Bruke Caenorhabditis elegans for å studere trans-og multi-generasjons effekter av toxicants
Summary
Trans-og multi-generasjons effekter av vedvarende kjemikalier er avgjørende for å bedømme sine langsiktige konsekvenser i miljøet og på den menneskelige helse. Vi gir romanen detaljerte metoder for å studere trans-og multi-generasjons effekter ved hjelp av fri-levende nematode Caenorhabditis elegans.
Abstract
Informasjon om toksisitet av kjemikalier er viktig i deres anvendelse og avfallshåndtering. For kjemikalier ved lave konsentrasjoner, er de langsiktige virkningene svært viktig for å bedømme deres konsekvenser i miljøet og på menneskers helse. Ved å demonstrere langsiktige påvirkninger, gir virkningene av kjemikalier over generasjoner i nyere studier ny innsikt. Her beskriver vi protokoller for å studere effekter av kjemikalier over flere generasjoner ved hjelp av fritt levende nematode Caenorhabditis elegans. To aspekter er presentert: (1) trans-generasjons (TG) og (2) multi-generasjons effekt studier, hvorav sistnevnte er separert til multi-generasjons eksponering (MGE) og multi-generasjons rest (MGR) effekt studier. TG effekt studien er robust med en enkel hensikt å avgjøre om kjemisk eksponering for foreldre kan føre til eventuelle gjenværende konsekvenser for avkom. Etter at effektene er målt på foreldre, er natrium natriumhypokloritt løsninger brukes til å drepe foreldrene og holde avkom for å lette effekten måling på avkom. TG-effekten brukes til å avgjøre om avkommet påvirkes når forelderen utsettes for forurensende stoffer. MGE og MGR effekt studien er systematisk brukes til å avgjøre om kontinuerlig generasjonsskifte eksponering kan føre til adaptive responser i avkom over generasjoner. Nøye henting og overføring brukes til å skille generasjoner for å lette effekten måling på hver generasjon. Vi kombinerte også protokoller for å måle bevegelse atferd, reproduksjon, levetid, biokjemiske og genuttrykk endringer. Noen eksempel eksperimenter er også presentert for å illustrere trans-og multi-generasjons effekt studier.
Introduction
Anvendelsen og avfallshåndtering av kjemikalier er svært avhengig av informasjon om deres virkninger ved visse konsentrasjoner. Tid er spesielt et vesentlig element mellom effekter og konsentrasjoner. Det vil si, kjemikalier, spesielt de ved lave konsentrasjoner i de faktiske miljøer, trenger tid til å provosere målbare effekter1. Derfor, forskere arrangere ulike lengder av eksponeringen varighet i dyre eksperimenter, og til og med dekke hele livssyklusen. For eksempel ble mus eksponert for nikotin for 30, 90 eller 180 dager for å studere dens toksiske effekter 2. Likevel, slik eksponering varigheter er fortsatt ikke nok til å belyse de langsiktige virkningene av forurensende stoffer (f. eks, vedvarende organiske forurensninger [POPs]) som kan vare over generasjoner av organismer i miljøet. Derfor er studier på effekter over generasjoner stadig mer og mer oppmerksomhet.
Det er to hoved aspekter i generasjonsskifte effekt studier. Den første er den Trans-generasjons (TG) effekt studie som kan robust teste om kjemisk eksponering for foreldre kan resultere i noen konsekvenser på avkom3. Den andre er en multi-generasjons effekt studie som er mer systematisk med hensyn i både eksponering og gjenværende effekter. På den ene siden, multi-generasjons eksponering (MGE) effekter brukes til å illustrere adaptive responser i dyrene til de langsiktige utfordrende miljøer. På den annen side, den multi-generasjons rest (MGR) effekter brukes til å demonstrere de langsiktige gjenværende konsekvenser etter eksponering, siden mors eksponering er ledsaget med embryo eksponering for den første avkom og bakterie-linje eksponering til andre avkom som gjør den tredje avkom som første generasjon helt ut av eksponering4.
Selv om pattedyr (for eksempel mus) er modell organismer i toksisitet studier spesielt i forhold til mennesker, er deres anvendelse i å studere generasjonsskifte effekter ganske tidkrevende, dyrt og etisk om 5. Følgelig, organismer inkludert skalldyr daphnia Magna6, insekt Drosophila melanogaster7 og sebrafisk Danio rerio8, gir alternative valg. Likevel, disse organismer enten mangler likheter med mennesker, eller krever spesifikt utstyr i studier.
Caenorhabditis elegans er en liten fri-levende nematode (ca 1 mm i lengde) med en kort livssyklus (ca 84 h ved 20 ° c)9. Dette nematode aksjer mange biologiske veier konservative til mennesker, og derfor har det vært mye brukt til å illustrere effekter av ulike påkjenninger eller toxicants10. 99,5% av nematoder er hermafroditter å gjøre denne organismer ekstremt egnet i å studere generasjonsskifte effekter, for eksempel TG effekter av tungmetaller og Sulfonamider3,11, MGE effekter av gull nanopartikler og tunge metaller12 og temperatur13, Mgr effekter av sulfonamide14, og både MGE og MGR effekter av gamma bestråling15 og lindan4. Videre ble det funnet sammenlignbare resultater mellom virkningene av kjemikalier (f.eks. zearalenone) om utvikling og reproduksjon av mus og C. elegans16,17, som ville gi en fordel å ekstrapolere virkninger fra denne liten dyr å Human vesener.
Både TG og MG effekt studier er tidkrevende og trenger forsiktig design og ytelse. Spesielt, forskjeller eksisterte i livet-scenen valg, eksponerings forhold og generasjon separasjon metoder i de nevnte studiene. Slike forskjeller hindret direkte sammenligning mellom resultatene og hemmet ytterligere tolkning av resultatene. Derfor er det viktig å etablere ensartede protokoller for å veilede TG og MG effekt studier, og også å gi et større bilde for å avdekke lignende mønstre av ulike toxicants eller forurensende stoffer i langsiktige konsekvenser. De over målet med dagens protokoller vil demonstrere klare operasjons prosesser i å studere trans-og multi-generasjons effekter med C. elegans. Protokollene vil være til nytte for forskere som er interessert i å studere de langsiktige virkningene av toxicants eller forurensende stoffer.
Protocol
Representative Results
Discussion
For å kunne gjennomføre den beskrevne protokollen, bør følgende forslag tas i betraktning. Utfør de generelle eksperimentelle operasjonene i et sterilt miljø. Feilaktig drift kan føre til forurensning av E. coli stammer, f. eks, sopp og midd kan hindre normal vekst av C. elegans og derfor påvirker de eksperimentelle resultater. I avsnittet beskriver dyrking c. elegans, observere vekst skalaen av c. elegans på NGM agars av nakne øyne eller mikroskop. Når skalaen av C. ele…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| agar powder | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 9002-18-0 | |
| 79nnHT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| 96-well sterile microplate | Costar，Corning，America | ||
| Autoclave sterilizer | Tomy, Tomy Digital Biology, Japan | ||
| Biosafety cabinet | LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China | ||
| calcium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10043-52-4 | |
| centrifuge 5417R | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Centrifuge tubes | Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America | ||
| cholesterol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 57-88-5 | |
| Dimethyl sulfoxide | VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America | 67-68-5 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7558-79-4 | |
| ethanol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 64-17-5 | |
| Filter | Thermo, Thermo Fisher Scientific, America | ||
| incubator | YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China | ||
| inoculating loop | |||
| K2HPO4•3H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 16788-57-1 | |
| kraft paper | |||
| Mcroplate Reader | Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America | ||
| MgSO4•7H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10034-99-8 | |
| Microscopes XTL-BM-9TD | BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China | ||
| Petri dishes | |||
| Pipette | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Potassium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7447-40-7 | |
| potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7778-77-0 | |
| Qiagen RNeasy kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States | ||
| sodium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7647-14-5 | |
| sodium hydroxide | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 1310-73-2 | |
| sodium hypochlorite solution | Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China | 7681-52-9 | |
| tryptone | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 73049-73-7 | |
| yeast extract | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 119-44-8 |
References
- Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri. Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).
- Li, W., et al. Long-term nicotine exposure induces dysfunction of mouse endothelial progenitor cells. Experimental and Therapeutic. 13, 85-90 (2017).
- Yu, Z. Y., Chen, X. X., Zhang, J., Wang, R., Yin, D. Q. Transgenerational effects of heavy metals on L3 larva of Caenorhabditis elegans with greater behavior and growth inhibitions in the progeny. Ecotoxicology and Environmental Safety. 88C, 178-184 (2013).
- Chen, R., Yu, Z., Yin, D. Multi-generational effects of lindane on nematode lipid metabolism with disturbances on insulin-like signal pathway. Chemosphere. 210, 607-614 (2018).
- Van Norman, G. A. A matter of mice and men: ethical issues in animal experimentation. International Anesthesiology Clinics. 53 (3), 63-78 (2015).
- Pereira, C. M. S., Everaert, G., Blust, R., De Schamphelaere, K. A. C. Multigenerational effects of nickel on Daphnia magna depend on temperature and the magnitude of the effect in the first generation. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (7), 1877-1888 (2018).
- Morimoto, J., Simpson, S. J., Ponton, F. Direct and trans-generational effects of male and female gut microbiota in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 13, 20160966 (2017).
- Coimbra, A. M., et al. Chronic effects of clofibric acid in zebrafish (Danio rerio): A multigenerational study. Aquatic Toxicology. 160, 76-86 (2015).
- Sugi, T. Genome editing in C. elegans and other nematode species. International Journal of Molecular Sciences. 17, 295 (2016).
- Leung, M. C. K., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Science. 106 (1), 5-28 (2008).
- Yu, Z. Y., Jiang, L., Yin, D. Q. Behavior toxicity to Caenorhabditis elegans transferred to the progeny after exposure to sulfamethoxazole at environmentally relevant concentration. Journal of Environmental Sciences-China. 23 (2), 294-300 (2011).
- Kim, S. W., Kwak, J. I., An, Y. J. Multigenerational study of gold nanoparticles in Caenorhabditis elegans: transgenerational effect of maternal exposure. Environmental Science & Technology. 47, 5393-5399 (2013).
- Klosin, A., Casas, E., Hidalgo-Carcedo, C., Vavouri, T., Lehner, B. Transgenerational transmission of environmental information in C. elegans. Science. 356, 320 (2017).
- Yu, Z. Y., et al. Trans-generational influences of sulfamethoxazole on lifespan, reproduction and population growth of Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and Environmental Safety. 135, 312-318 (2017).
- Buisset-Goussen, A., et al. Effects of chronic gamma irradiation: a multigenerational study using Caenorhabditis elegans. Radioactivity. 137, 190-197 (2014).
- Zhao, F., et al. Multigenerational exposure to dietary zearalenone (ZEA), anestrogenic mycotoxin, affects puberty and reproductionin female mice. Reproductive Toxicology. 47, 81-88 (2014).
- Yang, Z., Wang, J., Tang, L., Sun, X., Xue, K. S. Transgenerational comparison of developmental and reproductive toxicities in zearalenone exposed Caenorhabditis elegans. Asian Journal of Ecotoxicology. 11 (4), 61-68 (2016).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis dlegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Emmons, S., Klass, M., Hirsch, D. An analysis of the constancy of DNA sequences during development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 1333-1337 (1979).
- Van Gilst, M. R., Hadjivassiliou, H., Yamamoto, K. R. A Caenorhabditis elegans nutrient response system partially dependent on nuclear receptor NHR-49. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13496-13501 (2005).
- Cobb, E., Hall, J., Palazzolo, D. L. Induction of metallothionein expression after exposure to conventional cigarette smoke but not electronic cigarette (ECIG)-generated aerosol in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Physiology. 9, 426 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Hill, R., et al. Genetic flexibility in the convergent evolution of hermaphroditism in Caenorhabditis Nematodes. Developmental Cell. 10, 531-538 (2006).
- Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 2013, 1300-1310 (2013).
- Breider, F., von Gunten, U. Quantification of total N-nitrosamine concentrations in aqueous samples via UV-photolysis and chemiluminescence detection of nitric oxide. Analytical Chemistry. 89 (3), 1574-1582 (2017).
