モデル植物アラビドプシスタリアナのチグモ形態形成の研究のための省力と反復可能なタッチフォースシグナル伝達変異スクリーンプロトコル
Summary
穏やかなタッチフォースローディングマシンは、人間のヘアブラシ、ロボットアーム、コントローラーから構築されています。ヘアブラシは、機械に取り付けられたロボットアームによって駆動され、植物にタッチフォースを適用するために定期的に移動します。機械駆動のヘアタッチの強さは、手動で適用されたタッチの強度に匹敵します。
Abstract
細胞内および細胞外の機械的刺激(または力信号)の両方に応答し、特別な形態変化を開発する植物は、チグモルフォジェネシスと呼ばれる。過去数十年にわたり、いくつかのシグナル伝達成分が同定され、メカノトランスダクション(例えば、カルシウムイオン結合タンパク質およびジャスモン酸生合成酵素)に関与していると報告されている。しかし、力シグナル伝達またはチグモルフォ形成の研究における研究の比較的遅いペースは、主に2つの理由に起因する:チグモルフォジェネシスの手で操作されたタッチ誘導の面倒な人間の要求と力強度誤差人の手触りに関連付けられています。植物生物の外力負荷の効率を高めるために、自動タッチフォースローディングマシンを構築しました。このロボットアーム駆動ヘアブラシタッチは、省力で簡単に再現可能なタッチフォースシミュレーション、タッチ繰り返しの無制限のラウンドと調整可能なタッチ強度を提供します。この毛髪タッチフォースローディングマシンは、タッチフォースシグナリング変異体の大規模スクリーニングと植物チグモルフォジェネシスのフェノミクス研究の両方に使用することができます。また、人間の毛髪などのタッチ素材は、動物の毛髪、絹糸や綿繊維などの他の天然素材と置き換えることができます。機械の自動移動腕は、それぞれ雨滴と風の自然な力を模倣するために、水振りノズルと空気送風機を装備することができます。この自動ヘアタッチフォースローディングマシンを手で行った綿棒タッチと組み合わせて、M AP KINASE KINASE 1(MKK1)とMKK2プラントの2つの力シグナリング変異体のタッチ応答を調べました。.タッチフォースロード野生型植物と2つの変異体のフェノームを統計的に評価した。彼らはタッチ応答に大きな違いを示した。
Introduction
植物チグモルフォジェネシスは、1973年1月にJaffe、MJによって造られた用語です。これは植物のトロピズムですが、太陽光や重力の刺激によって引き起こされるよく知られた光トロピズムや重力とは異なります 2,3.これは、初期の時間4、5で植物学者によって頻繁に観察されている周期的な機械的刺激に関連する表現力学的変化について説明する。雨滴、風、植物、動物および人間の接触、動物咬傷であっても、植物4、5における力シグナル伝達を引き起こす異なるタイプのメカノ刺激であると考えられている。植物のチグモルフォジェネシスの特徴は、ボルト締めの遅れ、より短い茎、草本植物におけるより小さいロゼット/葉のサイズ、および木質植物6、7、8の厚い茎を含む。これは、ミモザ植物または他のメカノ感受性ブドウによく見られるチグモナスチックまたはチグモトロピック応答とは異なり、これらの急速なタッチ応答は1、9、10を観察することが容易である。一方、チグモルフォジェネシスは、成長応答が遅いため観察が比較的困難である。チグモルフォジェネシスは、通常、数週間または連続的な力負荷刺激の後に観察されます。植物のタッチ応答のこのユニークな性質は、強い方法でタッチフォースシグナリング耐性変異体を分離するために、人間の手のタッチ刺激を使用して前方遺伝スクリーンを実行することが困難になります。
チグモルフォジェネシス6、11の根底にある力信号伝達経路および分子機構を解明するために、過去6、分子および細胞生物学的実験が行われてきた。12,13,14.これらの研究は、植物力シグナル受容体が主にメカノ感受性イオンチャネル(MSC)と膜スパンタンパク質の多重体複合体によって構成されるテザリングMSC複合体で構成することを提案している11,14,15.最初のタッチの数秒以内に生成された細胞質Ca2+過渡スパイク。風、雨、または重力刺激は、下流のカルシウムセンサと相互作用して、力信号を核イベント14、16、17、18に伝達してもよい。分子および細胞の研究に加えて、植物の手動指触りを持つ前方遺伝スクリーンは、植物ホルモンおよび二次代謝産物が、その後のタッチ誘導性(TCH)遺伝子発現に関与していることを発見した。タッチフォースローディング13,19.例えば、aosおよびopr3 20変異体は、遺伝的研究から遠く離れて同定されている。しかし、チグモルフォジェネシスの研究における前方遺伝学の適用に関連する主な問題は、タッチ応答のレベルを定量化し、遺伝的に変異した多数の集団に触れるのに必要な集中的な労働である。個々の植物。時間のかかる問題は、手触りベースの変異スクリーン14、20にも持続します。例えば、タッチフォース刺激の1ラウンドを完了するには、人は個々の植物で30〜60回(毎秒1タッチ)に触れる必要があります。統計的表現型解析に十分な数の植物を持つためには、通常、タッチフォースローディングプロセスには、同じ遺伝子型の20~50個の植物が必要です。このタッチフォースローディング体制は、人が選択した1つの遺伝子型に対して600-3,000タッチを繰り返し実行する必要があることを意味します。このタイプのタッチは通常、1日に3〜5ラウンド繰り返す必要があり、これは植物の遺伝子型ごとに1日あたり約1,800〜15,000本の指または綿棒のタッチに相当します。十分な訓練を受けた人は、通常、力と強度の大きな変動を避けるために、1日の繰り返しの多くのラウンドを通じて、望ましい範囲内で複数のタッチの強さと力を維持するために必要とされます。チグモルフォジェネシスが飽和性および用量依存性プロセス6、21であることがよく知られているように、タッチ力/強度は、植物のタッチ応答をトリガすることに成功するために重要になります。
人依存のタッチフォース負荷を除去し、許容誤差範囲内で機械的な適用を維持するために、我々は、したがって、手操作タッチを置き換えるために自動タッチフォースローディングマシンを設計しました。機械に4つの動く腕が造られて、それぞれ1つの人間の毛のブラシが装備されている。このバージョンは、人間の髪のタッチフォースローディングの特徴を指定するためにモデルK1と名付けられています。1台の機械下でのチグモ形態形成またはタッチ応答に対して4つの遺伝子型を定量的に測定すれば、遺伝子型当たり40~48個個体を測定することができます。タッチ繰り返しの各ラウンド(植物あたりのタッチの60回未満)は、移動速度調整可能なロボットアームを使用して5分未満持続します。したがって、モデルK1タッチマシン上の植物は、最初にプログラムされた一定のタッチフォース負荷または異なるレベルの強度を持つ1日に複数のラウンドのために機械的に刺激することができます。
したがって、モデル植物生物であるアラビドプシス・タリアナは、全自動ヘアタッチフォースローディングマシンアプリケーションをテストするためのターゲット植物種として選ばれました。変異体の様々な胚芽と開花の大きさを取り出すために利用可能ないくつかの大きな種子バンクがあるので、アラビドプシスは、モデルK1タッチマシンに取り付けられた成長棚で利用可能なスペースによくフィットします。
モデルK1自動タッチマシンは、(1)2つのベルト駆動リニアアクチュエータで構成されるH字型金属ラック、(2)ヘアブラシを装備したロボット金属アーム、(3)コントローラーの3つの主要コンポーネントで構成されています。カスタマイズされたモデルK1タッチマシンの場合、各X/Y軸モジュールは、1つのベルト駆動ガイドレール、2つのスライドブロック(赤)、1つの57ステッパーモータ(プリインストールおよび取り外し可能)で構成されています(図1A、B)。上部の水平アクチュエータは、ロボット金属アームを左右水平に動かすことを可能にし、下部垂直ベルト駆動の線形アクチュエータは、ロボット金属アームを垂直に上下に動かすことを可能にします(図1B、図2 A)).垂直アクチュエータには4本の取り外し可能なロボットアームが取り付けられました(図1C、図2B)。4本のヒト毛ブラシをそれぞれ4本のロボットアームに結合した(図1C、図2B)。下の太字フォントでモデルK1タッチマシンを構築するすべての機械部品は、図1Cにマークされています(また、材料の表を参照してください)。
Protocol
Representative Results
Discussion
チグモルフォジェネシスは、細胞シグナル伝達と植物ホルモンの作用のネットワークを含む機械的摂動に対する複雑な植物成長応答である。それは望ましくない環境条件の下で生き残るために植物の適応進化の結果である25,26.機械的な接触、特に人間の指のタッチおよび手持ち型綿棒タッチは、以前のチグモ形態遺伝学的研究14、20</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、以下の助成金によって支援されました: 31370315, 31570187, 31870231 (中国国立科学財団), 16100318, 661013, 16101114, 16103615, 16103617, AoE/M-4GC/香港(香港)。著者は、図1に示すいくつかの回路図の提供のためにJu Feng Precisionとオートメーション技術リミテッド(深セン、中国)に感謝したいと思います。
著者はまた、タッチフォースローディングマシンの開発に貢献してくれたS.K.チャンとW.C.リーに感謝したいと思います。
Materials
| 4 hair brushes | customized | ||
| 4 robot arms with one holder | customized | 1000 mm length holder and 560 mm length robot arm | |
| 57 stepper motor | 57HS22-A | ||
| All purpose potting soil | Plantmate, Hong Kong | ||
| Arabidopsis plant seeds | Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH | For arabidopsis seed purchase | |
| BIO-MIX potting substratum | Jiffy Products International BV, the Netherlands | 1000682050 | Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and BIO-MIX is 1:2 |
| IL 1700 research radiometer | International Light, Newburyport, MA | The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured. | |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Free downloaded software | |
| Ju Feng Precision and Automation Technology Limited | Shenzhen, China | For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase | |
| Junction plate of the slide block | To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks | ||
| Junction plate of the X axis module | customized | To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder | |
| Slide block | |||
| WDT4045 X axis guide-rail module | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| WDT4045 Y axis guide-rail module | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| X axis auxiliary girder | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks | |
| Y axis auxiliary girder | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks |
References
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