Formålet med denne artikkelen er å beskrive en protokoll for ekstraksjon av vandige metabolitter fra kultivert tilhenger celler for metabolomic analyse, spesielt, kapillær elektroforese-masse massespektrometri.
Metabolomic analyse er en lovende omics tilnærming til ikke bare å forstå den spesifikke metabolske regulering i kreftceller i forhold til normale celler, men også å identifisere biomarkører for tidlig stadium kreft deteksjon og prediksjon av kjemoterapi respons i kreftpasienter. Utarbeidelse av ensartede prøver for metabolomic analyse er et kritisk problem som gjenstår å bli behandlet. Her presenterer vi en enkel og pålitelig protokoll for å utvinne vandige metabolitter fra kultivert tilhenger celler for metabolomic analyse ved hjelp av kapillær elektroforese-Mass massespektrometri (CE-MS). Vandige metabolitter fra kulturperler analyseres av dyrking og vaske celler, behandling av celler med metanol, utpakking av metabolitter og fjerning av proteiner og makromolekyler med spin-kolonner for CE-MS-analyse. Representative resultater ved bruk av lungekreft cellelinjer behandlet med diamide, en oksidativt reagens, illustrerer tydelig synlig metabolske forskyvning av cellene under oksidativt stress. Denne artikkelen vil være spesielt verdifullt for studenter og etterforskere involvert i Plantemetabolomikk forskning, som er nye til høsting metabolitter fra cellelinjer for analyse av CE-MS.
Otto Warburg observerte at kreftceller erverve uvanlig evne til å ta opp glukose og gjære det å produsere melkesyre i nærvær av tilstrekkelig oksygen-et fenomen betegnes som Warburg effekt eller aerobic Glykolysen1,2. Mitokondrie åndedrett defekter er spekulert som det underliggende grunnlaget for aerob Glykolysen i kreftceller3. Faktisk er Warburg effekten grunnlaget for tumor Imaging av fluorodeoxyglucose (FDG)-positron utslipp tomografi (pet), som er mye brukt i klinisk praksis4,5. En høy grad av aerobic Glykolysen regnes som en viktig funksjon av kreft og har nylig blitt vedtatt som en av de velkjente “kjennetegn av kreft,” som beskrevet av D. Hanahan og B. Weinberg6. Somatiske mutasjoner i oncogenes og tumor Suppressor gener-som HRAS/KRAS/NRAS, EGFR, BRAF, myC, TP53, isocitrate dehydrogenase (IDH), og fumarat hydratase (FH )-har vært knyttet til bestemte metabolske endringer i kreftceller, antas å være et resultat av Warburg effekt7.
Metabolomic analyse er en lovende tilnærming ikke bare å forstå metabolsk regulering i kreftceller, men også å identifisere tidlig stadium kreft biomarkører og kjemoterapi respons prediksjon. Etter behandling av følsomme eller resistente kreftceller med anticancer forbindelser, sporing av deres metabolske responser forenkler identifisering av metabolske biomarkører å forutsi effekten av spesifikke anticancer behandling hos kreftpasienter8 ,9,10,11. I denne artikkelen, kreftcelle linjer avledet fra en lunge adenokarsinom med en EGFR mutasjon behandlet med diamide-som forårsaker oksidativt stress-ble brukt som modeller for metabolomic analyse. Fordelen med denne analytiske metoden ved hjelp av kapillær elektroforese-Mass massespektrometri (CE-MS) er dens omfattende måling av belastes metabolitter med masse området m/z 50-100012,13. Hensikten med denne artikkelen er å gi nybegynnere en detaljert trinnvis visuell protokoll for utarbeidelse av vandige metabolitter fra kultivert kreftceller og påfølgende metabolomic analyse, spesielt av CE-MS.
Her beskriver vi en allment tilgjengelig metodikk for å forberede metabolitter fra kulturperler av kultivert kreftceller for CE-MS-baserte metabolomic analyse. En av de mest kritiske punktene i denne protokollen er riktig utarbeidelse av kreftceller, fordi målt metabolitten konsentrasjoner er normalisert til antall levedyktige celler. For nøyaktig estimering av celle nummer, er det nødvendig å utarbeide minst en ekstra kultur parabolen per eksperimentell gruppe for å telle antall levedyktige celler parallelt med ekstraksjon av metabolitter for metabolomic analyse. I tillegg bør det samme antall celler bli sådd i hver rett for de replikerer og i parabolen for telling; i fremtiden, vil dette bli hjulpet av en rask og stressor (f. eks Trypsin-Free) celle telling protokoll som gjør at samme rett til å bli brukt til både å telle levedyktige celler og utvinne metabolitter. Forsiktighet bør utvises under vask, slik at cellene ikke løsner fra overflaten av rettene. Alvorlige cytotoksisitet tester og andre eksperimenter som reduserer celle vedheft, kan være uegnet for denne utvinnings protokollen på grunn av potensielt tap av celler under vaskeprosessen.
Det er viktig å bruke en 5% mannitol løsning som vaskebuffer for å utvinne metabolitter fra kultivert celler for CE-MS-baserte metabolomic analyse, fordi salt-baserte buffere, som PBS, forstyrrer metabolomic analyse og negativt påvirke målingen.
To eller tre retter kan kombineres som et enkelt utvalg av individuelt utvinne metabolitter fra hver tallerken og deretter pooling prøver; men å kombinere flere retter øker ofte gjenværende mannitol i den utpakkede metabolitten løsning. Dette kan også påvirke metabolomic analyse av CE-MS. Derfor anbefales det å ikke bruke flere retter eller brønner som en enkelt prøve.
Denne metabolomic analysemetoden med CE-MS er utviklet for omfattende måling av molekyler med molekylære vekter mellom 50 og 1000 da; Dermed er denne protokollen optimalisert for ekstraksjon av vandige, lav molekylvekt forbindelser. Derfor er denne protokollen ikke egnet for å utvinne hydrofobe metabolitter som lipider eller makromolekyler som proteiner og nukleinsyre syrer. Siden det er en økende etterspørsel etter omfattende lipid analyser eller lipidomics av kultivert celleprøver, utvikling av en enkel og effektiv protokoll for samtidig ekstraksjon av både hydrofile og hydrofobe metabolitter er nødvendig.
Det første trinnet av metabolitten ekstraksjon-aspirating medium og vaske celler med mannitol-bør gjennomføres så raskt som mulig for å minimere endringer i metabolsk profil av cellene. Behandling av celler med metanol etter vask med mannitol antas å denaturere proteiner og dermed hindre enzymer fra katalyserende ytterligere metabolske reaksjoner. Men selv etter metanol behandling, ikke-enzymatisk kjemiske reaksjoner-som Redox reaksjoner, noen dekarboksylering prosesser, og tiolderivat sammenhengene-kan finne sted. Som sådan bør alle konsentrasjoner av metabolitter som er involvert i disse reaksjonene som måles av denne protokollen, tolkes med forsiktighet. I motsetning til Genova eller transcriptome, består metabolome av molekyler med et bredt utvalg av kjemiske egenskaper; Derfor kan ingen enkelt protokoll trekke ut alle metabolitter uten tap eller forstyrrelse. For mer nøyaktige målinger av slike svært reaktive metabolitter, en protokoll spesielt utformet for å trekke ut visse grupper av metabolitter, som krever fraksjoneringer og derivatizations, bør konsulteres. Protokollen som presenteres her, men beskriver en enkel og rask ekstraksjon av vandige metabolitter fra kultivert celleprøver for metabolomic analyse av CE-MS. I denne utredningen vi ikke kunne beskrive hvordan du setter opp CE-MS i detalj fordi fokuset i dagens manuskript er forskjellig, men beskriver detaljert fremgangsmåte for å sette opp CE-MS kan kreve en egen dedikert artikkel.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker alle medlemmer av Shonai Regional Industry Promotion Center for deres hjelp. Dette arbeidet ble støttet delvis av forskningsmidler fra Yamagata Prefecture og Tsuruoka City, av National Cancer Center forskning og utvikling Fund [gi nummer 28-A-9], og av Japan Society for fremme av vitenskap (JSP) KAKENHI [gi nummer 17K07189] til HM.
Automated cell counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | Countess II automated cell counter |
Automatic integration software | Agilent Technologies | MassHunter G3335-60041 | version B.02.00 |
CE system | Agilent Technologies | Agilent 7100 CE system | |
CE/MS adapter kit | Agilent Technologies | G1603A | |
CE-ESI-MS Sprayer kit | Agilent Technologies | G1607A | |
Cell counting chamber slide | Thermo Scientific | C10282 | Countess cell counting chamber slides |
Centrifugal filter device, 5 kDa | Human Metabolome Technologies | ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT | |
Conical sterile polypropylene tube, 15 ml | Thermo Scientific | N339651 | |
Conical sterile polypropylene tube, 50 ml | Thermo Scientific | N339653 | |
Costar stripette, 10 ml | Corning | 4488 | |
Costar stripette, 5 ml | Corning | 4487 | |
D(-)-Mannitol | Wako | 133-00845 | 500 g |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3301-1001 | for cation analysis |
Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3302-1021 | for anion analysis |
Fetal bovine serum | Biowest | S1780 | |
Filter tip, 1000 μl | Watson | 124P-1000S | |
Filter tip, 20 μl | Watson | 124P-20S | |
Filter tip, 200 μl | Watson | 1252-703CS | |
Fused silica capillary | Polymicro Technologies | TSP050375 | 50 μm i.d. × 80 cm total length |
HCC827 | American Type Culture Collection | CRL-2868 | |
Internal standard solution | Human Metabolome Technologies | H3304-1002 | |
Isocratic pump | Agilent Technologies | Agilent 1100 Series Isocratic Pump | |
Methanol | Wako | 138-14521 | 1 L, LC/MS grade |
Microtube, 1.5 ml | Watson | 131-415C | |
Operating Software | Agilent Technologies | ChemStation G2201AA | version B.03.01 for CE |
PC-9 | RIKEN Bio Resource Center | RCB4455 | |
RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-500ML | |
Sterile tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
Time-of-flight mass spectrometer | Agilent Technologies | Agilent G1969A Time-of-Flight LC/MS | |
Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Scientific | T10282 | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
Ultrapure water | Merck | Milli-Q water | 18.2 MΩ・cm pure water |
Volumetric flask, 50 ml | Iwaki | 5640FK50E | TE-32 |