Trans-og multi-generasjons effekter av vedvarende kjemikalier er avgjørende for å bedømme sine langsiktige konsekvenser i miljøet og på den menneskelige helse. Vi gir romanen detaljerte metoder for å studere trans-og multi-generasjons effekter ved hjelp av fri-levende nematode Caenorhabditis elegans.
Informasjon om toksisitet av kjemikalier er viktig i deres anvendelse og avfallshåndtering. For kjemikalier ved lave konsentrasjoner, er de langsiktige virkningene svært viktig for å bedømme deres konsekvenser i miljøet og på menneskers helse. Ved å demonstrere langsiktige påvirkninger, gir virkningene av kjemikalier over generasjoner i nyere studier ny innsikt. Her beskriver vi protokoller for å studere effekter av kjemikalier over flere generasjoner ved hjelp av fritt levende nematode Caenorhabditis elegans. To aspekter er presentert: (1) trans-generasjons (TG) og (2) multi-generasjons effekt studier, hvorav sistnevnte er separert til multi-generasjons eksponering (MGE) og multi-generasjons rest (MGR) effekt studier. TG effekt studien er robust med en enkel hensikt å avgjøre om kjemisk eksponering for foreldre kan føre til eventuelle gjenværende konsekvenser for avkom. Etter at effektene er målt på foreldre, er natrium natriumhypokloritt løsninger brukes til å drepe foreldrene og holde avkom for å lette effekten måling på avkom. TG-effekten brukes til å avgjøre om avkommet påvirkes når forelderen utsettes for forurensende stoffer. MGE og MGR effekt studien er systematisk brukes til å avgjøre om kontinuerlig generasjonsskifte eksponering kan føre til adaptive responser i avkom over generasjoner. Nøye henting og overføring brukes til å skille generasjoner for å lette effekten måling på hver generasjon. Vi kombinerte også protokoller for å måle bevegelse atferd, reproduksjon, levetid, biokjemiske og genuttrykk endringer. Noen eksempel eksperimenter er også presentert for å illustrere trans-og multi-generasjons effekt studier.
Anvendelsen og avfallshåndtering av kjemikalier er svært avhengig av informasjon om deres virkninger ved visse konsentrasjoner. Tid er spesielt et vesentlig element mellom effekter og konsentrasjoner. Det vil si, kjemikalier, spesielt de ved lave konsentrasjoner i de faktiske miljøer, trenger tid til å provosere målbare effekter1. Derfor, forskere arrangere ulike lengder av eksponeringen varighet i dyre eksperimenter, og til og med dekke hele livssyklusen. For eksempel ble mus eksponert for nikotin for 30, 90 eller 180 dager for å studere dens toksiske effekter 2. Likevel, slik eksponering varigheter er fortsatt ikke nok til å belyse de langsiktige virkningene av forurensende stoffer (f. eks, vedvarende organiske forurensninger [POPs]) som kan vare over generasjoner av organismer i miljøet. Derfor er studier på effekter over generasjoner stadig mer og mer oppmerksomhet.
Det er to hoved aspekter i generasjonsskifte effekt studier. Den første er den Trans-generasjons (TG) effekt studie som kan robust teste om kjemisk eksponering for foreldre kan resultere i noen konsekvenser på avkom3. Den andre er en multi-generasjons effekt studie som er mer systematisk med hensyn i både eksponering og gjenværende effekter. På den ene siden, multi-generasjons eksponering (MGE) effekter brukes til å illustrere adaptive responser i dyrene til de langsiktige utfordrende miljøer. På den annen side, den multi-generasjons rest (MGR) effekter brukes til å demonstrere de langsiktige gjenværende konsekvenser etter eksponering, siden mors eksponering er ledsaget med embryo eksponering for den første avkom og bakterie-linje eksponering til andre avkom som gjør den tredje avkom som første generasjon helt ut av eksponering4.
Selv om pattedyr (for eksempel mus) er modell organismer i toksisitet studier spesielt i forhold til mennesker, er deres anvendelse i å studere generasjonsskifte effekter ganske tidkrevende, dyrt og etisk om 5. Følgelig, organismer inkludert skalldyr daphnia Magna6, insekt Drosophila melanogaster7 og sebrafisk Danio rerio8, gir alternative valg. Likevel, disse organismer enten mangler likheter med mennesker, eller krever spesifikt utstyr i studier.
Caenorhabditis elegans er en liten fri-levende nematode (ca 1 mm i lengde) med en kort livssyklus (ca 84 h ved 20 ° c)9. Dette nematode aksjer mange biologiske veier konservative til mennesker, og derfor har det vært mye brukt til å illustrere effekter av ulike påkjenninger eller toxicants10. 99,5% av nematoder er hermafroditter å gjøre denne organismer ekstremt egnet i å studere generasjonsskifte effekter, for eksempel TG effekter av tungmetaller og Sulfonamider3,11, MGE effekter av gull nanopartikler og tunge metaller12 og temperatur13, Mgr effekter av sulfonamide14, og både MGE og MGR effekter av gamma bestråling15 og lindan4. Videre ble det funnet sammenlignbare resultater mellom virkningene av kjemikalier (f.eks. zearalenone) om utvikling og reproduksjon av mus og C. elegans16,17, som ville gi en fordel å ekstrapolere virkninger fra denne liten dyr å Human vesener.
Både TG og MG effekt studier er tidkrevende og trenger forsiktig design og ytelse. Spesielt, forskjeller eksisterte i livet-scenen valg, eksponerings forhold og generasjon separasjon metoder i de nevnte studiene. Slike forskjeller hindret direkte sammenligning mellom resultatene og hemmet ytterligere tolkning av resultatene. Derfor er det viktig å etablere ensartede protokoller for å veilede TG og MG effekt studier, og også å gi et større bilde for å avdekke lignende mønstre av ulike toxicants eller forurensende stoffer i langsiktige konsekvenser. De over målet med dagens protokoller vil demonstrere klare operasjons prosesser i å studere trans-og multi-generasjons effekter med C. elegans. Protokollene vil være til nytte for forskere som er interessert i å studere de langsiktige virkningene av toxicants eller forurensende stoffer.
For å kunne gjennomføre den beskrevne protokollen, bør følgende forslag tas i betraktning. Utfør de generelle eksperimentelle operasjonene i et sterilt miljø. Feilaktig drift kan føre til forurensning av E. coli stammer, f. eks, sopp og midd kan hindre normal vekst av C. elegans og derfor påvirker de eksperimentelle resultater. I avsnittet beskriver dyrking c. elegans, observere vekst skalaen av c. elegans på NGM agars av nakne øyne eller mikroskop. Når skalaen av C. ele…
The authors have nothing to disclose.
agar powder | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 9002-18-0 | |
79nnHT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
96-well sterile microplate | Costar,Corning,America | ||
Autoclave sterilizer | Tomy, Tomy Digital Biology, Japan | ||
Biosafety cabinet | LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China | ||
calcium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10043-52-4 | |
centrifuge 5417R | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
Centrifuge tubes | Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America | ||
cholesterol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 57-88-5 | |
Dimethyl sulfoxide | VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America | 67-68-5 | |
disodium hydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7558-79-4 | |
ethanol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 64-17-5 | |
Filter | Thermo, Thermo Fisher Scientific, America | ||
incubator | YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China | ||
inoculating loop | |||
K2HPO4•3H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 16788-57-1 | |
kraft paper | |||
Mcroplate Reader | Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America | ||
MgSO4•7H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10034-99-8 | |
Microscopes XTL-BM-9TD | BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China | ||
Petri dishes | |||
Pipette | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
Potassium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7447-40-7 | |
potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7778-77-0 | |
Qiagen RNeasy kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States | ||
sodium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7647-14-5 | |
sodium hydroxide | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 1310-73-2 | |
sodium hypochlorite solution | Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China | 7681-52-9 | |
tryptone | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 73049-73-7 | |
yeast extract | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 119-44-8 |