상세한 지시는 타일 (HIST) 현미경 및 단일 분자 이미징에 대 한 용법을 휩 쓸 높은 경사를 구축 하는 방법에 설명 되어 있습니다.
단일 분자 이미징 크게 생물 학적 연구에 분자 메커니즘에 대 한 우리의 이해를 전진 했다. 그러나, 그것은 두꺼운 세포와 조직에 큰 보기의 필드, 높은 콘트라스트 이미지를 얻기 위해 도전 하고있다. 이 문제를 극복 하는 매우 경사 스윕된 타일 (HIST) 현미경 검사 법을 소개 합니다. 한 쌍의 원통형 렌즈 빠른 galvo 거울을 통해 큰 이미징 영역 검색 길쭉한 여기 빔을 생성 하기 구현 되었습니다. 4f 구성 광학 부품 위치 사용 되었다. 과학적인 보완 금속-산화물 반도체 카메라 형광 신호를 감지 하 고 동적 confocal 슬릿 빔 연소와 함께 동기화와 함께 밖으로의 초점 배경 차단. 우리는 모든 기본 구성 요소와 HIST 현미경 건물에 단계별로 지침 제시.
단일 분자 형광 이미징 ultrastructures, 역학 및 생체1,2,3의 수량을 공개 하는 많은 생물학 연구에서 중요 한 역할을 한다. 그러나, 그것은 세포 또는 조직 내 단일 분자를 공부 하 도전 하고있다. Confocal 현미경 검사 법에는 높은 단면 기능4제공 한다, 때문에 높은 자극 강도 또는 이미징 저속에 의해 심각한 photobleaching 단일-분자 이미징 적당 하다. Widefield 현미경 약한 조명 사용 하지만 배경 비율 (SBR)5가난한 신호에서 겪고 있다. 좋은 단면화 및 낮은 photobleaching6; 빛 시트 현미경 검사 법, 다른 한편으로, 보여줄 수 있는 그러나, 사용할 수 있는 수 가늠 구멍 (NA) 기가 배치 목표7의 요구에 의해 크게 제한 됩니다. 또는, 특별 한 조명 기 및 샘플 챔버8,9필요합니다.
이러한 이유로, 매우 경사 하 고 적 층 광학 시트 (힐로) 현미경은 3D 단일 분자 이미징10널리 사용 되었습니다. 경사 빔 (유리 및 예 물) 두 미디어의 인터페이스를 발견 하면 빔 Snell의 법률에 따라 굴절 이다. 중요 한 것은, 굴절된 빔 얇은, 도착 하 고 두께 dz로 설명 = R/tan(θ) R은 경사 빔 직경 및 θ 전송된 광선의 굴절 각도입니다. 이 간단한 구현 좋은 단면 기능에서 결과. 그럼에도 불구 하 고,이 관계는 얇은 조명 (즉, 높은 단면 기능) 필요한 작은 R 또는 큰 θ 나타냅니다. 예를 들어, R = 20 µ m와 θ = 72도, 하나 dz를 얻을 수 있습니다 6.5 µ m =. 깊은 셀 안에 이미지 하 고 총 내부 반사를 피하기 위해 굴절 각도 증가 하는 실제적인 제한 때문에, 조명 직경 및 빔 두께의 강한 커플링이 있다. 이러한 이유로 힐로 이미징은 상대적으로 작은-의-시야 (FOV) 크게 다세포 이미징에서 응용 프로그램을 제한 하는 표시 됩니다.
최근에, 우리는 FOV는 매우 간단한 방법11빔 두께에서 분리는 매우 경사 스윕된 타일 (HIST) 현미경으로이 문제를 극복 했다. 첫째, 한 방향으로 길쭉한 빔 원통형 렌즈의 쌍을 통해 생성 됩니다. 타일로 불리는이 빔 생성 dz와 얇은 조명 ~ 4 µ m의 FOV는 130 x 12 µ m2. 다음, 타일은 회전 galvo 거울을 사용 하 여 샘플 전역 휩 쓸. 한편, 형광 이미지 롤링 셔터 모드 가변 confocal 슬릿 탐지 역할에서 작동 하 여 효율적으로 밖으로의 초점 배경 필터 과학적 상보성 금속 산화물 반도체 (sCMOS) 카메라에 기록 됩니다. 이 방법에서는, HIST 현미경 단일 분자 이미징을 큰 필드의 보기 (~ 130 x 130 µ m2)와 힐로 영상 보다 얇은 조명 수 있습니다. 우리는이 새로운 이미징 유전자 발현을 연구 하 고 질병에 대 한 상당한 잠재력을가지고 있는 셀에 단일 프로브 또는 마우스 뇌 조직에 몇 가지 프로브 RNA 사본을 감지 기술 적용. 다른 접근 달리 HIST 추가 조명 없이 단일 높은 수 가늠 구멍 목표 또는 원격 탐지 목표를 사용 하 여 그리고 거꾸로 현미경와 완벽 하 게 호환 됩니다. 이러한 장점은 큰 FOV와 고대비 HIST를 만들 것 이다 현미경 검사 법 생물학과 약에서 눈에 띄는 도구. 선물이 HIST 현미경 및 테스트 하 고 아래에로 그 성능을 교정 방법의 계측에 관한 자세한 내용은.
이 프로토콜에서 두 가지 중요 한 단계가 있습니다. 첫 번째 단계 3.3, 입사 빔 렌즈의 센터를 통해 전달 하 고 완벽 한 통풍 디스크 패턴은 천장에 형성에서 L4의 적절 한 배치 이다. L4의 위치 모든에서 다른 광학 부품, M5, L3, GM과 2를 포함 하 여 배치를 결정 합니다. 두 번째 중요 한 단계는 동기화 프로세스. 거부 하려면 초점 배경 밖으로, 액티브 픽셀의 효과적인 탐지 폭 타일 너비는 빔 연소와 동기화 해야 합니다. 따라서, 그것은 타일 빔 (5.6 단계)의 효과적인 조명 폭을 측정 하는 데 필요한 하 고 설정된 카메라 매개 변수 따라 단계에서 6.4.
매우 큰 FOV와 이미징, 제시 방법 증가 배경 다른 쪽에 비해 한 쪽에 표시 됩니다. 이것은 조명의 다른 영상 위치에서 약간 변경된 각도에 기인 합니다. 같이 하기 전에 스캔 각도11와 동기적으로 조정 하 여이 문제를 완화 한다 M5 대신 두 번째 galvo 미러를 구현. 상용 무색 남자 대신 트릭 스캔 렌즈도 도움이 될. 그러나, 이미징의 영역에 대 한 < 8,080 µ m2, 단일 galvo 거울 청소 충분 했다. 그러나 HIST 현미경 이미징 깊이의 한계는,, 그것은 12 µ m 타일 빔과 없음 1.45 기름 침수 렌즈11~ 15 µ m 이미징 때 좋은 SBR를 얻을 수 있습니다.
이 프로토콜에서 우리 사용 8의 빔 압축 비율 타일 빔. 얇은 조명 HIST 현미경에 단일 분자 조직11이미징에 대 한 강력한 될 수 있는 높은 SBR을 달성 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그러나,이 경우에, photobleaching 효과 고려 되어야 한다 증가 자극 강도 의해 현재 빔 압축 비율에 피11에 비해 3D 이미징에서 감소 photobleaching 보였다 동안. 2 기가 배치 목표 빛 시트 현미경에 비해, HIST 현미경 검사 법은 간단 구현 하 고 기존의 샘플 준비와 호환. 향상 된 SBR 및 큰 FOV HIST 현미경 검사 법의 상호 작용의 여러 셀에 단일 생체 역학 공부에 적합 및 더 사용할 수 있습니다 슈퍼 해상도 이미징 및 단일 분자 추적.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 방위 고 등 연구 프로젝트 기구 (DARPA) (HR00111720066) 및 국립 과학 재단 (NSF) (1805200)에 의해 지원 되었다. 우리 감사 마이클 방탄복 Andor 기술에 아낌없이 sCMOS 카메라를 임대.
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-060-A-ML | Collimator |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-100-A-ML | L1,L2 |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-300-A-ML | TL |
1" Broadband Dielectric Mirrors | Thorlabs | BB1-E02-10 | M1~M7 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1363RM-A | CL1 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1695RM-A | CL2 |
1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-857 | For dichroic mirror mounting |
1" Threaded Cage Plate | Thorlabs | CP02 | For holding other lenses |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-150-A-ML | L3 |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-400-A-ML | L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01 | For holding L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01T | For holding L3 |
2% Bis Solution | Bio Rad | 64085292 | hydrogel component |
20 nm fluorescent beads | Thermo Fisher | F8782 | For testing imaging |
30 mm Cage Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KCB1 | For objective & camera mounting |
30mm Cage System Iris | Thorlabs | CP20S | |
3-Axis NanoMax Stage | Thorlabs | MAX311D | |
40% Acrylamide Solution | Bio Rad | 64148001 | hydrogel component |
405 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
50x TAE buffer | Bio-Rad | 161-0743 | hydrogel component |
561 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-DPL | |
638 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | hydrogel component |
Beam alignment tool | custom made | ||
BNC terminal blocks | Natural Instruments | BNC-2110 | |
Cage plate with M9 x 0.5 internal threads | Thorlabs | CP1TM09 | For holding aspheric lens |
Cage System Rods | Thorlabs | SR series | |
Cell culture & smFISH | See a reference [11] | ||
Double side tape | Scotch | 515182 | Flow chamber |
Epoxy | Devcon | 14250 | Flow chamber |
Galvo mirror | Thorlabs | GVS211 | GM |
Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | |
Half wave plate | Thorlabs | WPH10M-405/561/633 | Power adjustment |
long-pass dichroic mirror | Chroma | T550lpxr | For combining lasers |
Microscope slides | Fisherbrand | 12549-3 | Flow chamber |
Mikroskopische Deckglaser | Hecht Assistent | 990/5024 | Flow chamber |
Mounted Frosted Glass Alignment Disk | Thorlabs | DG10-1500-H1-MD | For double pinhole system |
Mounted rochester aspheric lens | Thorlabs | A230TM-A | |
Multi-band dichroic mirror | Semrock | Di03-R405/488/561/635-t3 | DM; 3 mm thickness |
Multi-band filter | Semrock | FF01-446/523/600/677-25 | BF |
Multimode fiber | Thorlabs | M31L02 | MMF |
N,N,N',N'-tetramethyl ethylenediamine | Sigma | T7024-25ML | hydrogel component |
NI-DAQ board | Natural Instruments | PCI-6733 | |
Ø1" Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KM100 | For holding mirrors |
Objective lens | Olympus | PLANAPO N 60X | 60X 1.45NA oil |
Pedestal Base Clamping Forks | Newport | 9916 | |
Pedestal Pillar Posts | Thorlabs | RS1P8E | |
Piezo controller | Thorlabs | BPC303 | |
Polarized beam splitter | Thorlabs | PBS251 | For combining lasers |
RMS-SM1 adapter | Thorlabs | SM1A3TS | For objective lens |
Rod holder | custom made | ||
Rotation cage mount | Thorlabs | RSP1/CRM1/CRM1P | For HWP & cylindrical lens mounting |
sCMOS camera | Andor | Zyla-4.2P-CL10 | |
Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | Beam collimation test |
Single mode fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | SMF |
SM1 Lens Tubes | Thorlabs | SM1S25 | For double pinhole system |
SM1 Slotted Lens Tube | Thorlabs | SM1L30C | For double pinhole system |
Stage mount | custom made | ||
threaded fiber adapter | Thorlabs | SM1FC | |
Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | Fiber coupling |