En arbeidsbesparende og repeterbar touch-Force signalering mutant Screen Protocol for studier av Thigmomorphogenesis av en modell Plant Arabidopsis thaliana
Summary
En mild touch-Force lasting maskinen er bygget fra menneskehår børster, robotarmer og en kontroller. Håret børster er drevet av robot armene installert på maskinen og flytte med jevne mellomrom for å bruke touch-kraft på planter. Styrken på maskin drevne hår detaljer kan sammenlignes med manuelt anvendte innslag.
Abstract
Planter reagerer på både intracellulære og ekstracellulære mekaniske stimuleringer (eller kraft signaler) og utvikle spesielle morfologiske endringer, en kalt thigmomorphogenesis. I de siste ti årene har flere signalering komponenter blitt identifisert og rapportert for å være involvert i mechanotransduction (f. eks, kalsium ion bindende proteiner og jasmonic acid biosyntesen enzymer). Men den relativt langsomme tempoet i forskningen i studiet av makt signalering eller thigmomorphogenesis er i stor grad tilskrives to grunner: kravet om arbeidskrevende menneskelige hånd-manipulert touch induksjon av thigmomorphogenesis og styrken styrke feil forbundet med folks hånd-touch. For å øke effektiviteten av ekstern kraft lasting på en plante organisme, en automatisk touch-kraft lasting maskinen ble bygget. Dette robot arm drevne hår børste berører gir en arbeidsbesparende og lett repeterbar touch-Force simulering, ubegrenset runder med touch repetisjon og justerbar touch styrke. Denne hår touch-Force lasting maskinen kan brukes til både stor skala screening av touch-Force signalering mutanter og phenomics studie av anlegget thigmomorphogenesis. I tillegg berører materialer som menneskehår, kan erstattes med andre naturlige materialer som dyr hår, silke tråder og bomull fibre. Den automatiserte bevegelige armer på maskinen kan være utstyrt med vann strø dyser og luft vifter for å etterligne den naturlige krefter regndråper og vind, henholdsvis. Ved å bruke denne automatiske hår touch-Force lasting maskin i kombinasjon med hånd-utført bomullsdott berøre, har vi undersøkt touch respons av to force signalering mutanter, MAp kyuzanso kYUZANSO 1 (MKK1) og MKK2 planter . Den phenomes av touch-Force lastet vill type planter og to mutanter ble evaluert statistisk. De har vist vesentlige forskjeller i touch respons.
Introduction
Plant thigmomorphogenesis er et begrep som ble skapt av Jaffe, MJ i 19731. Det er en plante tropism men forskjellig fra den velkjente phototropism eller gravitropism forårsaket av stimuli av sollys eller gravitasjon2,3. Den beskriver fenotypiske endringer forbundet med periodiske mekaniske stimuleringer, som ofte har blitt observert av botanikere i tidligere tider4,5. Regndråper, vind, anlegg, dyr og menneskelige berører, selv dyr biter, er alle regnet for å være forskjellige typer mechano-stimuli som utløser kraften signalering i planter4,5. Egenskapene til plante thigmomorphogenesis inkluderer forsinkelsen av bolting, en kortere stilk, mindre rosett/blad størrelse i stauder, og tykkere stammen i Woody planter6,7,8. Dette er i motsetning til thigmonastic eller thigmotropic respons ofte funnet i Mimosa anlegget eller andre mechano-sensitive vinranker, hvor disse raske touch svarene er lettere å bli observert1,9,10. Thigmomorphogenesis, derimot, er relativt vanskelig å bli observert på grunn av sin langsomme vekst respons. Thigmomorphogenesis observeres vanligvis følgende uker eller år med kontinuerlig kraft lasting stimulering. Denne unike natur plante touch respons gjør det vanskelig å utføre en frem genetisk skjerm ved hjelp av menneskelige hånd touch stimulering å isolere touch-Force signaliserer motstandsdyktig mutanter i en robust måte.
Å belyse kraften signal Transduction trasé og molekylære mekanismer underliggende thigmomorphogenesis6,11, molekylær og cellulære biologiske eksperimenter har blitt utført i de siste6, 12,13,14. Disse studiene har foreslått at anlegget Force signal reseptorer hovedsakelig består av mechanosensitive ion Channels (msc) og bundet MSC komplekser komponert av multimeric komplekser av membran-som spenner over proteiner11,14 , 15. den cytoplasmatiske ca2 + transient Spike generert i løpet av sekunder av den første berøring. Vind-, regn-, eller gravi-stimulering kan samhandle med nedstrøms kalsium sensorer for å overfører styrken signaler til kjernefysiske hendelser14,16,17,18. I tillegg til molekylær og cellulære studier, har den frem genetiske skjermen med manuell finger berøring av planter funnet at phytohormones og sekundære metabolitter er involvert i den påfølgende touch-induserbart (TCH) genuttrykk etter Touch-Force lasting13,19. For eksempel har AOS og opr320 mutanter blitt identifisert så langt fra de genetiske studiene. Imidlertid er det store problemet forbundet med anvendelse av frem genetikk i studiet av thigmomorphogenesis fortsatt intensiv arbeidskraft som kreves for kvantitere nivået på touch respons og berøre en stor befolkning av genetisk mutert enkelte anlegg. Det tidkrevende problemet vedvarer i den hånden rørende-baserte mutant skjermen14,20. For et eksempel, for å fullføre en runde med touch-Force stimulering, en person trenger å berøre 30-60 ganger (ett trykk per sekund) på en enkelt plante. For å få nok antall anlegg for statistisk fenotype analyse, er 20-50 individuelle anlegg av samme genotype normalt nødvendig for touch-Force lasting prosessen. Dette touch-Force lasting regime betyr at en person må full av gjentagelser utføre 600-3000 berører en genotype av valget. Denne typen touch normalt må gjentas 3 til 5 runder om dagen, som tilsvarer omtrent 1800-15000 finger eller bomullsdott berører per dag per genotype av planter. En godt trent person er normalt nødvendig for å opprettholde styrke og styrke på flere innslag i en ønskelig rekkevidde gjennom mange runder med repetisjon i en dag for å unngå den store variasjonen i kraft og styrke. Som det er velkjent at thigmomorphogenesis er en nasyŝaemoe og dose avhengig prosess6,21, touch Force/styrke blir kritisk til en suksess i utløsende touch respons av en plante.
For å fjerne den person-avhengige touch-Force lasting og for å opprettholde mekanisk anvendelse innenfor en akseptabel feilområde14, vi derfor laget en automatisk touch-Force lasting maskin for å erstatte hånd-manipulert berører. Maskinen har 4 bevegelige armer bygget, som hver er utstyrt med en menneskelig hår børste. Denne versjonen heter modell K1 for å spesifisere sin funksjon av menneskehår touch-Force lasting. Hvis 4 genotyper måles kvantitativt for deres thigmomorphogenesis eller berørings respons under én maskin, kan 40-48 personer per genotype måles. Hver runde med touch repetisjon (mindre enn 60 ganger per plante) varer i mindre enn 5 minutter med en bevegelig hastighets justerbar robot arm. Dermed kan planter på en modell K1 touch maskin bli mekanisk stimulert for flere runder om dagen enten med en konstant touch-Force lasting eller ulike nivåer av styrke som opprinnelig programmert.
Arabidopsis thaliana, en modell plante organisme, ble derfor valgt som mål plantearter for å teste den helautomatiske hår touch-Force lasting maskin søknad. Fordi det er flere store Seedbanks tilgjengelig for å hente de ulike germplasms av mutanter og størrelsen på blomstring, passer Arabidopsis godt til den plassen som er tilgjengelig i veksten hylle montert med Model K1 touch maskin.
Modellen K1 automatisk touch maskin består av tre hovedkomponenter: (1) H-formen metall rack komponert av to belte-drevet lineære aktuatorer, (2) Robotic metall armer utstyrt med hårbørster, og (3) en kontroller. For en tilpasset modell K1 touch maskin, hver X/Y akse modulen er sammensatt av en belte-drevet guide-rail, to Slide blokker (rød) og 1 57 stepper motor (pre-installert og demonterbar) (figur 1a,B). Den øvre horisontale aktuatoren gjør det mulig for robot metall armen å bevege seg mot venstre og høyre horisontalt, den nedre vertikale belte drevne lineære aktuatoren gjør at robot metall armen kan bevege seg opp og ned vertikalt (figur 1B, figur 2A ). Fire demonterbar robotarmer ble installert på den vertikale aktuatoren (figur 1C, figur 2B). Fire menneskehår børster var bundet til fire Robotic armer, henholdsvis (figur 1C, figur 2B). Alle mekaniske deler for å konstruere modellen K1 touch maskin i uthevet skrift nedenfor er merket i figur 1C (se også tabellen over materialer).
Protocol
Representative Results
Discussion
Thigmomorphogenesis er en kompleks plantevekst respons mot mekaniske forstyrrelser, som innebærer et nettverk av mobilnettet signalering og handling av phytohormones. Det er en konsekvens av adaptive utviklingen av planter for å overleve under de uønskede miljømessige forholdene25,26. Mekanisk berøring, spesielt menneskelig finger touch og håndholdt bomullsdott touch, har blitt valgt til å studere denne morfologiske endringer i tidligere thigmomorphogeneti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av følgende tilskudd: 31370315, 31570187, 31870231 (National Science Foundation of China), 16100318, 661613, 16101114, 16103615, 16103817, AoE/M-403/16 (RGC of Hong Kong). Forfattere vil gjerne takke Ju Feng Precision og automatisering Technology Limited (Shenzhen, Kina) for deres tilbud av flere skjematisk vist i figur 1.
Forfattere vil også gjerne takke S. K. Cheung og W. C. Lee for deres bidrag til utvikling av touch-Force lasting maskin.
Materials
| 4 hair brushes | customized | ||
| 4 robot arms with one holder | customized | 1000 mm length holder and 560 mm length robot arm | |
| 57 stepper motor | 57HS22-A | ||
| All purpose potting soil | Plantmate, Hong Kong | ||
| Arabidopsis plant seeds | Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH | For arabidopsis seed purchase | |
| BIO-MIX potting substratum | Jiffy Products International BV, the Netherlands | 1000682050 | Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and BIO-MIX is 1:2 |
| IL 1700 research radiometer | International Light, Newburyport, MA | The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured. | |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Free downloaded software | |
| Ju Feng Precision and Automation Technology Limited | Shenzhen, China | For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase | |
| Junction plate of the slide block | To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks | ||
| Junction plate of the X axis module | customized | To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder | |
| Slide block | |||
| WDT4045 X axis guide-rail module | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| WDT4045 Y axis guide-rail module | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| X axis auxiliary girder | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks | |
| Y axis auxiliary girder | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks |
References
- Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: the response of plant growth and development to mechanical stimulation with special reference to Bryonia dioica. Planta. 114, 143-157 (1973).
- Vandenbrink, J. P., Kiss, J. Z., Herranz, R., Medina, F. J. Light and gravity signals synergize in modulating plant development. Frontiers in Plant Science. 5, 563 (2014).
- Hashiguchi, Y., Tasaka, M., Morita, M. T. Mechanism of higher plant gravity sensing. American Journal of Botany. 100, 91-100 (2013).
- Salisbury, F. B. . The Flowering Process. , (1963).
- Darwin, C. . The Power of Movement in Plants. , (1881).
- Chehab, E. W., Eich, E., Braam, J. Thigmomorphogenesis: a complex plant response to mechano-stimulation. Journal of Experimental Botany. 60, 43-56 (2008).
- Telewski, F. W., Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: anatomical, morphological and mechanical analysis of genetically different sibs of Pinus taeda in response to mechanical perturbation. Physiologia Plantarum. 66, 219-226 (1986).
- Vogel, M. Automatic precision measurements of radial increment in a mature spruce stand and interpretation variants of short term changes in increment values. Allgemeine Forst-und Jagdzeitung. , (1994).
- Braam, J. In touch: plant responses to mechanical stimuli. New Phytologist. 165, 373-389 (2005).
- Jaffe, M. J., Leopold, A. C., Staples, R. C. Thigmo responses in plants and fungi. American Journal of Botany. 89, 375-382 (2002).
- Telewski, F. W. A unified hypothesis of mechanoperception in plants. American Journal of Botany. 93, 1466-1476 (2006).
- Gutiérrez, R. A., Ewing, R. M., Cherry, J. M., Green, P. J. Identification of unstable transcripts in Arabidopsis by cDNA microarray analysis: rapid decay is associated with a group of touch-and specific clock-controlled genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11513-11518 (2002).
- Lee, D., Polisensky, D. H., Braam, J. Genome-wide identification of touch-and darkness-regulated Arabidopsis genes: a focus on calmodulin-like and XTH genes. New Phytologist. 165, 429-444 (2005).
- Wang, K., et al. Quantitative and functional posttranslational modification proteomics reveals that TREPH1 plays a role in plant touch-delayed bolting. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 115, 10265-10274 (2018).
- Hamilton, E. S., Schlegel, A. M., Haswell, E. S. United in diversity: mechanosensitive ion channels in plants. Annual Review of Plant Biology. 66, 113-137 (2015).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352, 524 (1991).
- Toyota, M., Furuichi, T., Tatsumi, H., Sokabe, M. Cytoplasmic calcium increases in response to changes in the gravity vector in hypocotyls and petioles of Arabidopsis seedlings. Plant Physiology. 146, 505-514 (2008).
- Knight, M. R., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Wind-induced plant motion immediately increases cytosolic calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 4967-4971 (1992).
- Braam, J., Davis, R. W. Rain-, wind-, and touch-induced expression of calmodulin and calmodulin-related genes in Arabidopsis. Cell. 60, 357-364 (1990).
- Chehab, E. W., Yao, C., Henderson, Z., Kim, S., Braam, J. Arabidopsis touch-induced morphogenesis is jasmonate mediated and protects against pests. Current Biology. 22, 701-706 (2012).
- Telewski, F. W., Pruyn, M. L. Thigmomorphogenesis: a dose response to flexing in Ulmus americana seedlings. Tree Physiology. 18, 65-68 (1998).
- De Vylder, J., Vandenbussche, F. J., Hu, Y., Philips, W., Van Der Straeten, D. Rosette tracker: an open source image analysis tool for automatic quantification of genotype effects. Plant Physiology. , (2012).
- Clark, T., Bradburn, M., Love, S., Altman, D. Survival analysis part I: basic concepts and first analyses. British Journal of Cancer. 89, 232 (2003).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S., Altman, D. Survival analysis part II: multivariate data analysis–an introduction to concepts and methods. British Journal of Cancer. 89, 431 (2003).
- Jaffe, M., Forbes, S. Thigmomorphogenesis: the effect of mechanical perturbation on plants. Plant Growth Regulation. 12, 313-324 (1993).
- Kutschera, U., Niklas, K. J. Evolutionary plant physiology: Charles Darwin’s forgotten synthesis. Naturwissenschaften. 96, 1339 (2009).
