Summary

Использование Elegans Caenorhabditis для изучения транс- и мульти-поколения эффекты токсичных веществ

Published: July 29, 2019
doi:

Summary

Транс- и несколько поколений воздействие стойких химических веществ имеют важное значение для оценки их долгосрочных последствий в окружающей среде и для здоровья человека. Мы предоставляем новые подробные методы для изучения транс- и нескольких поколений эффекты с использованием свободного проживания nematode Caenorhabditis elegans.

Abstract

Информация о токсичности химических веществ имеет важное значение в их применении и обращении с отходами. Для химических веществ при низких концентрациях долгосрочные последствия имеют очень важное значение для оценки их последствий в окружающей среде и для здоровья человека. Демонстрируя долгосрочное влияние, воздействие химических веществ на протяжении поколений в последних исследованиях дают новое понимание. Здесь мы описываем протоколы для изучения воздействия химических веществ в течение нескольких поколений с помощью свободного проживания nematode Caenorhabditis elegans. Представлены два аспекта: (1) транс-поколения (TG) и (2) нескольких поколений эффект исследований, последний из которых отделен от нескольких поколений воздействия (MGE) и нескольких поколений остаточного (MGR) исследования эффекта. Исследование эффекта TG является надежным с простой целью определить, может ли химическое воздействие на родителей привести к каким-либо остаточным последствиям для потомства. После того, как эффекты измеряются на родителей, гипохлорит натрия решения используются, чтобы убить родителей и сохранить потомство, с тем чтобы облегчить измерение эффекта на потомство. Исследование эффекта TG используется для определения того, страдают ли потомство, когда их родитель подвергается воздействию загрязняющих веществ. Исследование эффекта MGE и MGR систематически используется для определения того, может ли непрерывное воздействие поколений привести к адаптивной реакции у потомства на протяжении поколений. Тщательный пикап и передача используются для различения поколений для облегчения измерения эффекта на каждое поколение. Мы также объединили протоколы для измерения поведения движения, воспроизводства, продолжительности жизни, биохимических и изменений экспрессии генов. Некоторые примеры экспериментов также представлены, чтобы проиллюстрировать транс- и нескольких поколений эффект исследований.

Introduction

Применение и утилизация отходов химических веществ в значительной степени зависит от информации об их воздействии в определенных концентрациях. Примечательно, что время является еще одним важным элементом между эффектами и концентрациями. То есть, химических веществ, особенно при низких концентрациях в реальной среде, нужно время, чтобы спровоцировать измеримые эффекты1. Поэтому исследователи устраивают разную продолжительность экспозиции в экспериментах на животных и даже охватывают весь жизненный цикл. Например, мыши подвергались воздействию никотина в течение 30, 90 или 180 дней для изучения его токсического воздействия 2. Тем не менее, продолжительность такого воздействия по-прежнему недостаточно для выяснения долгосрочных последствий загрязняющих веществ (например, стойких органических загрязнителей), которые могут длиться более поколений организмов в окружающей среде. Поэтому исследования воздействия на протяжении поколений приобретают все больше ею все больше внимания.

Есть два основных аспекта в исследованиях эффекта поколений. Первый из них является транс-поколения (TG) эффект исследования, которые могут надежно проверить ли химическое воздействие на родителей может привести к каким-либо последствиям для потомства3. Второе исследование представляет собой исследование эффекта нескольких поколений, которое носит более систематический характер с учетом как воздействия, так и остаточного воздействия. С одной стороны, эффекты воздействия нескольких поколений (MGE) используются для иллюстрации адаптивных реакций животных на долгосрочные сложные условия. С другой стороны, эффекты остатков нескольких поколений (MGR) используются для демонстрации долгосрочных остаточных последствий после воздействия, так как воздействие матери сопровождается воздействием эмбриона на первое потомство и воздействием зародышевой линии потомство, которое делает третье потомство, как первое поколение полностью из экспозиции4.

Хотя млекопитающие (например, мыши) являются модельорганизмов в исследованиях токсичности, особенно в отношении человека, их применение в изучении эффектов поколений является довольно трудоемким, дорогим и этически относительно 5. Соответственно, организмы, включая ракообразных Дафния Магна6, насекомое Drosophila melanogaster7 и зебрафиш Данио Рерио8, обеспечить альтернативный выбор. Тем не менее, эти организмы либо не имеют сходства с людьми, или требуют специального оборудования в исследованиях.

Caenorhabditis elegans – это небольшой свободно живущий нематод (примерно 1 мм в длину) с коротким жизненным циклом (примерно 84 ч при 20 градусах По кв.)9. Этот нематод разделяет многие биологические пути консервативныки для человека, и поэтому он был широко используется, чтобы проиллюстрировать последствия различных стрессов или токсикантов10. Примечательно, что 99,5% нематод являются гермафродитами, что делает эти организмы чрезвычайно подходящими для изучения эффектов поколений, например, TG эффекты тяжелых металлов и сульфонамидов3,11, MGE эффекты золотых наночастиц и тяжелых металлы12 и температура13, MGR эффекты сульфонамида14, и как MGE и MGR эффекты гамма облучения15 и линдан4. Кроме того, были найдены сопоставимые результаты между воздействием химических веществ (например, зеарабенана) на развитие и размножение мышей и C. elegans16,17, что обеспечило бы преимущество экстраполировать эффекты от этого маленького животного к человеку.

Оба TG и MG эффект исследований являются трудоемкими и нуждаются в тщательной конструкции и производительности. Примечательно, что в вышеупомянутых исследованиях существуют различия в выборе жизненных этапов, условиях воздействия и методах разделения поколений. Такие различия препятствуют прямому сопоставлению результатов и препятствуют дальнейшему толкованию результатов. Поэтому крайне важно установить единые протоколы для проведения исследований эффектов ТГ и МГ, а также обеспечить более широкую картину для выявления аналогичных моделей различных токсикантов или загрязняющих веществ в долгосрочных последствиях. Над целью настоящих протоколов продемонстрирует ясные процессы деятельности в изучении trans- и multi-generational влияния с C. elegans. Протоколы принесут пользу исследователям, которые заинтересованы в изучении долгосрочных последствий токсикантов или загрязняющих веществ.

Protocol

1. Культура E. coli OP50 Приготовьте 1 M раствор гидроксида натрия, растворив 4 г гидроксида натрия в воде 100 мл. Подготовка лисогенного бульона (LB) среды путем растворения 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г хлорида натрия с 1 л ультрачистой воды в 1 l конической колбы. Отрег…

Representative Results

Здесь мы описываем протоколы для изучения воздействия химических веществ на протяжении поколений с использованием C. elegans в транс-поколения (TG), многопоколенческих воздействия (MGE) и нескольких поколений остаточного (MGR) эффект исследований. В качестве примеров при…

Discussion

Для успешного выполнения описанного протокола следует принять во внимание следующие предложения. Выполняйте общие экспериментальные операции в стерильной среде. Неправильная эксплуатация может привести к загрязнению штаммов кишечной палочки, например, грибков и клещев может п?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

 agar powder OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 9002-18-0
79nnHT Fast Real-Time PCR System  Applied Biosystems 
96-well sterile microplate Costar,Corning,America
Autoclave sterilizer Tomy, Tomy Digital Biology, Japan
Biosafety cabinet LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China
calcium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10043-52-4
centrifuge  5417R Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Centrifuge tubes Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America
cholesterol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 57-88-5
Dimethyl sulfoxide VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America 67-68-5
disodium hydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7558-79-4
ethanol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 64-17-5
Filter Thermo, Thermo Fisher Scientific, America
incubator YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China
inoculating loop
K2HPO4•3H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 16788-57-1
kraft paper
Mcroplate Reader Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America
MgSO4•7H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10034-99-8
Microscopes XTL-BM-9TD BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China 
Petri dishes
Pipette Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Potassium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7447-40-7
potassium dihydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7778-77-0
Qiagen RNeasy kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States
sodium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7647-14-5
sodium hydroxide Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 1310-73-2
sodium hypochlorite solution Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China 7681-52-9
tryptone OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 73049-73-7
yeast extract OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 119-44-8

References

  1. Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri. Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).
  2. Li, W., et al. Long-term nicotine exposure induces dysfunction of mouse endothelial progenitor cells. Experimental and Therapeutic. 13, 85-90 (2017).
  3. Yu, Z. Y., Chen, X. X., Zhang, J., Wang, R., Yin, D. Q. Transgenerational effects of heavy metals on L3 larva of Caenorhabditis elegans with greater behavior and growth inhibitions in the progeny. Ecotoxicology and Environmental Safety. 88C, 178-184 (2013).
  4. Chen, R., Yu, Z., Yin, D. Multi-generational effects of lindane on nematode lipid metabolism with disturbances on insulin-like signal pathway. Chemosphere. 210, 607-614 (2018).
  5. Van Norman, G. A. A matter of mice and men: ethical issues in animal experimentation. International Anesthesiology Clinics. 53 (3), 63-78 (2015).
  6. Pereira, C. M. S., Everaert, G., Blust, R., De Schamphelaere, K. A. C. Multigenerational effects of nickel on Daphnia magna depend on temperature and the magnitude of the effect in the first generation. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (7), 1877-1888 (2018).
  7. Morimoto, J., Simpson, S. J., Ponton, F. Direct and trans-generational effects of male and female gut microbiota in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 13, 20160966 (2017).
  8. Coimbra, A. M., et al. Chronic effects of clofibric acid in zebrafish (Danio rerio): A multigenerational study. Aquatic Toxicology. 160, 76-86 (2015).
  9. Sugi, T. Genome editing in C. elegans and other nematode species. International Journal of Molecular Sciences. 17, 295 (2016).
  10. Leung, M. C. K., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Science. 106 (1), 5-28 (2008).
  11. Yu, Z. Y., Jiang, L., Yin, D. Q. Behavior toxicity to Caenorhabditis elegans transferred to the progeny after exposure to sulfamethoxazole at environmentally relevant concentration. Journal of Environmental Sciences-China. 23 (2), 294-300 (2011).
  12. Kim, S. W., Kwak, J. I., An, Y. J. Multigenerational study of gold nanoparticles in Caenorhabditis elegans: transgenerational effect of maternal exposure. Environmental Science & Technology. 47, 5393-5399 (2013).
  13. Klosin, A., Casas, E., Hidalgo-Carcedo, C., Vavouri, T., Lehner, B. Transgenerational transmission of environmental information in C. elegans. Science. 356, 320 (2017).
  14. Yu, Z. Y., et al. Trans-generational influences of sulfamethoxazole on lifespan, reproduction and population growth of Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and Environmental Safety. 135, 312-318 (2017).
  15. Buisset-Goussen, A., et al. Effects of chronic gamma irradiation: a multigenerational study using Caenorhabditis elegans. Radioactivity. 137, 190-197 (2014).
  16. Zhao, F., et al. Multigenerational exposure to dietary zearalenone (ZEA), anestrogenic mycotoxin, affects puberty and reproductionin female mice. Reproductive Toxicology. 47, 81-88 (2014).
  17. Yang, Z., Wang, J., Tang, L., Sun, X., Xue, K. S. Transgenerational comparison of developmental and reproductive toxicities in zearalenone exposed Caenorhabditis elegans. Asian Journal of Ecotoxicology. 11 (4), 61-68 (2016).
  18. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis dlegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  19. Emmons, S., Klass, M., Hirsch, D. An analysis of the constancy of DNA sequences during development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 1333-1337 (1979).
  20. Van Gilst, M. R., Hadjivassiliou, H., Yamamoto, K. R. A Caenorhabditis elegans nutrient response system partially dependent on nuclear receptor NHR-49. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13496-13501 (2005).
  21. Cobb, E., Hall, J., Palazzolo, D. L. Induction of metallothionein expression after exposure to conventional cigarette smoke but not electronic cigarette (ECIG)-generated aerosol in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Physiology. 9, 426 (2018).
  22. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  23. Hill, R., et al. Genetic flexibility in the convergent evolution of hermaphroditism in Caenorhabditis Nematodes. Developmental Cell. 10, 531-538 (2006).
  24. Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 2013, 1300-1310 (2013).
  25. Breider, F., von Gunten, U. Quantification of total N-nitrosamine concentrations in aqueous samples via UV-photolysis and chemiluminescence detection of nitric oxide. Analytical Chemistry. 89 (3), 1574-1582 (2017).

Play Video

Cite This Article
Li, Z., Ai, F., Zhang, J., Yu, Z., Yin, D. Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants. J. Vis. Exp. (149), e59367, doi:10.3791/59367 (2019).

View Video