Ayrıntılı bir talimat nasıl son derece eğimli kurmak için kiremit (HIST) mikroskop ve onun kullanım için tek molekül düşsel süpürüldü açıklanmıştır.
Tek molekül görüntüleme anlayışımız biyolojik çalışmalarda moleküler mekanizmaları büyük ölçüde ilerlemiştir. Ancak, kalın hücre ve dokulara büyük görünüm alanı, yüksek kontrastlı görüntüler elde etmek için zor olmuştur. Burada, bu sorunun üstesinden gelir son derece eğimli ok açılı tipler kiremit (HIST) mikroskopi tanıtmak. Silindirik lensler bir çift hızlı galvo ayna aracılığıyla geniş bir görüntüleme alanı üzerinden taranmış bir uzun uyarma ışını oluşturmak için uygulanmıştır. 4f yapılandırması optik bileşenleri konumlandırmak için kullanıldı. Bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarı iletkeni kamera Floresans sinyal algılandı ve odak arka plan ışın süpürme ile senkronize dinamik bir confocal yarık ile engellendi. Biz bir adım-adım öğretim tüm temel bileşenleri HIST mikroskopla bina mevcut.
Tek molekül Floresans görüntüleme ultrastructures, dynamics ve biomolecules1,2,3sayısını ortaya birçok biyolojik çalışmalarda önemli bir rol oynar. Ancak, bu tek-moleküllerin hücre veya doku içinde çalışmaya zor oldu. Confocal mikroskobu yüksek parça yeteneği4sağlarken, şiddetli photobleaching yüksek uyarma yoğunluğu veya yavaş görüntüleme hızı nedeniyle tek molekül görüntüleme için uygun değildir. Widefield mikroskobu zayıf aydınlatma kullanır ama zavallı bir sinyal arka plan oranı (SBR)5‘ e uğrar. Işık sayfalık mikroskobu, öte yandan, iyi kesit ve düşük photobleaching6gösterilebilir; Ancak, mevcut sayısal diyafram (NA) büyük ölçüde uygun yerleştirilmiş hedefleri7şartı ile sınırlıdır. Alternatif olarak, özel Lombozlar ve camlama, örnek odaları8,9gerektirir.
Bu nedenlerden dolayı son derece eğimli ve lamine optik levha (HILO) mikroskopi yaygın 3D tek molekül görüntüleme10için kullanılmıştır. Eğimli bir ışını bir arabirim iki medya (cam ve su, örneğin) karşılaştığında, ışın Snell yasasına göre kırılan. Önemlisi, kırılmış kiriş tiner alır ve kalınlığı dz anlatılan nerede R eğimli ışın çapı ve θ iletilen ışın kırılma açısı R/tan(θ) =. Bu basit uygulama bir iyi parça yeteneklilik içinde sonuçlanır. Yine de, bu ilişki ince aydınlatma (yani, yüksek parça yeteneği) küçük bir R ve/veya büyük θ gerektirdiğini gösterir. Örneğin, ne zaman R 20 µm ve θ = 72 derece, bir-elde etmek dz = 6.5 µm. Derin hücrelerin içinde görüntü ve toplam iç yansıma önlemek için kırılma açısı artan pratik bir sınırı olduğundan, aydınlatma çapı ve kiriş kalınlığı güçlü bir bağlantı vardır. Bu nedenle, HILO görüntüleme bir nispeten küçük alan uygulamaları çok hücreli görüntülemede büyük ölçüde sınırlayan görüş (FOV) gösterir.
Son zamanlarda, son derece eğimli ok açılı tipler kiremit (HIST) mikroskopi nerede FOV kiriş kalınlığı çok basit bir şekilde11dan decoupled tarafından bu sorunun üstesinden geldiler. İlk olarak, bir yönde uzamış bir ışın silindirik lensler bir çift ile oluşturulur. Bir taşı adlandırılan bu ışın dz ile ince bir aydınlatma üreten ~ onun FOV 130 x 12 µm2ise 4 µm. Sonra döşeme dönen galvo ayna kullanarak örnek üzerinde süpürüldü. Bu arada, floresan görüntü fotoğraf makinesinde ayarlanabilir confocal yarık algılama hizmet çalışırken bir çekim modunda çalışan tarafından etkili bir şekilde out-of-odak arka plan uygulayan bir bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (sCMOS) kaydedilir. Bu şekilde, bir daha geniş görüş alanı (~ 130 x 130 µm2) ve HILO görüntüleme daha ince bir aydınlatma ile tek molekül görüntülemede HIST mikroskobu sağlar. Biz bu yeni görüntüleme gen ekspresyonu ve hastalıklar için önemli potansiyele sahip hücreleri tek bir soruşturma veya fare beyin dokularında, birkaç probları ile RNA transkript algılamaya tekniği uygulanır. Diğer yaklaşımların aksine HIST sadece ek bir ışığı olmadan bir tek yüksek sayısal diyafram amaç veya uzaktan algılama hedefleri istihdam ve ters mikroskoplar ile tam olarak uyumludur. Bu avantajlar bir büyük FOV ve yüksek karşıtlık ile birlikte HIST yapacak mikroskobu Biyoloji ve tıp önemli bir araç. HIST mikroskop ve nasıl test ve aşağıdaki gibi performans ayarlama araçları ile ilgili ayrıntılı yönergeler sunmak.
Bu protokol için iki önemli adım vardır. İlk adımda 3.3, olay ışın lens merkezinden geçer ve mükemmel havadar yuvarlak yüzey deseni tavanda oluşan sağlanması olan L4 uygun yerleşimdir. M5, L3, GM ve L2 de dahil olmak üzere tüm diğer optik bileşenler, L4 konumunu belirler. İkinci önemli adım eşitleme işlemidir. Odak arka plan dışı reddetmek için etkin piksel olan etkili algılama genişliği döşeme genişliği eşittir ışın süpürme ile eşitlenmelidir. Bu nedenle, bu döşeme kiriş (Adım 5.6) etkili aydınlatma genişliğini ölçmek gereklidir ve set kamera parametrelerini buna göre 6.4 içinde adım.
Çok büyük FOV ile görüntüleme, sunulan yöntem bir taraftan diğer tarafa göre artan bir arka plan gösterir. Bu aydınlatma farklı görüntüleme pozisyonlarda biraz değişmiş açılarla atfedilir. M5 yerine ikinci bir galvo yansıtmayı uygulama bu sorun zaman uyumlu olarak konumu ve tarama açısı11ayarlayarak daha önce gösterildiği şekilde azaltır. Hazır akromatik birini yerine bir telemerkeze tarama lens de yardımcı olacaktır. Ancak, bir bölümünü görüntüleme için < 8,080 µm2, tek galvo ayna süpürme yeterli. HIST mikroskobu görüntüleme derinliği bir sınırı vardır, ancak, ne zaman bir 12 µm döşeme kiriş ve NA 1,45 yağı daldırma objektif lens11ile 15 ~ µm Imaging iyi SBR elde etmek mümkün.
Bu protokol için biz bir ışın 8 döşeme kiriş yapmak için kullanılan sıkıştırma oranını. Daha ince bir aydınlatma HIST mikroskobu yüksek SBR, hangi-ebilmek var olmak için tek molekül doku11Imaging güçlü elde etmek için kullanılabilir. Geçerli ışın sıkıştırma oranı az photobleaching 3D görüntülemede Epi11‘ e göre gösterdi ise ancak, bu durumda, photobleaching etkisi bir artan uyarma yoğunluk tarafından dikkate alınmalıdır. Işık sayfalık mikroskoplar iki uygun yerleştirilmiş hedefleri ile karşılaştırıldığında, HIST mikroskobu uygulamak basit ve geleneksel örnek hazırlıkları ile uyumlu. Gelişmiş SBR ve büyük HIST mikroskobu ve FOV etkileşimleri ve birden fazla hücreyi tek biomolecules dinamikleri eğitimi için uygundur ve daha fazla kullanılabilir süper kararlılık düşsel ve tek molekül izleme.
The authors have nothing to disclose.
Bu eser savunma ileri araştırma projeleri Ajansı (DARPA) (HR00111720066) ve Ulusal Bilim Vakfı (NSF) (1805200) tarafından desteklenmiştir. Michael Serge Andor teknolojisinde cömertçe sCMOS kamera ödünç verdiğin için teşekkür ediyoruz.
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-060-A-ML | Collimator |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-100-A-ML | L1,L2 |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-300-A-ML | TL |
1" Broadband Dielectric Mirrors | Thorlabs | BB1-E02-10 | M1~M7 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1363RM-A | CL1 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1695RM-A | CL2 |
1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-857 | For dichroic mirror mounting |
1" Threaded Cage Plate | Thorlabs | CP02 | For holding other lenses |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-150-A-ML | L3 |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-400-A-ML | L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01 | For holding L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01T | For holding L3 |
2% Bis Solution | Bio Rad | 64085292 | hydrogel component |
20 nm fluorescent beads | Thermo Fisher | F8782 | For testing imaging |
30 mm Cage Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KCB1 | For objective & camera mounting |
30mm Cage System Iris | Thorlabs | CP20S | |
3-Axis NanoMax Stage | Thorlabs | MAX311D | |
40% Acrylamide Solution | Bio Rad | 64148001 | hydrogel component |
405 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
50x TAE buffer | Bio-Rad | 161-0743 | hydrogel component |
561 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-DPL | |
638 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | hydrogel component |
Beam alignment tool | custom made | ||
BNC terminal blocks | Natural Instruments | BNC-2110 | |
Cage plate with M9 x 0.5 internal threads | Thorlabs | CP1TM09 | For holding aspheric lens |
Cage System Rods | Thorlabs | SR series | |
Cell culture & smFISH | See a reference [11] | ||
Double side tape | Scotch | 515182 | Flow chamber |
Epoxy | Devcon | 14250 | Flow chamber |
Galvo mirror | Thorlabs | GVS211 | GM |
Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | |
Half wave plate | Thorlabs | WPH10M-405/561/633 | Power adjustment |
long-pass dichroic mirror | Chroma | T550lpxr | For combining lasers |
Microscope slides | Fisherbrand | 12549-3 | Flow chamber |
Mikroskopische Deckglaser | Hecht Assistent | 990/5024 | Flow chamber |
Mounted Frosted Glass Alignment Disk | Thorlabs | DG10-1500-H1-MD | For double pinhole system |
Mounted rochester aspheric lens | Thorlabs | A230TM-A | |
Multi-band dichroic mirror | Semrock | Di03-R405/488/561/635-t3 | DM; 3 mm thickness |
Multi-band filter | Semrock | FF01-446/523/600/677-25 | BF |
Multimode fiber | Thorlabs | M31L02 | MMF |
N,N,N',N'-tetramethyl ethylenediamine | Sigma | T7024-25ML | hydrogel component |
NI-DAQ board | Natural Instruments | PCI-6733 | |
Ø1" Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KM100 | For holding mirrors |
Objective lens | Olympus | PLANAPO N 60X | 60X 1.45NA oil |
Pedestal Base Clamping Forks | Newport | 9916 | |
Pedestal Pillar Posts | Thorlabs | RS1P8E | |
Piezo controller | Thorlabs | BPC303 | |
Polarized beam splitter | Thorlabs | PBS251 | For combining lasers |
RMS-SM1 adapter | Thorlabs | SM1A3TS | For objective lens |
Rod holder | custom made | ||
Rotation cage mount | Thorlabs | RSP1/CRM1/CRM1P | For HWP & cylindrical lens mounting |
sCMOS camera | Andor | Zyla-4.2P-CL10 | |
Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | Beam collimation test |
Single mode fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | SMF |
SM1 Lens Tubes | Thorlabs | SM1S25 | For double pinhole system |
SM1 Slotted Lens Tube | Thorlabs | SM1L30C | For double pinhole system |
Stage mount | custom made | ||
threaded fiber adapter | Thorlabs | SM1FC | |
Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | Fiber coupling |