Syftet med denna artikel är att beskriva ett protokoll för extraktion av vattenhaltiga metaboliter från odlade anhängare celler för metabolomiska analys, särskilt kapillär elektrofores-masspektrometri.
Metabolomic analys är en lovande Omics strategi för att inte bara förstå den specifika metaboliska regleringen i cancer celler jämfört med normala celler, men också för att identifiera bio markörer för tidigt stadium cancer upptäckt och förutsägelse av kemoterapi svar i patienter med cancer. Beredning av enhetliga prover för metabolomisk analys är en kritisk fråga som återstår att ta itu med. Här presenterar vi ett enkelt och tillförlitligt protokoll för extraktion av vattenhaltiga metaboliter från odlade ansittande celler för metabolomiska analys med hjälp av kapillärelektrofores-masspektrometri (CE-MS). Vattenhaltiga metaboliter från odlade celler analyseras genom odling och tvättning av celler, behandling av celler med metanol, extrahering av metaboliter och avlägsnande av proteiner och makro molekyler med rotations kolonner för CE-MS-analys. Representativa resultat med hjälp av lung cancer cellinjer som behandlats med diamid, en oxidativ reagens, illustrerar tydligt observerbar metabolisk förskjutning av celler under oxidativ stress. Denna artikel skulle vara särskilt värdefullt för studenter och utredare som deltar i metabolomik forskning, som är nya för att skörda metaboliter från cellinjer för analys av CE-MS.
Otto Warburg observerade att cancer celler förvärva ovanliga förmåga att ta upp glukos och jäsa det att producera laktat i närvaro av adekvat syre-ett fenomen som kallas Warburg effekt eller aeroba Glykolys1,2. Mitokondriell respirationsdefekter spekuleras som den underliggande grunden för aeroba Glykolys i cancer celler3. Faktum är att Warburg effekten är grunden för tumör avbildning av fluordeoxyglucose (FDG)-positron emission tomografi (PET), som ofta används i klinisk praxis4,5. En hög grad av aerob Glykolys anses vara ett viktigt inslag i cancer och har nyligen antagits som en av de välkända “kännetecken för cancer,” som beskrivs av D. Hanahan och B. Weinberg6. Somatiska mutationer i onkogener och tumörsuppressorgener – såsom Hras/kras/nras, EGFR, BRAF, myc, TP53, isocitrat dehydrogenas (Idh) och fumarathydratas (FH )-har kopplats till specifika metaboliska förändringar i cancer celler, tros vara ett resultat av Warburg effekt7.
Metabolomic analys är en lovande metod inte bara för att förstå metabolisk reglering i cancer celler utan också för att identifiera tidigt stadium cancer bio markörer och kemoterapi svar förutsägelse. Efter behandling av känsliga eller resistenta cancer celler med cancer föreningar, spårning av deras metaboliska svar underlättar identifiering av metabola bio markörer för att förutsäga effekten av specifika cancer terapier hos patienter8 ,9,10,11. I denna artikel, cancer cellinjer härrör från en lung adenocarcinom med en EGFR -mutation som behandlats med diamid-som orsakar oxidativ stress-användes som modeller för metabolomiska analys. Fördelen med denna analys metod med kapillärelektrofores-masspektrometri (CE-MS) är dess omfattande mätning av laddade metaboliter med massa intervallet m/z 50-100012,13. Syftet med denna artikel är att ge nybörjare en detaljerad stegvist visuellt protokoll för beredning av vattenhaltiga metaboliter från odlade cancer celler och efterföljande metabolomiska analys, särskilt av CE-MS.
Här beskriver vi en allmänt tillgänglig metod för att förbereda metaboliter från odlade cancer celler för CE-MS-baserad metabolomiska analys. En av de mest kritiska punkterna i detta protokoll är korrekt beredning av cancer celler, eftersom uppmätta metaboliten koncentrationer normaliseras till antalet livskraftiga celler. För noggrann uppskattning av cell nummer, är det nödvändigt att förbereda minst en ytterligare odlings mat rätt per experimentell grupp för att räkna antalet livskraftiga celler parallellt med utvinning av metaboliter för metabolomiska analys. Dessutom bör samma antal celler vara seedade i varje mat rätt för replikaten och i skålen för räkning; i framtiden, detta skulle vara hjälpt av en snabb och stressor-fri (t. ex. trypsin-Free) cell räknings protokoll som gör att samma mat rätt som skall användas för både räkna livskraftiga celler och extrahera metaboliter. Försiktighet bör iakttas vid tvättar så att cellerna inte lossnar från ytan av rätterna. Allvarliga cytotoxicitetsundersökningar och andra experiment som minskar celladhesion kan vara olämpliga för detta extraktionsprotokoll på grund av potentiell förlust av celler under tvätt proceduren.
Det är viktigt att använda en 5% mannitol lösning som tvättbuffert för extraktion av metaboliter från odlade celler för CE-MS-baserad metabolomiska analys, eftersom saltbaserade buffertar, såsom PBS, interfererar med metabolomiska analys och negativt påverka mätningen.
Två eller tre rätter kan kombineras som ett enda prov genom att individuellt extrahera metaboliter från varje mat rätt och sedan poolning prover; men att kombinera flera rätter ökar ofta resterande mannitol i den extraherade metaboliten lösning. Detta kan också störa metabolomiska analys av CE-MS. Därför rekommenderas att inte använda flera rätter eller brunnar som ett enda prov.
Denna metabolomiska analys metod med CE-MS har utvecklats för heltäckande mätning av laddade molekyler med molekyl vikter mellan 50 och 1000 da; Därför är detta protokoll optimerad för utvinning av vattenhaltiga, låg molekyl ära vikt föreningar. Därför är detta protokoll inte lämpligt för extraktion av hydrofoba metaboliter såsom lipider eller makro molekyler såsom proteiner och nukleinsyror. Eftersom det finns en ökande efter frågan på omfattande lipidanalyser eller lipidomik av odlade cellprover, behövs utveckling av ett enkelt och effektivt protokoll för samtidig utvinning av både hydrofila och hydrofoba metaboliter.
Det första steget av metabolismextraktion – aspirera medel-och tvätt celler med mannitol – bör genomföras så snabbt som möjligt för att minimera förändringar av cellernas metaboliska profil. Behandling av celler med metanol efter tvättning med mannitol antas denaturera proteiner och därmed förhindra enzymer från att katalysera ytterligare metaboliska reaktioner. Men även efter metanol behandling, icke-enzymatiska kemiska reaktioner-såsom Redox reaktioner, vissa dekarboxylering processer, och tiol kopplingar-kan äga rum. Därför bör alla koncentrationer av metaboliter som är involverade i dessa reaktioner mätta med detta protokoll tolkas med försiktighet. I motsats till arvs massan eller transkriptomen består metabolomet av molekyler med en mängd olika kemiska egenskaper; Därför kan inget enda protokoll extrahera alla metaboliter utan förlust eller störning. För mer exakta mätningar av sådana mycket reaktiva metaboliter, ett protokoll som utformats särskilt för att extrahera vissa grupper av metaboliter, som kräver fraktionering och derivatizations, bör konsulteras. Det protokoll som presenteras här beskriver dock en enkel och snabb extraktion av vattenhaltiga metaboliter från odlade cellprover för metabolomiska analys av CE-MS. I detta dokument kunde vi inte beskriva hur man ställer in CE-MS i detalj eftersom fokus för det nuvarande Manuskriptet är annorlunda, men att beskriva detaljerade steg för att inrätta CE-MS kan kräva en separat dedikerad artikel.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar alla medlemmar i Shonai regional Industry Promotion Center för deras hjälp. Detta arbete stöddes delvis av forsknings medel från Yamagata prefektur och Tsuruoka City, av National Cancer Center forsknings-och utvecklings fonden [Grant nummer 28-A-9], och av det japanska sällskapet för främjande av vetenskap (JSPS) KAKENHI [bidrags nummer 17K07189] till HM.
Automated cell counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | Countess II automated cell counter |
Automatic integration software | Agilent Technologies | MassHunter G3335-60041 | version B.02.00 |
CE system | Agilent Technologies | Agilent 7100 CE system | |
CE/MS adapter kit | Agilent Technologies | G1603A | |
CE-ESI-MS Sprayer kit | Agilent Technologies | G1607A | |
Cell counting chamber slide | Thermo Scientific | C10282 | Countess cell counting chamber slides |
Centrifugal filter device, 5 kDa | Human Metabolome Technologies | ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT | |
Conical sterile polypropylene tube, 15 ml | Thermo Scientific | N339651 | |
Conical sterile polypropylene tube, 50 ml | Thermo Scientific | N339653 | |
Costar stripette, 10 ml | Corning | 4488 | |
Costar stripette, 5 ml | Corning | 4487 | |
D(-)-Mannitol | Wako | 133-00845 | 500 g |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3301-1001 | for cation analysis |
Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3302-1021 | for anion analysis |
Fetal bovine serum | Biowest | S1780 | |
Filter tip, 1000 μl | Watson | 124P-1000S | |
Filter tip, 20 μl | Watson | 124P-20S | |
Filter tip, 200 μl | Watson | 1252-703CS | |
Fused silica capillary | Polymicro Technologies | TSP050375 | 50 μm i.d. × 80 cm total length |
HCC827 | American Type Culture Collection | CRL-2868 | |
Internal standard solution | Human Metabolome Technologies | H3304-1002 | |
Isocratic pump | Agilent Technologies | Agilent 1100 Series Isocratic Pump | |
Methanol | Wako | 138-14521 | 1 L, LC/MS grade |
Microtube, 1.5 ml | Watson | 131-415C | |
Operating Software | Agilent Technologies | ChemStation G2201AA | version B.03.01 for CE |
PC-9 | RIKEN Bio Resource Center | RCB4455 | |
RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-500ML | |
Sterile tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
Time-of-flight mass spectrometer | Agilent Technologies | Agilent G1969A Time-of-Flight LC/MS | |
Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Scientific | T10282 | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
Ultrapure water | Merck | Milli-Q water | 18.2 MΩ・cm pure water |
Volumetric flask, 50 ml | Iwaki | 5640FK50E | TE-32 |