部反射存在实际限制, 因此照明直径与光束厚度有很强的耦合。因此, HILO 成像显示了一个相对较小的视场 (FOV), 极大地限制了其在多细胞成像中的应用。
最近, 我们已经克服了这个问题的高度倾斜扫瓦 (HIST) 显微镜, 其中 FOV 解耦光束厚度在一个非常简单的方式11。首先, 在一个方向拉长的光束是通过一对圆柱形透镜产生的。这种光束被称为瓷砖, 产生 dz ~ 4μm 的薄照明, 而其 FOV 为 130 x 12μm2。然后, 瓷砖被扫过样品使用旋转的 galvo 镜子。同时, 荧光图像被记录在科学的互补金属氧化物半导体 (sCMOS) 相机上, 该相机通过在可调谐共聚焦缝隙检测的滚动快门模式下工作, 有效地过滤出焦距以外的背景。通过这种方式, HIST 显微镜使单分子成像具有比 HILO 成像更大的视野 (~ 130 x 130 微米2) 和更薄的照明。我们应用这项新的成像技术, 在细胞中使用单个探针或在小鼠脑组织中使用少量探针检测 RNA 转录, 这对研究基因表达和疾病具有巨大的潜力。与其他方法不同, HIST 只使用单个高数值孔径目标, 而不使用额外的照明器或远程检测目标, 并且与倒置显微镜完全兼容。这些优势以及大型 FOV 和高对比度将使 HIST 显微镜成为生物学和医学领域的一个突出工具。我们提供有关 HIST 显微镜仪器的详细说明, 以及如何测试和校准其性能, 如下所示。
此协议中有两个关键步骤。第一个是在步骤3.3 中正确放置 L4, 确保入射光束穿过镜头的中心, 并在天花板上形成一个完美的艾瑞圆盘图案。L4 的位置决定了所有其他光学元件的位置, 包括 M5、L3、GM 和 L2。第二个关键步骤是同步过程。要拒绝焦点外背景, 有效检测宽度等于磁贴宽度的活动像素应与光束扫描同步。因此, 有必要测量瓷砖光束 (步骤 5.6) 的有效照明宽度, 并在步骤6.4 中相应地设置摄像机参数。
当使用非常大的 FOV 进行成像时, 所提出的方法显示, 与另一侧相比, 一侧的背景增加。这是由于不同成像位置的照明角度稍有变化。实现第二个半镜而不是 M5 通过同步调整位置和扫描角度11来缓解以前所表明的这一问题。而不是现成的无色双片, 远心扫描镜头也将是有帮助的。然而, 对于成像面积和 lt;8,080 μm 2,单半镜扫描就足够了。HIST 显微镜具有成像深度的限制, 但是, 当使用12微米的瓦束和 NA 1.45 油浸没物镜11进行成像时, 它能够获得良好的 SBR。
在该协议中, 我们使用8的光束压缩比来制作磁瓦光束。在 HIST 显微镜下, 可以使用更薄的照明来实现更高的 SBR, 这可能对单分子组织成像有很强的功能。然而, 在这种情况下, 光漂白效应应考虑到增加的激发强度, 而电流光束压缩比显示, 在三维成像中, 与 Epi11相比, 光漂白效果有所降低。与具有两个正交放置目标的光片显微镜相比, HIST 显微镜易于实现, 并与传统样品制备相兼容。HIST 显微镜增强 SBR 和大型 FOV 适用于研究多细胞中单个生物分子的相互作用和动力学, 可进一步用于超分辨率成像和单分子跟踪。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了国防高级研究计划局 (HR00111712666) 和国家科学基金会 (1805200) 的支持。我们感谢迈克尔·塞尔格在 Andor 技术慷慨地借出的 sCMOS 相机。
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-060-A-ML | Collimator |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-100-A-ML | L1,L2 |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-300-A-ML | TL |
1" Broadband Dielectric Mirrors | Thorlabs | BB1-E02-10 | M1~M7 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1363RM-A | CL1 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1695RM-A | CL2 |
1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-857 | For dichroic mirror mounting |
1" Threaded Cage Plate | Thorlabs | CP02 | For holding other lenses |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-150-A-ML | L3 |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-400-A-ML | L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01 | For holding L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01T | For holding L3 |
2% Bis Solution | Bio Rad | 64085292 | hydrogel component |
20 nm fluorescent beads | Thermo Fisher | F8782 | For testing imaging |
30 mm Cage Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KCB1 | For objective & camera mounting |
30mm Cage System Iris | Thorlabs | CP20S | |
3-Axis NanoMax Stage | Thorlabs | MAX311D | |
40% Acrylamide Solution | Bio Rad | 64148001 | hydrogel component |
405 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
50x TAE buffer | Bio-Rad | 161-0743 | hydrogel component |
561 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-DPL | |
638 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | hydrogel component |
Beam alignment tool | custom made | ||
BNC terminal blocks | Natural Instruments | BNC-2110 | |
Cage plate with M9 x 0.5 internal threads | Thorlabs | CP1TM09 | For holding aspheric lens |
Cage System Rods | Thorlabs | SR series | |
Cell culture & smFISH | See a reference [11] | ||
Double side tape | Scotch | 515182 | Flow chamber |
Epoxy | Devcon | 14250 | Flow chamber |
Galvo mirror | Thorlabs | GVS211 | GM |
Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | |
Half wave plate | Thorlabs | WPH10M-405/561/633 | Power adjustment |
long-pass dichroic mirror | Chroma | T550lpxr | For combining lasers |
Microscope slides | Fisherbrand | 12549-3 | Flow chamber |
Mikroskopische Deckglaser | Hecht Assistent | 990/5024 | Flow chamber |
Mounted Frosted Glass Alignment Disk | Thorlabs | DG10-1500-H1-MD | For double pinhole system |
Mounted rochester aspheric lens | Thorlabs | A230TM-A | |
Multi-band dichroic mirror | Semrock | Di03-R405/488/561/635-t3 | DM; 3 mm thickness |
Multi-band filter | Semrock | FF01-446/523/600/677-25 | BF |
Multimode fiber | Thorlabs | M31L02 | MMF |
N,N,N',N'-tetramethyl ethylenediamine | Sigma | T7024-25ML | hydrogel component |
NI-DAQ board | Natural Instruments | PCI-6733 | |
Ø1" Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KM100 | For holding mirrors |
Objective lens | Olympus | PLANAPO N 60X | 60X 1.45NA oil |
Pedestal Base Clamping Forks | Newport | 9916 | |
Pedestal Pillar Posts | Thorlabs | RS1P8E | |
Piezo controller | Thorlabs | BPC303 | |
Polarized beam splitter | Thorlabs | PBS251 | For combining lasers |
RMS-SM1 adapter | Thorlabs | SM1A3TS | For objective lens |
Rod holder | custom made | ||
Rotation cage mount | Thorlabs | RSP1/CRM1/CRM1P | For HWP & cylindrical lens mounting |
sCMOS camera | Andor | Zyla-4.2P-CL10 | |
Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | Beam collimation test |
Single mode fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | SMF |
SM1 Lens Tubes | Thorlabs | SM1S25 | For double pinhole system |
SM1 Slotted Lens Tube | Thorlabs | SM1L30C | For double pinhole system |
Stage mount | custom made | ||
threaded fiber adapter | Thorlabs | SM1FC | |
Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | Fiber coupling |