En arbetsbesparande och repeterbara touch-Force signalering Mutant skärm protokoll för studiet av Thigmomorphogenesis av en modell växt Arabidopsis thaliana
Summary
En skonsam lastmaskin är byggd av människohår borstar, robotarmar och en Controller. Hårborstarna drivs av robotarmar installerade på maskinen och flytta regelbundet för att tillämpa touch-Force på växter. Styrkan i maskin-driven hår berör är jämförbar med den manuellt applicerade Detaljer.
Abstract
Växter som svarar på både intracellulära och extracellulära mekaniska stimuleringar (eller kraft signaler) och utveckla speciella morfologiska förändringar, en som kallas thigmomorphogenesis. Under de senaste decennierna har flera signaleringskomponenter identifierats och rapporterats för att vara involverade i mechanotransduction (t. ex. kalcium jonbindning proteiner och bildar Acid biosyntes enzymer). Men den relativt långsamma forsknings takten i studiet av Force signalering eller thigmomorphogenesis tillskrivs till stor del två skäl: kravet på mödosam mänsklig hand manipulerade touch induktion av tigmomorphogenesis och Force Strength fel förknippas med människors hand-touch. För att öka effektiviteten av yttre kraft lastning på en växtorganism, en automatisk touch-Force lastning maskin byggdes. Denna robot arm-driven hårborste berör ger en arbetsbesparande och lätt upprepningsbara touch-Force simulering, obegränsade rundor av touch upprepning och justerbar touch styrka. Detta hår touch-Force lastning maskin kan användas för både storskalig screening av touch-Force signalering mutanter och phenomics studie av växten tigmomorphogenesis. Dessutom, beröring material som människohår, kan ersättas med andra naturliga material som djurhår, silkestrådar och bomullsfibrer. Den automatiserade rörliga armar på maskinen kan utrustas med vattenstänk munstycken och luftblåsare för att efterlikna de naturliga krafterna av regndroppar och vind, respektive. Genom att använda denna automatiska hår touch-Force lastning maskin i kombination med hand-framförd bomullspinne röra, har vi undersökt touch svar av två Force signalering mutanter, MAP kinase kinase 1 (MKK1) och MKK2 växter . Phenomes av de laddade Wild typ växterna för handlag-Force och två mutanter utvärderades statistiskt. De har uppvisat betydande skillnader i beröring svar.
Introduction
Plant thigmomorphogenesis är en term som myntades av Jaffe, MJ i 19731. Det är en växt tropism men skiljer sig från den välkända phototropism eller gravitropism orsakad av stimuli av solljus eller gravitation2,3. Den beskriver fenotypiska förändringar i samband med periodiska mekaniska stimuleringar, som ofta har observerats av botanister i tidigare tider4,5. Regndroppar, vind, växt, djur och mänskliga berör, även djurbett, anses alla vara olika typer av Mechano-stimuli som utlöser kraft signalering i växter4,5. Egenskaper hos växten tigmomorphogenesis inkluderar förseningen av bultning, en kortare stam, mindre Rosette/bladstorlek i örtartade växter, och tjockare stam i vedartade växter6,7,8. Detta är till skillnad från den thigmonastic eller thigmotropic svar som ofta finns i Mimosa växten eller andra Mechano-känsliga vinstockar, där dessa snabba beröring svar är lättare att observeras1,9,10. Tigmomorphogenesis, å andra sidan, är relativt svårt att observeras på grund av dess långsamma tillväxt svar. Tigmomorphogenesis observeras vanligtvis efter veckor eller till och med år av kontinuerlig kraft lastning stimulering. Denna unika karaktär av växt beröring svar gör det svårt att utföra en framåt genetisk skärm med hjälp av mänsklig hand touch stimulering för att isolera touch-Force signal resistenta mutanter på ett robust sätt.
För att belysa kraften signal signaltransduktion vägar och de molekylära mekanismerna bakom thigmomorphogenesis6,11, molekylära och cellulära biologiska experiment har utförts under de senaste6, 12,13,14. Dessa studier har föreslagit att VÄXTKRAFTEN signal receptorer består huvudsakligen av mechanosensitive jonkanaler (MSC) och tjudrad MSC komplex består av multimeric komplex av membran-Spanning proteiner11,14 , 15. cytoplasmiska ca2 + övergående Spike genereras inom några sekunder efter den första beröring. Vind-, regn-, eller gravi-stimulering kan interagera med nedströms kalcium sensorer för att transduce kraften signaler till nukleära händelser14,16,17,18. Förutom molekylära och cellulära studier, den främre genetiska skärmen med manuell finger beröring av växter har funnit att fytohormoner och sekundära metaboliter är inblandade i den därav beröring-inducerbara (TCH) genuttryck efter Tryck-kraft lastning13,19. För exempel, AOS och opr320 mutanter har identifierats hittills från genetiska studier. Emellertid, det stora problemet i samband med tillämpningen av den framåt genetik i studien av tigmomorphogenesis är fortfarande den intensiva arbete som krävs för att kvantitera nivån på beröring svar och röra en stor population av genetiskt muterade enskilda anläggningar. Den tidskrävande frågan kvarstår också i handen beröring-baserade Mutant skärm14,20. För ett exempel, för att slutföra en omgång av touch-Force stimulering, en person behöver röra 30-60 gånger (en tryckning per sekund) på en enskild anläggning. För att få tillräckligt många växter för statistisk analys av fenotyp, krävs normalt 20-50 enskilda plantor av samma genotyp för den berörande belastnings processen. Denna touch-Force lastning regim innebär att en person behöver upprepade utföra 600-3000 berör en genotyp av val. Denna typ av beröring normalt måste upprepas 3 till 5 rundor om dagen, vilket motsvarar ungefär 1800-15000 finger eller bomullspinne berör per dag per genotyp av växter. En välutbildad person är normalt krävs för att bibehålla styrkan och kraften i flera inslag inom ett önskvärt intervall under många omgångar av upprepning på en dag för att undvika den stora variationen i kraft och styrka. Eftersom det är välkänt att tigmomorphogenesis är en mättningsbar och dosberoende process6,21, touch Force/Strength blir kritisk till en framgång i utlösande beröring svar av en anläggning.
För att ta bort den person beroende touch-Force lastning och för att bibehålla mekanisk tillämpning inom ett godtagbart fel område14, vi konstruerade därför en automatisk touch-Force lastning maskin för att ersätta de handmanipulerade berör. Maskinen har 4 rörliga armar byggda, som var och en är utrustad med en mänsklig hårborste. Denna version heter Model K1 för att specificera dess funktion av människohår touch-Force lastning. Om 4 genotyper mäts kvantitativt för sin tigmomorphogenesis eller beröring svar under en maskin, 40-48 individer per genotyp kan mätas. Varje omgång av touch upprepning (mindre än 60 gånger per planta) varar mindre än 5 minuter med en rörlig hastighet justerbar robotarm. Sålunda, växter på en modell K1 touch maskin kan mekaniskt stimuleras för flera omgångar om dagen antingen med en konstant touch-Force lastning eller olika nivåer av styrkor som initialt programmerade.
Arabidopsis thaliana, en modell växtorganism, valdes därför som mål växtarter för att testa den helautomatiska hår touch-Force lastning maskin ansökan. Eftersom det finns flera stora fröbanker tillgängliga för att hämta de olika arvsmassa av mutanter och storleken på blomningen, passar Arabidopsis väl till det utrymme som finns i tillväxt hylla monterad med modellen K1 touch maskin.
Modell K1 automatisk touch maskin består av tre huvudkomponenter: (1) H-form metall rack består av två remdrivna linjära manöverdon, (2) Robotic metall armar utrustade med hårborstar, och (3) en styrenhet. För en anpassad modell K1 touch maskin, varje X/Y Axelmodul består av en bälte-driven guide-Rail, två glid block (röd) och 1 57 stegmotor (förinstallerade och demonteras) (figur 1a,B). Det övre horisontella ställdon gör det möjligt för robot metall armen att flytta vänster och höger horisontellt, det undre vertikala remdrivna linjära ställdon gör det möjligt för robot metall armen att röra sig uppåt och nedåt vertikalt (figur 1B, figur 2A ). Fyra demonteras robotarmar installerades på det vertikala manöverdonet (figur 1C, figur 2B). Fyra människohår borstar var bundna till fyra robotarmar, respektive (figur 1C, figur 2B). Alla mekaniska delar att konstruera modellen K1 touch Machine i fetstil teckensnitt nedan är markerade i figur 1C (se även tabellen av material).
Protocol
Representative Results
Discussion
Thigmomorphogenesis är en komplex växttillväxt svar mot mekaniska störningar, som innebär ett nätverk av cellulära signalering och åtgärder av fytohormoner. Det är en följd av adaptiv evolution av växter för att överleva under de oönskade miljöförhållandena25,26. Mekanisk beröring, särskilt mänskliga finger beröring och handhållna bomullspinne touch, har valts för att studera denna morfologiska förändringar i tidigare tigmomorfogenetiska…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av följande bidrag: 31370315, 31570187, 31870231 (National Science Foundation of China), 16100318, 661613, 16101114, 16103615, 16103817, AoE/M-403/16 (RGC of Hong Kong). Författarna vill tacka ju Feng precision och automation Technology Limited (Shenzhen, Kina) för deras erbjudande av flera scheman som visas i figur 1.
Författarna skulle också vilja tacka S. K. Cheung och W. C. Lee för deras bidrag till utvecklingen av touch-Force lastning maskin.
Materials
| 4 hair brushes | customized | ||
| 4 robot arms with one holder | customized | 1000 mm length holder and 560 mm length robot arm | |
| 57 stepper motor | 57HS22-A | ||
| All purpose potting soil | Plantmate, Hong Kong | ||
| Arabidopsis plant seeds | Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH | For arabidopsis seed purchase | |
| BIO-MIX potting substratum | Jiffy Products International BV, the Netherlands | 1000682050 | Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and BIO-MIX is 1:2 |
| IL 1700 research radiometer | International Light, Newburyport, MA | The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured. | |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Free downloaded software | |
| Ju Feng Precision and Automation Technology Limited | Shenzhen, China | For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase | |
| Junction plate of the slide block | To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks | ||
| Junction plate of the X axis module | customized | To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder | |
| Slide block | |||
| WDT4045 X axis guide-rail module | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| WDT4045 Y axis guide-rail module | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| X axis auxiliary girder | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks | |
| Y axis auxiliary girder | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks |
References
- Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: the response of plant growth and development to mechanical stimulation with special reference to Bryonia dioica. Planta. 114, 143-157 (1973).
- Vandenbrink, J. P., Kiss, J. Z., Herranz, R., Medina, F. J. Light and gravity signals synergize in modulating plant development. Frontiers in Plant Science. 5, 563 (2014).
- Hashiguchi, Y., Tasaka, M., Morita, M. T. Mechanism of higher plant gravity sensing. American Journal of Botany. 100, 91-100 (2013).
- Salisbury, F. B. . The Flowering Process. , (1963).
- Darwin, C. . The Power of Movement in Plants. , (1881).
- Chehab, E. W., Eich, E., Braam, J. Thigmomorphogenesis: a complex plant response to mechano-stimulation. Journal of Experimental Botany. 60, 43-56 (2008).
- Telewski, F. W., Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: anatomical, morphological and mechanical analysis of genetically different sibs of Pinus taeda in response to mechanical perturbation. Physiologia Plantarum. 66, 219-226 (1986).
- Vogel, M. Automatic precision measurements of radial increment in a mature spruce stand and interpretation variants of short term changes in increment values. Allgemeine Forst-und Jagdzeitung. , (1994).
- Braam, J. In touch: plant responses to mechanical stimuli. New Phytologist. 165, 373-389 (2005).
- Jaffe, M. J., Leopold, A. C., Staples, R. C. Thigmo responses in plants and fungi. American Journal of Botany. 89, 375-382 (2002).
- Telewski, F. W. A unified hypothesis of mechanoperception in plants. American Journal of Botany. 93, 1466-1476 (2006).
- Gutiérrez, R. A., Ewing, R. M., Cherry, J. M., Green, P. J. Identification of unstable transcripts in Arabidopsis by cDNA microarray analysis: rapid decay is associated with a group of touch-and specific clock-controlled genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11513-11518 (2002).
- Lee, D., Polisensky, D. H., Braam, J. Genome-wide identification of touch-and darkness-regulated Arabidopsis genes: a focus on calmodulin-like and XTH genes. New Phytologist. 165, 429-444 (2005).
- Wang, K., et al. Quantitative and functional posttranslational modification proteomics reveals that TREPH1 plays a role in plant touch-delayed bolting. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 115, 10265-10274 (2018).
- Hamilton, E. S., Schlegel, A. M., Haswell, E. S. United in diversity: mechanosensitive ion channels in plants. Annual Review of Plant Biology. 66, 113-137 (2015).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352, 524 (1991).
- Toyota, M., Furuichi, T., Tatsumi, H., Sokabe, M. Cytoplasmic calcium increases in response to changes in the gravity vector in hypocotyls and petioles of Arabidopsis seedlings. Plant Physiology. 146, 505-514 (2008).
- Knight, M. R., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Wind-induced plant motion immediately increases cytosolic calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 4967-4971 (1992).
- Braam, J., Davis, R. W. Rain-, wind-, and touch-induced expression of calmodulin and calmodulin-related genes in Arabidopsis. Cell. 60, 357-364 (1990).
- Chehab, E. W., Yao, C., Henderson, Z., Kim, S., Braam, J. Arabidopsis touch-induced morphogenesis is jasmonate mediated and protects against pests. Current Biology. 22, 701-706 (2012).
- Telewski, F. W., Pruyn, M. L. Thigmomorphogenesis: a dose response to flexing in Ulmus americana seedlings. Tree Physiology. 18, 65-68 (1998).
- De Vylder, J., Vandenbussche, F. J., Hu, Y., Philips, W., Van Der Straeten, D. Rosette tracker: an open source image analysis tool for automatic quantification of genotype effects. Plant Physiology. , (2012).
- Clark, T., Bradburn, M., Love, S., Altman, D. Survival analysis part I: basic concepts and first analyses. British Journal of Cancer. 89, 232 (2003).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S., Altman, D. Survival analysis part II: multivariate data analysis–an introduction to concepts and methods. British Journal of Cancer. 89, 431 (2003).
- Jaffe, M., Forbes, S. Thigmomorphogenesis: the effect of mechanical perturbation on plants. Plant Growth Regulation. 12, 313-324 (1993).
- Kutschera, U., Niklas, K. J. Evolutionary plant physiology: Charles Darwin’s forgotten synthesis. Naturwissenschaften. 96, 1339 (2009).
