En detaljerad instruktion beskrivs hur man bygger ett starkt lutande svepte kakel (HIST) Mikroskop och dess användning för singel-molekyl avbildning.
Singel-molekyl imaging har mycket avancerade vår förståelse av molekylära mekanismer i biologiska studier. Men har det varit utmanande att få stora fält-of-view, kontrastrika bilder med tjocka celler och vävnader. Här introducerar vi lutar sopade kakel (HIST) mikroskopi som övervinner detta problem. Ett par av cylindriska linser implementerades för att generera en långsträckt excitation stråle som skannades över ett stort imaging område via en snabb galvo spegel. En 4f konfiguration användes till position optiska komponenter. En vetenskaplig kompletterande metal-oxide semiconductor kamera upptäckt fluorescens signalen och blockerade out-of-fokus bakgrunden med en dynamisk confocal slit synkroniseras med den balk sotningen. Vi presenterar en steg för steg instruktion om bygga mikroskopet HIST med alla grundläggande komponenter.
Singel-molekyl fluorescens imaging spelar en viktig roll i många biologiska studier som avslöjar ultrastructures, dynamik och kvantiteten av biomolekyler1,2,3. Dock har det svårt för att studera singel-molekyler inuti celler eller vävnader. Medan konfokalmikroskopi ger hög snittningen kapacitet4, är det inte lämplig för singel-molekyl imaging på grund av svår fotoblekning av hög excitation intensiteten eller långsam imaging hastigheten. Widefield mikroskopi använder svagare belysning utan lider av en dålig signal till bakgrunden baserat (SBR)5. Ljus-ark mikroskopi, däremot, kunde visa bra snittning och låg fotoblekning6; den tillgängliga numeriska bländaröppningen (NA) är dock kraftigt begränsad av kravet på ortogonalt placerade mål7. Alternativt, det kräver speciella lampor och prov kammare8,9.
Av dessa skäl har mycket benägen och laminerade optiska ark (HILO) mikroskopi använts för 3D singel-molekyl imaging10. När en lutande balk påträffar ett gränssnitt av två media (glas och vatten, till exempel), bryts strålen enligt Snells lag. Ännu viktigare, bryts strålen blir tunnare, och dess tjocklek beskrivs som dz = R/tan(θ) där R är diametern på den lutande balken och θ är refraktion vinkeln av den överförda beam. Detta enkla genomförande resulterar i en bra snittningen kapacitet. Ändå, denna relation anger att en tunn belysning (dvs hög snittningen kapacitet) kräver en liten R eller en stor θ. Till exempel, när R = 20 µm och θ = 72 grader, kan man få dz = 6,5 µm. Eftersom det finns en praktisk gräns till ökande refraktion vinkel för att bilden djupt inne i cellerna och undvika Totalreflexion, finns det en stark koppling av belysning diameter och beam tjocklek. Av denna anledning visar HILO imaging en relativt liten field-of-view (FOV) som kraftigt begränsar dess tillämpningar i flercelliga imaging.
Nyligen har vi lösa detta problem genom lutar sopade kakel (HIST) mikroskopi där FOV är frikopplat från beam tjocklek i ett mycket enkelt sätt11. Först, genereras en balk som avlånga i en riktning via ett par av cylindriska linser. Denna balk, betecknas som en bricka, producerar en tunn belysning med dz ~ 4 µm medan dess FOV är 130 x 12 µm2. Sedan är kakel svepte över provet med en roterande galvo spegel. Under tiden registreras fluorescens bilden på en vetenskaplig kompletterande metal-oxide semiconductor (sCMOS)-kamera som filtrerar effektivt out-of-fokus bakgrund genom verksamhet i en rullande slutare som fungerar som avstämbara confocal slit upptäckt. På detta sätt möjliggör HIST mikroskopi singel-molekyl bildbehandling med ett större synfält (~ 130 x 130 µm2) och en tunnare belysning än HILO imaging. Vi tillämpat detta nya imaging teknik för att upptäcka RNA avskrifter med en enda sond i celler eller med några sonder i mus hjärnans vävnader, som har en betydande potential för att studera genuttryck och sjukdomar. Till skillnad från andra metoder, HIST sysselsätter endast ett enda hög numeriska bländaröppningen mål utan en ytterligare illuminator eller remote upptäckt mål och är helt kompatibel med inverterade Mikroskop. Dessa fördelar tillsammans med en stor FOV och hög kontrast gör HIST mikroskopi ett framstående verktyg inom biologi och medicin. Vi presenterar detaljerade instruktioner angående instrumentering av mikroskopet HIST, och hur att testa och kalibrera dess prestanda enligt nedan.
Det finns två kritiska steg i detta protokoll. Den första är korrekt placering av L4 i steg 3.3, säkerställa att den infallande strålen passerar genom centrum av linsen och en perfekt luftiga disk mönster bildas i taket. Positionen på L4 avgör placeringen av alla andra optiska komponenter, inklusive M5, L3, GM och L2. Den andra kritiska steget är synkroniseringsprocessen. Om du vill avvisa out-of-fokus bakgrund, ska aktiva bildpunkter vars effektiv upptäckt bredd är lika med kakel bredden synkroniseras med den balk sotningen. Därför är det nödvändigt att mäta den effektiva belysningen bredden av en kakel beam (steg 5,6) och Ställ in kamerans parametrar med detta i steg 6,4.
När imaging med mycket stora FOV, visar den presenterade metoden en ökad bakgrund på ena sidan jämfört med den andra sidan. Detta tillskrivs något förändrad vinklar av belysning på olika imaging positioner. Genomföra en andra galvo spegel istället för M5 lindrar problemet som visat innan av synkront justera positionen och skanning vinkel11. I stället för off-the-shelf akromatisk midjekort jacka blir en telecentrisk skanningslinsen också bra. Men för imaging ett område av < 8,080 µm2, enda galvo spegel sotning var tillräcklig. HIST mikroskopi har en högst tänkbar djup, det är dock kunna få en bra SBR när imaging upp till ~ 15 µm med en 12 µm kakel balk och en NA 1,45 olja nedsänkning objektiv11.
I detta protokoll använde vi en balk komprimeringsgrad på 8 för att göra en kakel-balk. En tunnare belysning kan användas i HIST mikroskopi för att uppnå högre SBR, som kan vara kraftfulla för singel-molekyl vävnad imaging11. Men i det här fallet bör fotoblekning effekt övervägas av en ökad excitation intensitet medan nuvarande beam kompressionsförhållandet visade minskad fotoblekning i 3D imaging jämfört med Epi11. HIST mikroskopi jämfört med ljus ark Mikroskop med två ortogonalt placerade mål, och är enkla att genomföra och kompatibel med konventionella prov preparat. Den förbättrade SBR och stora FOV av HIST mikroskopi är lämplig för att studera interaktioner och dynamiken i enda biomolekyler i flera celler och kan användas vidare i super-upplösning imaging och singel-molekyl spårning.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) (HR00111720066) och National Science Foundation (NSF) (1805200). Vi tackar Michael Serge i Andor teknik för generöst lånar sCMOS kameran.
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-060-A-ML | Collimator |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-100-A-ML | L1,L2 |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-300-A-ML | TL |
1" Broadband Dielectric Mirrors | Thorlabs | BB1-E02-10 | M1~M7 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1363RM-A | CL1 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1695RM-A | CL2 |
1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-857 | For dichroic mirror mounting |
1" Threaded Cage Plate | Thorlabs | CP02 | For holding other lenses |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-150-A-ML | L3 |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-400-A-ML | L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01 | For holding L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01T | For holding L3 |
2% Bis Solution | Bio Rad | 64085292 | hydrogel component |
20 nm fluorescent beads | Thermo Fisher | F8782 | For testing imaging |
30 mm Cage Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KCB1 | For objective & camera mounting |
30mm Cage System Iris | Thorlabs | CP20S | |
3-Axis NanoMax Stage | Thorlabs | MAX311D | |
40% Acrylamide Solution | Bio Rad | 64148001 | hydrogel component |
405 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
50x TAE buffer | Bio-Rad | 161-0743 | hydrogel component |
561 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-DPL | |
638 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | hydrogel component |
Beam alignment tool | custom made | ||
BNC terminal blocks | Natural Instruments | BNC-2110 | |
Cage plate with M9 x 0.5 internal threads | Thorlabs | CP1TM09 | For holding aspheric lens |
Cage System Rods | Thorlabs | SR series | |
Cell culture & smFISH | See a reference [11] | ||
Double side tape | Scotch | 515182 | Flow chamber |
Epoxy | Devcon | 14250 | Flow chamber |
Galvo mirror | Thorlabs | GVS211 | GM |
Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | |
Half wave plate | Thorlabs | WPH10M-405/561/633 | Power adjustment |
long-pass dichroic mirror | Chroma | T550lpxr | For combining lasers |
Microscope slides | Fisherbrand | 12549-3 | Flow chamber |
Mikroskopische Deckglaser | Hecht Assistent | 990/5024 | Flow chamber |
Mounted Frosted Glass Alignment Disk | Thorlabs | DG10-1500-H1-MD | For double pinhole system |
Mounted rochester aspheric lens | Thorlabs | A230TM-A | |
Multi-band dichroic mirror | Semrock | Di03-R405/488/561/635-t3 | DM; 3 mm thickness |
Multi-band filter | Semrock | FF01-446/523/600/677-25 | BF |
Multimode fiber | Thorlabs | M31L02 | MMF |
N,N,N',N'-tetramethyl ethylenediamine | Sigma | T7024-25ML | hydrogel component |
NI-DAQ board | Natural Instruments | PCI-6733 | |
Ø1" Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KM100 | For holding mirrors |
Objective lens | Olympus | PLANAPO N 60X | 60X 1.45NA oil |
Pedestal Base Clamping Forks | Newport | 9916 | |
Pedestal Pillar Posts | Thorlabs | RS1P8E | |
Piezo controller | Thorlabs | BPC303 | |
Polarized beam splitter | Thorlabs | PBS251 | For combining lasers |
RMS-SM1 adapter | Thorlabs | SM1A3TS | For objective lens |
Rod holder | custom made | ||
Rotation cage mount | Thorlabs | RSP1/CRM1/CRM1P | For HWP & cylindrical lens mounting |
sCMOS camera | Andor | Zyla-4.2P-CL10 | |
Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | Beam collimation test |
Single mode fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | SMF |
SM1 Lens Tubes | Thorlabs | SM1S25 | For double pinhole system |
SM1 Slotted Lens Tube | Thorlabs | SM1L30C | For double pinhole system |
Stage mount | custom made | ||
threaded fiber adapter | Thorlabs | SM1FC | |
Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | Fiber coupling |