एक विस्तृत अनुदेश एक उच्च झुका हुआ टाइल (HIST) माइक्रोस्कोप और एकल अणु इमेजिंग के लिए इसके उपयोग का निर्माण करने के लिए कैसे पर वर्णन किया गया है ।
एकल अणु इमेजिंग ने जैविक अध्ययनों में आणविक तंत्रों की हमारी समझ को काफी उन्नत किया है । हालांकि, यह बड़े क्षेत्र के देखने के लिए चुनौतीपूर्ण है, मोटी कोशिकाओं और ऊतकों में उच्च विपरीत छवियों । यहां, हम अत्यधिक इच्छुक बह टाइल (HIST) माइक्रोस्कोपी कि इस समस्या को काबू करने परिचय । बेलनाकार लेंस की एक जोड़ी एक लंबी उत्तेजना बीम कि एक तेजी से galvo दर्पण के माध्यम से एक बड़े इमेजिंग क्षेत्र पर स्कैन किया गया उत्पंन करने के लिए लागू किया गया था । एक 4एफ विंयास ऑप्टिकल घटकों की स्थिति के लिए इस्तेमाल किया गया था । एक वैज्ञानिक पूरक धातु-ऑक्साइड सेमीकंडक्टर कैमरा ने प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाया और बीम के साथ सिंक्रनाइज़ गतिशील संनाभि झिरी के साथ बाहर की फोकस पृष्ठभूमि को अवरुद्ध किया । हम सभी बुनियादी घटकों के साथ हिस्ट माइक्रोस्कोप के निर्माण पर एक कदम दर कदम निर्देश प्रस्तुत करते हैं ।
एकल अणु प्रतिदीप्ति इमेजिंग कई जैविक अध्ययनों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है जो ultrastructures, गतिशीलता और जैव अणुओं की मात्रा1,2,3प्रकट करते हैं । हालांकि, यह कोशिकाओं या ऊतकों के अंदर एकल अणुओं का अध्ययन करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो गया है । जबकि संनाभि माइक्रोस्कोपी उच्च परिच्छेदन क्षमता4प्रदान करता है, यह उच्च उत्तेजना तीव्रता या धीमी इमेजिंग गति से गंभीर photoब्लीचिंग के कारण एकल अणु इमेजिंग के लिए उपयुक्त नहीं है । Widefield माइक्रोस्कोपी कमजोर रोशनी का उपयोग करता है, लेकिन पृष्ठभूमि अनुपात (SBR)5के लिए एक गरीब संकेत से ग्रस्त है । प्रकाश-चादर माइक्रोस्कोपी, दूसरी ओर, अच्छा परिच्छेदन और कम photoब्लीचिंग6दिखा सकता है; हालांकि, उपलब्ध संख्यात्मक एपर्चर (एनए) बहुत orthogonally रखा उद्देश्य7की आवश्यकता द्वारा सीमित है । वैकल्पिक रूप से, यह विशेष प्रकाशक और नमूना मंडलों8,9की आवश्यकता है ।
इन कारणों के लिए, उच्च झुका और परतदार ऑप्टिकल शीट (HILO) माइक्रोस्कोपी व्यापक रूप से 3 डी एकल अणु इमेजिंग10के लिए इस्तेमाल किया गया है । जब एक झुका बीम दो मीडिया के एक अंतरफलक के सामने (कांच और पानी, उदाहरण के लिए), किरण है Snell कानून के अनुसार पुनः खंडित है । महत्वपूर्ण रूप से, रिफ्रैक्टेड बीम पतले हो जाता है, और इसकी मोटाई dz = R/tan (θ) के रूप में वर्णित है जहां R प्रवृत्त बीम का व्यास है और θ पारेषित बीम का अपवर्तन कोण है । यह सरल कार्यांवयन एक अच्छा परिच्छेदन क्षमता में परिणाम है । फिर भी, यह संबंध इंगित करता है कि एक पतली रोशनी (यानी, उच्च परिच्छेदन क्षमता) एक छोटे R और/या एक बड़े θ की आवश्यकता है । उदाहरण के लिए, जब R = 20 μm और θ = ७२ अंश, एक dz = ६.५ μm प्राप्त कर सकते हैं । के बाद से वहां के लिए अपवर्तन कोण में वृद्धि करने के लिए एक व्यावहारिक सीमा है ताकि गहरी छवि के अंदर कोशिकाओं और कुल आंतरिक प्रतिबिंब से बचने के लिए, वहां एक मजबूत युग्मन प्रकाश व्यास और बीम मोटाई की है । इस कारण से, HILO इमेजिंग एक अपेक्षाकृत छोटे क्षेत्र के दृश्य (FOV) है कि बहुत बहुकोशिकीय इमेजिंग में अपने अनुप्रयोगों को प्रतिबंधित दिखाता है ।
हाल ही में, हम अत्यधिक इच्छुक बह टाइल (HIST) माइक्रोस्कोपी जहां FOV एक बहुत ही सरल तरीके से11बीम मोटाई से decoupled है द्वारा इस समस्या को दूर किया है । सबसे पहले, एक दिशा में लम्बी बीम बेलनाकार लेंस की एक जोड़ी के माध्यम से उत्पन्न होता है । इस बीम, एक टाइल के रूप में कहा जाता है, dz के साथ एक पतली रोशनी का उत्पादन ~ 4 μm जबकि इसके FOV १३० x 12 μm2है । फिर, टाइल एक घूर्णन galvo दर्पण का उपयोग कर नमूना भर में बह रहा है । इस बीच, प्रतिदीप्ति छवि एक वैज्ञानिक पूरक धातु-ऑक्साइड सेमीकंडक्टर (scmos) कैमरा है कि फिल्टर कुशलता से बाहर का ध्यान केंद्रित पृष्ठभूमि में एक रोलिंग शटर मोड जो स्वरित्र संनाभि भट्ठा का पता लगाने के रूप में कार्य करता है पर दर्ज की गई है । इस तरह, HIST माइक्रोस्कोपी देखने का एक बड़ा क्षेत्र के साथ एकल अणु इमेजिंग सक्षम बनाता है (~ १३० x १३० μm2) और hilo इमेजिंग से एक पतली रोशनी । हम इस नए इमेजिंग तकनीक कोशिकाओं में एक जांच के साथ या माउस मस्तिष्क के ऊतकों, जो जीन अभिव्यक्ति और रोगों के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण क्षमता है में कुछ जांच के साथ आरएनए टेप का पता लगाने के लिए आवेदन किया । अन्य दृष्टिकोणों के विपरीत, HIST एक अतिरिक्त प्रकाशक या दूरदराज के पता लगाने के उद्देश्यों के बिना केवल एक ही उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य कार्यरत हैं और उल्टे सूक्ष्मदर्शी के साथ पूरी तरह से संगत है । एक बड़े FOV और उच्च कंट्रास्ट के साथ साथ ये लाभ जीव विज्ञान और चिकित्सा में एक प्रमुख उपकरण HIST माइक्रोस्कोपी कर देगा । हम HIST माइक्रोस्कोप के इंस्ट्रूमेंटेशन के बारे में विस्तृत निर्देश मौजूद है, और कैसे परीक्षण और नीचे के रूप में अपने प्रदर्शन जांचना ।
इस प्रोटोकॉल में दो महत्वपूर्ण चरण हैं । पहले एक कदम ३.३ में L4 के उचित स्थान है, यह सुनिश्चित करना है कि घटना बीम लेंस के केंद्र के माध्यम से गुजरता है और एक परिपूर्ण Airy डिस्क पैटर्न छत पर बना है । L4 की स्थिति M5, L3, जीएम और L2 सहित अंय सभी ऑप्टिकल घटकों की नियुक्ति निर्धारित करता है । दूसरा महत्वपूर्ण चरण सिंक्रनाइज़ेशन प्रक्रिया है । फोकस पृष्ठभूमि से बाहर अस्वीकार करने के लिए, सक्रिय पिक्सेल जिसका प्रभावी पता लगाना चौड़ाई टाइल चौड़ाई के बराबर है बीम झाडू के साथ सिंक्रनाइज़ किया जाना चाहिए । इसलिए, यह एक टाइल बीम के प्रभावी रोशनी की चौड़ाई को मापने के लिए आवश्यक है (चरण ५.६) और सेट कैमरा पैरामीटर तदनुसार चरण ६.४ में ।
जब बहुत बड़ी FOV के साथ इमेजिंग, प्रस्तुत विधि एक पक्ष में दूसरी तरफ की तुलना में एक वृद्धि की पृष्ठभूमि से पता चलता है । यह अलग इमेजिंग पदों पर रोशनी के थोड़ा बदल कोण के लिए जिंमेदार ठहराया है । एक दूसरे galvo दर्पण के बजाय M5 को लागू करने के रूप में इस समस्या को alleviates से पहले तुल्यरूप से स्थिति और स्कैनिंग कोण11समायोजन द्वारा प्रदर्शन किया । इसके बजाय ऑफ-द-शेल्फ अक्रोमेटिक doublets, एक टेलीकेंद्रिक स्कैन लेंस भी मददगार होगा । हालांकि, इमेजिंग के लिए < 8080 μm2, एकल galvo दर्पण व्यापक एक क्षेत्र के लिए पर्याप्त था । HIST माइक्रोस्कोपी इमेजिंग गहराई की एक सीमा है, तथापि, यह एक अच्छा SBR जब इमेजिंग अप करने के लिए प्राप्त करने में सक्षम है ~ 15 μm एक 12 μm टाइल बीम और एक NA १.४५ तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस11के साथ ।
इस प्रोटोकॉल में, हम एक टाइल बीम बनाने के लिए 8 के एक बीम संपीड़न अनुपात का इस्तेमाल किया । एक पतली रोशनी HIST माइक्रोस्कोपी में इस्तेमाल किया जा सकता है उच्च SBR, जो एकल अणु ऊतक इमेजिंग11के लिए शक्तिशाली हो सकता है प्राप्त करने के लिए । हालांकि, इस मामले में, photoब्लीचिंग प्रभाव एक वृद्धि की उत्तेजना तीव्रता द्वारा विचार किया जाना चाहिए, जबकि वर्तमान बीम संपीड़न अनुपात 3 पी ईपीआई की तुलना में 3dइमेजिंग में कम photoब्लीचिंग दिखाया । दो orthogonally रखा उद्देश्यों के साथ प्रकाश की चादर माइक्रोस्कोप की तुलना में, HIST माइक्रोस्कोपी को लागू करने और पारंपरिक नमूना तैयारी के साथ संगत करने के लिए सरल है । Hist माइक्रोस्कोपी का बढ़ाया sbr और बड़े fov एकाधिक कोशिकाओं में एकल जैव अणुओं की बातचीत और गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है और सुपर-रेजोल्यूशन इमेजिंग और एकल अणु ट्रैकिंग में आगे इस्तेमाल किया जा सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को डिफेंस एडवांस्ड रिसर्च प्रोजेक्ट्स एजेंसी (DARPA) (HR00111720066) और नेशनल साइंस फाउंडेशन (NSF) (१८०५२००) ने सपोर्ट किया था । हम उदारता से sCMOS कैमरा उधार के लिए Andor प्रौद्योगिकी में माइकल सर्ज धंयवाद ।
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-060-A-ML | Collimator |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-100-A-ML | L1,L2 |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-300-A-ML | TL |
1" Broadband Dielectric Mirrors | Thorlabs | BB1-E02-10 | M1~M7 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1363RM-A | CL1 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1695RM-A | CL2 |
1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-857 | For dichroic mirror mounting |
1" Threaded Cage Plate | Thorlabs | CP02 | For holding other lenses |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-150-A-ML | L3 |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-400-A-ML | L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01 | For holding L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01T | For holding L3 |
2% Bis Solution | Bio Rad | 64085292 | hydrogel component |
20 nm fluorescent beads | Thermo Fisher | F8782 | For testing imaging |
30 mm Cage Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KCB1 | For objective & camera mounting |
30mm Cage System Iris | Thorlabs | CP20S | |
3-Axis NanoMax Stage | Thorlabs | MAX311D | |
40% Acrylamide Solution | Bio Rad | 64148001 | hydrogel component |
405 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
50x TAE buffer | Bio-Rad | 161-0743 | hydrogel component |
561 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-DPL | |
638 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | hydrogel component |
Beam alignment tool | custom made | ||
BNC terminal blocks | Natural Instruments | BNC-2110 | |
Cage plate with M9 x 0.5 internal threads | Thorlabs | CP1TM09 | For holding aspheric lens |
Cage System Rods | Thorlabs | SR series | |
Cell culture & smFISH | See a reference [11] | ||
Double side tape | Scotch | 515182 | Flow chamber |
Epoxy | Devcon | 14250 | Flow chamber |
Galvo mirror | Thorlabs | GVS211 | GM |
Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | |
Half wave plate | Thorlabs | WPH10M-405/561/633 | Power adjustment |
long-pass dichroic mirror | Chroma | T550lpxr | For combining lasers |
Microscope slides | Fisherbrand | 12549-3 | Flow chamber |
Mikroskopische Deckglaser | Hecht Assistent | 990/5024 | Flow chamber |
Mounted Frosted Glass Alignment Disk | Thorlabs | DG10-1500-H1-MD | For double pinhole system |
Mounted rochester aspheric lens | Thorlabs | A230TM-A | |
Multi-band dichroic mirror | Semrock | Di03-R405/488/561/635-t3 | DM; 3 mm thickness |
Multi-band filter | Semrock | FF01-446/523/600/677-25 | BF |
Multimode fiber | Thorlabs | M31L02 | MMF |
N,N,N',N'-tetramethyl ethylenediamine | Sigma | T7024-25ML | hydrogel component |
NI-DAQ board | Natural Instruments | PCI-6733 | |
Ø1" Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KM100 | For holding mirrors |
Objective lens | Olympus | PLANAPO N 60X | 60X 1.45NA oil |
Pedestal Base Clamping Forks | Newport | 9916 | |
Pedestal Pillar Posts | Thorlabs | RS1P8E | |
Piezo controller | Thorlabs | BPC303 | |
Polarized beam splitter | Thorlabs | PBS251 | For combining lasers |
RMS-SM1 adapter | Thorlabs | SM1A3TS | For objective lens |
Rod holder | custom made | ||
Rotation cage mount | Thorlabs | RSP1/CRM1/CRM1P | For HWP & cylindrical lens mounting |
sCMOS camera | Andor | Zyla-4.2P-CL10 | |
Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | Beam collimation test |
Single mode fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | SMF |
SM1 Lens Tubes | Thorlabs | SM1S25 | For double pinhole system |
SM1 Slotted Lens Tube | Thorlabs | SM1L30C | For double pinhole system |
Stage mount | custom made | ||
threaded fiber adapter | Thorlabs | SM1FC | |
Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | Fiber coupling |