Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Обогащение частиц липопротеинов коренных народов с микроРНК и последующее определение их абсолютной/относительной микроРНК содержание и их сотовой скорость передачи

Published: May 9, 2019 doi: 10.3791/59573
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2
1Center for Pathobiochemistry and Genetics, Institute of Medical Chemistry and Pathobiochemistry, Medical University Vienna, 2School of Medical Engineering and Applied Social Sciences, University of Applied Sciences Upper Austria

Summary

Здесь представлен количественный протокол на основе полимеразной цепной реакции в реальном времени для определения родного микро-РНК-содержимого (Абсолютные/относительные) частиц липопротеинов. Кроме того, демонстрируется метод увеличения уровня микро-РНК, а также метод определения скорости поглощения частиц липопротеинов в сотовой сети.

Abstract

Липопротеины частицы преимущественно транспортеры липидов и холестерина в крови. Кроме того, они содержат небольшое количество нитей некодирующих микроРНК (Мирна). В целом, miRNA изменяет профиль экспрессии белка из-за взаимодействий с Messenger-РНК (мРНК). Таким образом, знание относительного и абсолютного Мирна содержание липопротеинов частиц имеет важное значение для оценки биологического эффекта поглощения клеточных частиц. Здесь, количественные режиме реального времени полимеразной цепной реакции (qPCR) на основе протокола представлен определить абсолютное содержание miRNA липопротеинов частиц-примером показаны для родных и miRNA обогащенные частицы липопротеинов. Относительное содержание miRNA количественно с помощью мультихорошо микрофлюидной карты массива. Кроме того, этот протокол позволяет ученым оценить клеточный miRNA и, таким образом, уровень поглощения липопротеинов частиц. Значительное увеличение клеточного уровня miRNA наблюдается при использовании липопротеидов высокой плотности (ЛПВВ), искусственно загруженных с miRNA, в то время как инкубация с коренными частицами ЛПВПА не дает существенного эффекта из-за их довольно низкого содержания miRNA. В отличие от этого, сотовые поглощения липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) частиц-ни с родной miRNA, ни искусственно загружен с ним-не изменяет клеточный уровень miRNA.

Introduction

Липопротеины частицы состоят из монослоя амфифильных липидов и холестерина вмещающих ядро чолестерил эфиров и триглицеридов жиров. Вся частица стабилизирована мембранно-встроенными аполипопротеинами, которые определяют биологическое функциональность частицы. Липопротеинов частицы могут быть различна в зависимости от их соответствующей возрастающей плотности и, таким образом, уменьшая размер, а именно как очень низкой плотности липопротеинов (ЛДЛК), промежуточные плотности липопротеинов (IDL), ПНП, и ЛПВБ частиц. Несмотря на транспортировку водорастворимых компонентов в кровотоке, было продемонстрировано, что частицы лпвпа несут Некодирующие нити miRNA1,2. Микро-РНК представляют собой класс коротких (обычно два десятка нуклеотидов) РНК нитей, которые ухудшают внутриклеточно взаимодополняющие мРНК нити и, тем самым, изменяют профиль экспрессии определенных белков3,4,5, 6. Кроме того, изменения в профиле miRNA были обнаружены в различных заболеваниях и, таким образом, профиль применим в качестве биомаркера для диагностики и прогноза. Внеклеточного переноса miRNAs между клетками с помощью липопротеинов частицы могут служить дополнительным механизмом для межклеточной модуляции уровня мРНК. Чтобы количественно оценить биологический эффект, необходимы знания о абсолютном и относительном содержании miRNA частиц липопротеинов.

Количественная и относительно быстрая методика в режиме реального времени является подходящим методом для получения этой информации. Следовательно, можно вычислить относительную количественную (RQ) величину, и относительные различия между различными образцами и фракциями липопротеинов являются почтенны. Карты микрофлюидного массива MultiWell являются быстрым и легким в использовании методом для определения относительного присутствия (приравнивается к значению RQ) miRNAs в образце. Карты микрофлюидности MultiWell состоят из 96 или 384 индивидуальных камер реагирования для индивидуальных qPCR-реакций, встроенных в микрофлюиддические устройства. Каждая камера содержит необходимый зонд гидролиза и специфические праймеры КЦР для одной индивидуальной miRNA. Преимущества короткое время обработки из-за стандартизации, простой рабочий процесс, и уменьшило число пипеточных шагов. Кроме того, необходимый объем выборки сводится к минимуму. В отличие от относительной количественной оценки, абсолютное содержание miRNA требует сравнения результатов образца qPCR со стандартными кривыми известных абсолютных чисел нитей miRNA. Следует отметить, что, в связи с их относительно низким miRNA содержание, стандартные и, Кроме того, даже одной молекулы чувствительных методов визуализации не представляется возможным-искусственное обогащение липопротеинов частиц с miRNA является неизбежным для изучения сотовых взаимодействие липопротеинов частиц и miRNA передачи. Что касается этого, то при делекции частиц ЛПВД с последующим реледенцией7 допускается включение и, таким образом, обогащение нитей Mirna. Подобное обогащение частиц ЛПНП с miRNA неосуществимо из-за гидрофобности белка Апоб-100, который является основной составляющей частицы ЛПНП. Однако, за счет добавления полярного растворителя диметилсульфоксид (ДМСО), который способен проникать в липидные мембраны, ЛПНП частицы могут быть искусственно загружены с miRNA нитей, а также.

Микроскопия высокоскоростной атомной силы (HS-АСМ) является мощным инструментом для характеризации биологических образцов, предлагающих субнанометра пространственного и субвторого временного разрешения8. Таким образом, это хорошо подходит техника для контроля качества модифицированной липопротеинов частиц, как родной/восстановленные/помечены липопротеинов частицы могут быть отображаемого в ближайшем физиологическую среду.

Здесь, на основе qPCR протокол представлен шаг за шагом, чтобы определить абсолютное/относительное Мирна содержание липопротеинов частиц и образцов клеток, что позволяет оценивать скорость поглощения частиц клеточных липопротеинов. Кроме того, демонстрируется метод обогащения липопротеинов частицами с miRNA. Этот метод может быть адаптирован для общего манипулирования содержанием липопротеинов и, следовательно, демонстрирует применимость частиц липопротеинов в качестве мишеней для доставки лекарственных препаратов.

Protocol

Пожертвования крови были одобрены Комитетом по этике, медицинским университетом Вены (EK-No 511/2007, EK-No 1414/2016). Номенклатура в соответствии с минимальной информацией для публикации количественных экспериментов в реальном времени ЦР (MIQE)9 руководящих принципов.

1. липопротеинов изоляции частиц из человеческой крови

  1. Precool ультраклассный до 4 °C. Нарисуйте кровь здоровых добровольцев после ночного поста.
    Примечание: как правило, требуется три донора, жертвуя 80 mL каждый, и сбор крови трубы, содержащие этилендиаминетическая кислота (ЭДТА), как антикоагулянт.
  2. Центрифуга на 2 000 x g для 20 мин при температуре 4 °c и урожай плазмы (верхняя фаза); избежать сдвига сил. Определите общий объем V и отрегулируйте, при необходимости, многократное центрифугирования объема трубки с использованием фосфата-буферного раствора (PBS). Измерить массу 1 мл 3x и рассчитать среднюю плотность ρ.
  3. Рассчитать необходимое количество бромида калия (KBr) для регулировки плотности со следующим уравнением10 (для требуемой плотности в граммах/миллилитре, использование A = 1,019, и для конкретного объема kbr, Equation 1 использование = 0,364 ML/g). Добавить KBr в плазме и перемешать осторожно, чтобы избежать сдвига сил до тех пор, пока KBr полностью распущен.
    Equation 2
  4. Измерить плотность, как описано в шаге 1,2 и корректировать снова, при необходимости, добавив больше KBr. Заполните и запечатать центрифужные трубы, подходящие для ультрахризугации с плазмой. Избегайте пузырьков воздуха; в противном случае трубка может обрушиться. Поместите трубы в ротор в соответствии с инструкциями производителя и центрифугой на 214 000 x g для 20 ч при температуре 4 °c.
  5. Откройте трубы в соответствии с инструкциями производителя и выбросите верхнюю фазу, содержащую ЛДЛК и IDL. Определите общий объем V и отрегулируйте, при необходимости, многократное центрифугирования тома трубки с помощью PBS.
  6. Определите плотность ρ нижней фракции. Рассчитать требуемое количество KBr для регулировки плотности (используйте A = 1,063). Осторожно перемешайте, чтобы избежать сдвига сил, пока не растворится KBr. Повторите шаг 1,4.
  7. Удалите и соберите верхнюю фазу, содержащую частицы ЛПНП. Храните раствор частиц ЛПНП под инертной газовой атмосферой при температуре 4 °C. Определите общий объем V и отрегулируйте, при необходимости, многократное центрифугирования тома трубки с помощью PBS. Определите плотность ρ нижней фракции, как описано в шаге 1,2.
  8. Вычислите требуемое количество KBr для регулировки плотности (используйте A = 1,220) и добавьте его. Осторожно перемешайте, чтобы избежать сдвига сил, пока не растворится KBr. Повторите шаг 1,4.
  9. Удалите и соберите верхнюю фазу, содержащую частицы ЛПВВ. Определите его общий объем V и отрегулируйте, при необходимости, многократное центрифугирования тома трубки с помощью PBS. Определите плотность ρ. Для удаления альбумина рекомендуется использовать второй центрифугирования верхней фазы 214 000 x g для 20 ч при температуре 4 °c. Если требуется, повторите шаг 1,8. Удалите и соберите верхнюю фазу, содержащую частицы ЛПВВ.
  10. Подготовка и precool по крайней мере 20 L диализа буфера (0,9% нав, 0,1% ЭДТА [pH 7,4]) до 4 ° c. Довлажные диализные трубки (молекулярное сокращение веса: 12 – 14 кДа) и добавляют раствор ЛПНП и ЛПВГ в соответствии с инструкциями производителя. Диализ против 5 L диализа буфера при температуре 4 °C и изменить буфер после 1, 2 и 4 ч.
  11. После 24 ч, восстановить липопротеинов частиц решения от диализа труб и определить концентрацию белка, используя в Брэдфорде анализ11 или другой соответствующий один. Храните решения для частиц ЛПВК и ЛПНП под инертной газовой атмосферой при температуре 4 °C.

2. синтетические Мирна аликутс

Примечание: при обработке РНК олигонуклеотиды, работа Rrase-Free. Работайте только с свежими, одноразовыми пластмассовыми расходными материалами и всегда надевайте перчатки, которые должны быть изменены част. Используйте только нуклеазы-свободные решения. Всегда работайте на льду.

  1. Спин вниз флакон приобрел от производителя на максимальную силу, чтобы сформировать гранулы лиофилизированной синтетической miRNA. Добавить соответствующий объем 10 мм рис (гидроцилил) аминометан (рис) буфер, pH 7,5, для окончательной концентрации 10 мкм (концентрация запасов) miRNA.
  2. Аккуратно пипетки вверх и вниз пару раз для ресуспендирования. Подготовьте аликвооты 100 мкл каждый в стерильных труб. Храните их при температуре-20 ° с, если не используется немедленно. Избегайте повторного оттаивания и замораживания.

3. Восстановление частиц ЛПВВ

  1. Дельпипорт
    1. Подготовьте буфер A (150 mM Перламуфовый, 0,01% ЭДТА, 10 мм рис/совместимого [pH 8,0]). Precool центрифуга до-10 ° c. Precool 100 mL смеси этанола: диэтиловый эфир (3:2) при-20 °C.
      Осторожно: носите соответствующее индивидуальное защитное снаряжение и работайте в вытяжном колпаке при обработке диэтилового эфира, так как он чрезвычайно горючим и вреден для кожи.
    2. Смешайте объем, соответствующий 5 мг частиц ЛПВЧ с 50 мл предварительно охлажденного этанола: диэтиловый эфир (3:2) смесь и инкубировать для 2 h при-20 ° c. Центрифуга при температуре 2 500 x g для 10 мин при-10 °c.
    3. Выбросьте supernatant, ресуспензируем гранулы в 50 мл предварительно охлажденного этанола: диэтиловый эфир смеси вихрями, и инкубировать второй раз для 2 ч при-20 °C. Центрифуга снова в 2 500 x g для 10 мин при-10 °c.
      Примечание: при желании лиофилизировать супернатант для анализа содержания miRNA в липидной фракции частиц лпвв.
    4. Высушите гранулы под N2 потоком газа и ресуспензируем его в 250 мкл буфера a (см. шаг 3.1.1). Определите концентрацию белка, используя белковый анализ Брэдфорда или другой соответствующий один и разбавить до конечной концентрации 1 мг белка/250 мкл буфера а.
      Примечание: протокол может быть приостановлен здесь. Храните раствор на ночь при температуре 4 ° с под инертной газовой атмосферой.
  2. Восстановления
    1. Подготовить фосфатидилхолин (PC) запас раствора с использованием смеси хлороформа: метанол (2:1) при концентрации 5,6 мг ПК/мл. Аналогичным образом, подготовить фондовые решения чолестерил олеата (5 мг CO/мл) и холестерина (5 мг C/mL). Храните все решения при температуре-20 °C.
    2. В чистой стеклянной трубе Смешайте 500 мкл ПК, 100 мкл CO и 13,5 мкл C. Эти объемы соответствуют приблизительным молярным отношением 100 PC: 22 CO: 4,8 C. высушите смесь под N2 потока газа при вращении трубки, чтобы дать однородный поверхностный слой.
      Примечание: протокол может быть приостановлен здесь. Хранить стеклянную ампулу (при желании, накопление возможно) под инертной газовой атмосферой при температуре-20 °C.
    3. Подготовка свежего 30-мм сперминного раствора в буфере а. Mix один Алиготе (100 мкл, 10 мкм) синтетического miRNA (см. шаг 2,2) с 100 мкл раствора спермина и инкубировать в течение 30 минут при температуре 30 °c.
      Примечание: для экспериментов отрицательного контроля замените Мирна и/или раствор спермина тем же объемом буфера а.
    4. Растворите PC/Co/C Мастер микс Алиготе в смеси из шага 3.2.3.
    5. Подготовьте раствор из 30 мг/мл деоксичовидного натрия в буфере и добавьте 50 мкл к растворе из 3.2.4 шага. Размешайте при температуре 4 °C в течение 2 ч.
    6. Добавить 250 мкл из Делекта раствора ЛПВД от шага 3.1.4. Этот объем соответствует приблизительным молярное соотношение 100 PC: 22 CO: 4,8 C:1 делипидатированных белков ЛПВК. Перемешать при температуре 4 °C за ночь.
  3. Диализ
    1. Precool не менее 15 л PBS при температуре 4 °C. Добавить 50 г адсорбента бисер до 800 мл двойной дистиллированной воды (DDH2O) и размешать в течение 1 мин. Подождите 15 мин, сцеживаться supernatant, и повторите процедуру с PBS.
    2. Кассеты для диализа (молекулярное сокращение веса: 20 kDa) или соответствующие трубки для диализа, а затем добавить раствор из 3.2.6 шага, используя шприц в соответствии с инструкциями производителя.
    3. Добавить адсорбент бисер от шага 3.3.1 до 3 л из PBS и диалице при температуре 4 °C. Измените буфер и бисер после 1 ч и 2 ч.
    4. После 24 ч, восстановить восстановленный ЛПВБ (RDL) частицы раствора и определить концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда. Храните раствор частиц RDL в инертной газовой атмосфере при температуре 4 °C.

4. Маркировка частиц ЛПНП

  1. Подготовьте 10x буфер ЛПНП (1,5 м надл, 3 мм ЭДТА, 1 мм этилен гликоль-бис (b-аминоэтиловый эфир)-N, N, N ', N'-тетраацететическая кислота [EGTA, pH 7,4]) и храните ее при комнатной температуре.
  2. Приготовьте свежее 30-мм сперминное растворе в воде, свободной от Нсе. Смешайте Алиготе (100 мкл, 10 мкм) синтетического miRNA (см. шаг 2,2) с 100 мкл раствора спермина и инкубировать 30 минут при температуре 30 °c.
    Примечание: для отрицательных экспериментов контроля, замените miRNA и/или раствор спермина с таким же объемом 1x буфер ЛПНП.
  3. Добавить 100 МКН ДМСО к растворе miRNA/спермина от шага 4,2 и разбавить его далее с 1,2 mL 1x буфера ЛПНП.
  4. Разбавить раствор частиц ЛПНП к окончательной концентрации примерно 4 мг/мл с PBS и смешайте 450 мкл с 50 мкл 10x буфер ЛПНП. Инкубировать его в течение 10 минут на льду.
  5. Смешайте решение частиц ЛПНП от предыдущего шага и раствора miRNA/спермина/ДМСО (от шага 4,3) и Инкубируйте его в течение 2 ч при температуре 40 ° с.
  6. Выполните диализа аналогичные, описанные в разделе 3,3 и хранить помечены раствором частиц ЛПНП соответственно.

5. контроль качества восстановленных/меченых частиц липопротеинов

Примечание: для контроля качества, диаметр и общая форма частиц липопротеинов можно определить с помощью, например, АСМ или электронная микроскопия (EM). Здесь, HS-АСМ используется для измерения размера распределения родного/восстановленный/помечены частиц липопротеинов.

  1. Разбавить раствор липопротеидов лпвб/ЛПНП в PBS (1:100 – 1:1000) и инкубировать его на свеже Расщепляем слюды в течение 5 мин. Для рассевания слюды12, нажмите клейкой лентой против подложки и удалить верхние слои слюды, потянув ленту выкл.
    Примечание: в зависимости от конкретного инструмента АСМ, зона наблюдения, и Начальная концентрация частиц, коэффициент разрежения должен быть скорректирован для наблюдения отдельных частиц.
  2. После инкубации, промыть образец с PBS и выполнять HS-АСМ изображений в PBS и в режиме разговоров с кантирычаги, имеющие весной константы kнаклоняю ≪ 0,2 N/m. Рекомендуется использовать размеры сканирования < 1 мкм2 и держать изображения сил как можно ниже.
  3. Определите высоту отображаемого частиц по отношению к поверхности слюды с подходящим программным обеспечением.
    1. Загрузите данные в Гвидидион (бесплатная), обнаружить частицы с помощью анализа зерна (пометить зерна по порогу) и установить порог выше субстрата фона. Придавить изображение (Удалить Полиномиальный фон), выбирая параметр исключить замаскированный регион .
    2. Экспортируем значения высот обнаруженных частиц (распределение различных характеристик зерна) и повторяем эти шаги для всех записанных изображений. Выполните статистический анализ, либо создав гистограммы, либо вычисляя функции плотности вероятности полученных высот частиц.
  4. Повторите шаги 5.1-5,3 с родными, а также восстановленные/помечены частиц липопротеинов и сравнить полученные результаты для проверки качества частиц. При наблюдении мусора и/или конгломератов удалите образец.

6. Культура клетки

  1. Расти адепт клеток в соответствии с установленным Протоколом (например, ldlA7-SRBI13) до достижения беглость.
    Примечание: несколько независимых палат в зависимости от количества экспериментов (рекомендуется две камеры в экспериментальной настройки) и отрицательные эксперименты контроля (рекомендуется две камеры без добавления частиц липопротеинов) необходимы. Кроме того, для определения номера ячейки требуются две камеры.
  2. Аккуратно промойте клетки 3x с предварительно подогретой солевой раствор Хэнка (ГБСС) для удаления клеточного мусора и покрытия клеточного слоя с соответствующим объемом сывороточного роста среды. Добавьте соответствующий объем раствора липопротеинов частиц для достижения окончательной концентрации 50 частиц липопротеинов мкг/мл. Инкубировать при температуре 37 ° c и 5% CO2 для 16 ч.
    Примечание: в зависимости от экспериментального проектирования и клеточной линии, время инкубации должно быть адаптировано для достижения достаточного (т.е. измеримых) увеличения клеточного уровня miRNA.
  3. Аккуратно промойте клетки 3x с предварительно прогретой (37 ° c) ГБСС для удаления клеток мусора/липопротеинов частиц и покрывают слой клеток с соответствующим объемом сыворотки свободных средств.
  4. Определите плотность клеток, используя соответствующий метод (например, хемоцитометер, автоматический счетчик ячеек), по крайней мере, в двух независимых камерах для расчета количества ячеек в объеме выборки от шага 6,3. Это число используется для нормализации.

7. miRNA извлечение из образцов клеток и липопротеинов частиц

Примечание: извлечение miRNA из клеток выполняется с использованием комплекта экстракции miRNA со следующими изменениями.

  1. Образцы клеток
    1. Precool центрифуга до 4 ° c. Добавьте 350 мкл лизиса реагента каждой в две камеры, содержащие ячейки. В качестве отрицательного контрольного эксперимента используйте камеру без клеток.
      ВНИМАНИЕ: носите соответствующее индивидуальное защитное снаряжение и работайте в вытяжном колпаке при обработке реагента лизиса, так как он содержит фенол и тиоцицианат.
    2. Подождите 3 – 5 мин (в зависимости от клеточной линии) для клеточного отряда. При необходимости проверьте на клеточную отслойку с помощью микроскопии Брайта. Объем содержимое двух камер в трубке 1,5 мл.
    3. Использование 20 г иглы и 5 мл шприца, гомогенизации/нарушить образец 5x-10x стремлением и инкубации в течение 5 мин. Добавить 140 МКН хлороформа (CHCl3), энергично встряхнуть 15 с, и инкубировать в течение 3 мин.
    4. Центрифуга при температуре 12 000 x g в течение 15 мин при температуре 4 °c. После этого прекратите охлаждение центрифуги.
    5. Перенесите верхнюю водный участок в новую трубку 1,5 mL; Избегайте фазы смешивания/загрязнения, как интерфаза содержит ДНК и Нижняя фаза содержит белки. Добавить 1.5 x объем 100% этанола и тщательно перемешать по пипеттинг.
    6. Поместите колонку спин в коллекционные трубки 2 мл и добавьте 700 мкл смеси из 7.1.5 шага. Центрифуга в 8 000 x g для 15 с при комнатной температуре. Удалите поток и повторите этот шаг с объемом остаточного образца.
    7. Выбросьте поток через и добавьте 700 мкл первого буфера для стирки в колонку спин. Центрифуга его на 8 000 x g для 15 s при комнатной температуре.
    8. Выбросьте поток через и добавьте 500 мкл второго буфера для мытья в колонку спин. Центрифуга его на 8 000 x g для 15 s при комнатной температуре. Повторите весь этот шаг во второй раз с 2 мин центрифугирования времени.
    9. Поместите колонку спин в новую трубку для сбора 2 мл и центрифугу на полной скорости в течение 1 мин до высыхания мембраны.
    10. Поместите колонку спин в трубку для сбора 1,5 mL. Добавьте 30 МКН свободной воды в центре мембраны для обработки и центробежьте ее при 8 000 x g в течение 1 мин. Повторите весь этот шаг во второй раз с первого потока через как решение для революции. Шаг обратной транскрипции выполняется сразу же после извлечения; в противном случае Храните добытые miRNA пробы при температуре-20 °C.
  2. Частицы липопротеинов
    1. Установите объем образца с наименьшей концентрацией белка до 100 мкл (= максимальный объем выборки). Рассчитать объемы выборки других образцов в соответствии с этой нормализацией, обратно к их концентрации. Для экспериментов с отрицательными контрольным контролем используйте 100 МКН без воды.
      Примечание: нормализация не требуется, но упрощает прямое сравнение результатов в ходе этапа qPCR и анализа.
    2. Precool центрифуга до 4 ° c. Добавление 700 мкл лизиса реагента в образец объема 7.2.1 шага.
    3. Выполните добычу miRNA согласно шагам 7.1.3-7.1.10.

8. Обратная транскрипция

Примечание: Обратная транскрипция miRNA выполняется с использованием комплекта обратной транскрипции со следующими изменениями.

  1. Оттепель реагентов комплекта и праймеров обратной транскрипции на льду. Подготовьте следующий Мастер-микс в реакционной трубке на льду: 45,7 МКН-Free H2O, 16,5 мкl 10x буфера обратной транскрипции, 11 мкл фермента обратного транскрипта, 2,1 мкл ингибитора ннсэ и 1,7 мкл смеси ДНТП. Смешайте аккуратно, не вихрем.
    Примечание: масштаб зависит от количества выборки; здесь, он рассчитан на 10 реакций.
  2. Маркировать 0,2 mL пробки соответственно и смешать 7 мкл мастер-смеси от шага 8,1 с 5 мкл извлеченного образца от 7.1.10 шага и 3 мкл реверсирования обратного транскрипта. Смешайте осторожно, центрифугу в ближайшее время, и хранить смесь на льду.
  3. Для того, чтобы использовать один и тот же номер ячейки для каждой клеточной линии, Уменьшите объем выборки клеточной линии с более высоким общим числом клеток; использовать это в качестве остаточного объема для достижения общего объема выборки в 5 мкл свободной от НСЭ воды.
    Примечание: липопротеинный образец частиц уже нормализуется в шаге 7.2.1. Для подготовки стандартной кривой, разбавить Алиготе Мирна последовательно в RNase свободной воды и рассчитать количество нитей в объеме выборки. Требуется, по крайней мере, пять точек данных в пределах диапазона результирующего значения цикла выборки (cq). Как правило, общие факторы разведения, начиная от 102 до 106 подходят.
  4. Поместите трубки в Термоциклер и запустите следующую программу: 30 мин при 16 °C (шаг отжига), 30 мин при температуре 42 ° c (обратная транскрипция), 5 мин при 85 °C (шаг плавления) и пауза при температуре 4 °C (хранение). Выполните шаг КЦР сразу же после обратной транскрипции; в противном случае, храньте комплементарное дна (cDNA) синтезированное от образцов miRNA на-20 °C.

9. КЦР

  1. Выполните qPCR cDNA (обратный транскрибируется из miRNA) с использованием коммерчески доступный анализ (см. таблицу материалов) со следующими изменениями.
  2. Оттепель всех реагентов (Супермикс, свободной Rrase H2O), образцы кДНК (от шага 8,4) и грунтовки на льду. Подготовьте следующий Мастер-микс в реакционной трубе на льду: 75 мкл супермикса, 47,5 мкл Rrase-Free H2O, 7,56 мкл грунтовки. Смешайте аккуратно, не вихрем.
    Примечание: масштаб зависит от количества выборки; здесь, он рассчитан на 10 реакций.
  3. Маркируйте 0,2 mL пробки соответственно и добавьте 2 мкл образца cDNA до 13 мкл смеси хозяина и смешайте нежно. В общем, измерить каждый образец 2x.
    Примечание: по крайней мере два отрицательных образцов необходимо дополнительно-использование Rrase свободной воды в качестве образца. Если кривая калибровки не определена в том же запуске, что и выборка, требуется также один образец из измерения кривой калибровки. Он используется для калибровки каждого отдельного запуска с той же эффективностью реакции.
  4. Поместите трубы в машину ЦР и запустите следующую программу: 2 мин при температуре 50 ° c, 10 минут при температуре 95 ° c, 15 с при 95 ° c, и 60 s при температуре 60 ° c. Повторите два последних шага программы до 50x.
  5. Для анализа значений cq с программным пакетом машины ЦР, активировать динамическую нормализацию (для компенсации различных фоновых уровней, используя вторую производную каждого образца трассировки) и шумового склона Коррекция (нормализация до уровня шума).
    Примечание: значение cq отрицательного элемента управления должно быть несколько циклов выше, чем самый высокий образец cq значение.
    1. Для анализа калибровочной кривой определите порог расчета cq для каждого miRNA от стандартных кривых каждого miRNA индивидуально, используя пороговую функцию автоматического поиска пакета программного обеспечения, и держать его постоянным для каждого конкретного miRNA.
    2. Для анализа образцов, если это необходимо, Компенсируйте эффективность различных реакций выборки, запускаются с точкой данных из выборки кривой калибровки. Программное обеспечение вычисляет значения cq образцов из порогового уровня соответствующего измерения кривой калибровки.

10. расчет содержания miRNA

  1. Кривая калибровки
    1. Расчет, от первоначального числа miRNA нитей на Алиготе (100 мкл 10 мкм miRNA, молекулярный вес из исходных объемов) и последующие последовательные шаги разрежения, количество miRNA нитей в образце объем (5 мкл образец объема от шага 8,3).
      Примечание: предполагая обратную эффективность транскрипции 1, это число равно количеству нитей cDNA.
    2. Рассчитать количество нитей кДНК в образце объемом 2 мкл от шага 9,3. Рассмотрите таким образом дополнительный коэффициент разведения 7,5 (объем образца 2 мкл от шага 9,4 от объема выборки 15 мкл от шага 8,4).
    3. Участок значение cq от шага 9.5.1 против числа нитей nнитей рассчитывается в шаге 10.1.2 в базовом-10 полулогарифмический сюжет, и соответствуют точки данных со следующей кривой регрессии (M = наклон линейной кривая регрессии, B = смещение).
      Equation 3
      Подтвердите, что коэффициент корреляции (R2) для линии > 0.99.
  2. Частицы липопротеинов
    1. Вычислите количество нитей miRNA на каждый объем выборки с помощью измеряемой выборки cq (Step 9.5.2) и следующему уравнению (M и B являются параметрами кривой калибровки конкретного Мирна).
      Equation 4
    2. Вычислить соответствующее количество липопротеидов частиц в объеме выборки, начиная от объема в шаге 7.2.1 (100 мкл), его известной концентрации, и последующих шагов по разведению (100 мкл-> 30 мкл образец объема в шаге 7.1.10-> 5 мкл [разбавление 1:6] образец в 15 мкл общего объема в шаге 8,4-> 2 мкл [разбавление 1:7.5] в шаге 9,4). Предположим, молекулярный вес 250 kDa для частиц ЛПВД и 3 МДА для частиц ЛПНП и 100% восстановления miRNA во время шага по добыче miRNA (игнорирование любого липидного вклада в молекулярный вес дает небольшую завышенную оценку количества Мирна нитей в липопротеинов частиц).
    3. Разделите число нитей miRNA с 10.2.1 шага на количество частиц, рассчитанных в предыдущем шаге, чтобы дать число нитей miRNA на липопротеидов частиц.
  3. Клетки
    1. Вычислите количество нитей miRNA на объем выборки в соответствии с ступенями 10.2.1.
    2. Вычислите соответствующее количество ячеек в объеме выборки согласно ступенчатый 10.2.2, начиная с начальной концентрации числа клеток, измеряемой в шаге 6,4.
    3. Разделите количество нитей miRNA с 10.3.1 на количество ячеек, рассчитанных в предыдущем шаге, чтобы дать количество нитей miRNA на ячейку.
    4. Вычислить поглощение скорость частиц липопротеинов путем деления общего количества miRNA нитей от предыдущего шага после коррекции на фоне miRNA уровне клеток, полученных от отрицательного контроля эксперимент по miRNA/частица соотношение (шаг 10.2.3 ) и время инкубации (16 ч, см. шаг 6,2).

11. мультиwell микрофлюидудические массивы

  1. Добыча miRNA
    1. Выполните добычу miRNA, как описано в шаге 7.
  2. Обратная транскрипция
    1. Размораживание праймеров обратной транскрипции, компоненты комплекта обратной транскрипции и MgCl2 (25 мм) на льду. Для восьми образцов, Смешайте 8 мкл праймеров обратной транскрипции (10x), 2,25 мкл Дцт с Тттп (100 мм), 16,88 мкл обратной транскриптазы (50 U/мкл), 9,00 мкл 10x буфер обратной транскрипции, 10,12 мкл MgCl2, 1,12 мкl ингибитора RNase (20 U/мкл) и 1 мкл воды, свободной от нуклеазы.
    2. Смешайте нежно и центрифугу кратко. Добавить 4,3 мкл обратной транскрипции реакции смеси до 3,5 мкл извлекается miRNA в трубке и перемешать, спина вниз, и инкубировать на льду в течение 5 мин. Поместите трубки в термоциклинную машину и запустите следующую программу: 16 °C в течение 2 мин, 42 ° c за 1 мин , и 50 ° c для 1 s повторяется 40x в общей сложности, а затем, как остановка реакции, 85 ° c в течение 5 минут и удерживайте при температуре 4 ° c до остановки.
  3. Предусиления
    1. Оттепель праймеров на льду и инвертировать и центрифугу кратко. Смешайте Мастер-микс преусиления (2x) по закрученной бутылке. Подготовьте смесь реакции преусиления в соответствии со следующим инструкцией для восьми образцов: 112,5 мкл мастер-микса преусиления (2x), 22,5 мкл преусиления праймеров и 67,5 мкл Нуклеаза-свободной воды. Инвертировать и центрифугу кратко.
    2. Смешайте 2,5 МКН продукта реакции обратной транскрипции от шага 11.2.2 с 22,5 мкл преусиления реакции смешивают от предыдущего шага и инвертировать и центрифугу кратко. Инкубировать образцы на льду в течение 5 мин.
    3. Поместите трубы в термоциклера и инкубировать в следующих настройках: активацию фермента при температуре 95 ° c в течение 10 мин, отжимаясь при температуре 55 ° c в течение 2 мин, простираясь на 72 ° c в течение 2 мин, повторил 12x: денатурирование при 95 ° c для 15 s и отжига/удлиняя при температуре 60 ° с , инактивация фермента при температуре 99,9 ° c в течение 10 мин и 4 °C на удержание.
    4. Спин вниз, добавить 7,5 мкл 1x TE (pH 8,0) и 67,5 мкл Нуклеаза-свободной воды, инвертировать, и центрифуга кратко. Образцы могут храниться при температуре-20 ° с до 1 недели.
  4. qPCR
    1. Смешайте Мастер-микс, закрученного бутылку. Подготовьте смесь реакции ЦР на одну карту: 450 мкл мастер-микса, 441 Мкl Нуклеаза-свободной воды и 9 мкл образца преусиления от 11.3.4 шага. Инвертировать и центрифугу кратко.
    2. Загрузите Каждый резервуар заполнения многохорошо микрофлюидевой карты массива с 100 МКН подготовленной смеси реакции ЦР в соответствии с инструкциями производителя и центрифугой 2x для 1 мин при 3 000 x g. Ускорение во время двух последовательных центрифугирования важно для правильного заполнения карты. Печать карточки в соответствии с инструкциями производителя.
    3. Используйте систему ЦР со следующей программой: активацию фермента при температуре 95 ° c в течение 10 мин, а затем, повторил 40x: денатурирование при 95 ° c в течение 15 с и отжига/расширение при 60 ° c в течение 1 мин.
    4. Импортируем файл результатов из системы ЦР и вычисляем значения RQ с помощью пакета программного обеспечения системы со следующими параметрами анализа: максимальное допустимое значение cq в 40,0, максимальные значения cq в включенных вычислениях и выбросы среди реплицирует исключены. Активировать ложные частоты открытия Бенджамина-Хохберга в качестве опции корректировки p-значений (коррекция возникновения ложных срабатываний14) и Глобальная нормализация как метод нормализации (использование медианного порогового значения для всех образцов 15).

Representative Results

Общая схема изоляции частиц липопротеинов
На рисунке 1 показана общая схема изоляции частиц липопротеинов, начиная с цельной крови, с использованием последовательных флотационной ультраконденсационной16. При желании частицы липопротеинов других частиц, таких как ЛДЛК и IDL, могут быть собраны во время этого протокола. Титановый ротор с фиксированным углом в сочетании с полипропройленовыми быстроуплотнированными трубками подходит для противостояния центрифугирования сил. Чтобы избежать обрушения труб, важно избегать пузырьков воздуха в трубке. Центрифугирования осуществляется при температуре 4 ° c, чтобы свести к минимуму деградацию белка. Обычно, начиная с плазмы (60-80 мл на донора) Объединенных кровных пожертвований трех добровольцев, выход ЛПНП и ЛПВК частиц решения 3 мл каждый с концентрацией в диапазоне 1-3 mg/mL можно ожидать. Вся процедура, начиная с донорства крови, заняла около 7 дней.

Figure 1
Рисунок 1: Блок-схема липопротеидов изоляции. Центрифуга крови от здоровых добровольцев в вакуумных контейнерных труб и сбора плазмы (верхняя фаза). После регулировки его плотности к ρ = 1,019 g/ml используя KBR, центрифуга разрешение на 214 000 x g для 20 h на 4 °c. После регулировки плотности нижней части к ρ = 1,063 g/ml используя KBR, центрифуга разрешение снова на 214 000 x g для 20 h на 4 °c. Храните верхнюю фракцию, содержащую частицы ЛПНП, временные при температуре 4 °C. После корректировки плотности нижней фракции до ρ = 1,220 г/мл с использованием KBR центрифуга раствор дважды в 214 000 x g для 20 ч при 4 °c. Соберите верхнюю фракцию, содержащую частицы ЛПВЧ, диализацию и растворы лпвч и ПНП и обменивать буфер после 1, 2, и 4 h. После 24 ч, определите концентрацию белка и храните пробы под инертным газом при температуре 4 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Восстановление частиц ЛПВВ
Восстановление частиц ЛПВВ было выполнено в соответствии с протоколом, ранее опубликованным Джонас7. Первый шаг был деледом частиц ЛПВВ, как показано на рисунке 2A, а затем второй этап восстановления (т.е., восстановление), как показано на рисунке 2A, с использованием липидного ПК, CO и C в дополнение к смеси Mirna и спермине. Мы выбрали человека Зрелые мир-223 и мир-155, потому что мир-223 показывает высокое изобилие и мир-155 редко в липопротеинов частиц17. Как правило, оба шага выполняются в течение двух последовательных дней. Во время восстановления при желании можно добавлять другие липофильные и/или земноводные компоненты. Решающее значение имела полная испарение этанола/диэтилового эфира и метанола/хлороформа, растворителя PC, CO и C. Последний шаг-как показано на рисунке 2C-была процедура диализа, чтобы отделить восстановленные частицы лпвб (РДЛ) от свободных липидов/miRNA/моющего средства. Это заняло еще 1-2 дней. Добавлением абсорбирующий бисер для диализа решение хранится плотность градиента по постоянной мембраны диализа. Выход 50% частиц RDL можно ожидать.

Figure 2
Рисунок 2: Блок-схема восстановления частиц лпвв. А) делепорт: Смешайте раствор лпвб с предварительно охлаждением этанола/диэтилового эфира и Инкубируйте при температуре-20 °c в течение 2 ч. После отбрасывания супернатант, ресуспензируем Пелле и повторите процедуру. Сухие гранулы с N2 газа и ресуспензируем его в буфер а. После определения концентрации, храните делипидатированную ЛПВГ под инертной газовой атмосферой при температуре 4 °C. (B) восстановление: после смешивания фосфатидилин-ХОЛИН (PC), чолестерил ОЛЕАТ (CO), и холестерин (C), испаряются растворителем с помощью N2 газа при вращении трубки. Инкубировать miRNA Алиготе с раствором спермина в течение 30 минут при температуре 30 °c, добавить дезокцовидной натрия и ресуспензируем высушенный липидный фильм. Размешайте образец для 2 ч при температуре 4 °C, добавьте раствор с ЛПВТ и снова перемешайте образец, на этот раз на ночь при температуре 4 °C под инертной газовой атмосферой. (C) диализ: передача раствора из панели B , содержащей восстановленные частицы Лпвч (РДЛ), в камеру мембранного диализа (молекулярное сокращение веса: 20 кДа) и ДИАЛИЗАЗ против PBS и абсорбирующий бисер при температуре 4 °c. Обменивать буфер и бисер после 1 ч и 2 ч. восстановить раствор частиц RDL после 24 ч, определить концентрацию и сохранить образец под инертной газовой атмосферой при температуре 4 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Маркировка частиц ЛПНП
Маркировки частиц ЛПНП с miRNA (рис. 3), как показано на лпвд частиц не было возможным из-за гидрофобичности из белка Апапоб-100, который является основной составляющей частицы ЛПНП. ДМСО использовалась для проникновения липидного монослоя частицы ЛПНП и, таким образом, опосредованной ассоциацией Мирна. Вся процедура заняла 1-2 дней с доходностью близкой к 100%.

Figure 3
Рисунок 3: Блок-схема маркировки частиц ЛПНП. Инкубировать miRNA Алиготе с раствором спермина в течение 30 минут при температуре 30 °c и добавьте буфер ДМСО и ЛПНП. Инкубировать образец ЛПНП в буфер ЛПНП для 10 мин на льду и добавить miRNA/Спермин/ДМСО смеси. После инкубации при температуре 40 ° c для 2 ч, перенесите раствор в камеру мембраны диализа (молекулярное сокращение веса: 20 кДа) и диализаз против PBS и абсорбирующий бисер при температуре + 4 °C. Обмен буфером и бисером после 1 & 2 ч. Восстановление меченых частиц ЛПНП раствор после 24 ч, определить концентрацию и хранить под инертной газовой атмосфере при температуре + 4 ° c. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Контроль качества частиц липопротеинов
HS-АСМ может быть использован для изучения размера и формы родного и восстановленный/помечены липопротеинов частиц на слюды. Перед использованием слюда должна быть недавно расколотой (использовать клейкую ленту для удаления верхнего слоя [s]) для обеспечения чистой и плоской поверхности. При инкубации частиц ЛПВБ/ПНП на слюды, коэффициент разрежения (и/или инкубационного времени) необходимо скорректировать для наблюдения за отдельными частицами. Кластеры не позволяют определение измерений частиц. Частицы ЛПВК мобильны на слюда. При использовании обычного АСМ вместо HS-АСМ, иммобилизационный протокол должен быть соответствующим образом адаптирован (буфер, поверхностное покрытие), чтобы уменьшить подвижность боковых частиц. При сканировании образца, усилие изображения должно храниться на низком уровне (в режиме нажатия), чтобы избежать деформации частиц, что, следовательно, повлияет на измеряемые значения. Для анализа данных частицы были обнаружены с помощью порогового алгоритма (например, в Гвидидион: зерна > знака порогом) и их высота определялась по отношению к поверхности слюды. Измерение высоты частиц является наиболее точным способом определения размеров частиц, поскольку кажущаяся боковое измерение расширяется по форме наконечника (см. примерные изображения на рисунке 4). Функции плотности вероятности (PDF-файлы) частиц высот были рассчитаны для статистической оценки и сравнения размера распределения различных частиц липопротеинов. Сравнение местных и Мирна-помечены частицы ЛПНП, как показано на рисунке 4 позволяет проверить основное сходство между помечены и немаркированные (например, родные) липопротеинов частиц (помечены частицы ЛПНП без добавления miRNA/ смеси спермина показаны как элемент управления для самой процедуры маркировки). Вся процедура заняла примерно 1 день.

Figure 4
Рисунок 4: блок-схема и репрезентативные результаты измерений HS- АСМ. Разбавить образец ЛПВБ/ЛПНП в PBS (1:102-1:103) и инкубировать его на свеже расщепляемая слюда в течение 5 минут, после тщательного полоскания с PBS для удаления свободных (не электростатически адсорных) частиц. Выполнять изображения HS-АСМ и проверять плотность частиц на поверхности. Проводить измерения в PBS при комнатной температуре. Верхнее изображение этой фигуры показывает слишком высокую плотность частиц; нижнее изображение подходит для анализа. Высота одиночных частиц была проанализирована после срешолдинг и родной (черной кривого) и восстановленный/маркированные (красная и зеленая кривая) частицы были сравнены в статистической оценке. Шкала планка = 100 Нм. Эта цифра была изменена с Axmann et al.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Добыча miRNA, обратная транскрипция и КЦР
Извлечение miRNA из родных/искусственно обогащенных липопротеинов или клеточных образцов было выполнено с использованием комплекта для экстракции miRNA, как показано на рисунке 5A. Таким путем, среда, свободная от НСЭ, имеет решающее значение. Этот шаг занял приблизительно 1 ч. обратное транскрипция добытого образца miRNA (Рисунок 5B) была выполнена с использованием стандартных биохимических процедур, описанных производителем. Этот шаг занял приблизительно 1,5 h. Наконец, объем кДНК, полученный в ходе последнего шага, определился с использованием КЦР (Диаграмма 5C). Стандартная кривая, которая относит полученные значения cq к абсолютному числу стренга miRNA, дала абсолютное содержание miRNA исходной выборки. Это заняло приблизительно 2,5 h.

Figure 5
Рисунок 5: блок-схема с экстракцией miRNA, обратной транскрипцией и КЦР. (A) Мирна добыча: Смешайте образец с лизисом реагента и Lyse его через стремление с помощью шприца. Инкубировать в течение 5 минут и добавить CHCl3. Энергично встряхните 15 и инкубации в течение 3 мин. После центрифугирования при температуре 1 200 x g в течение 15 мин при температуре 4 °c, соберите верхнюю фазу и смешайте ее с этанола. Перенесите раствор в столбец спин (максимальный объем < 700 мкл) и центрифугу на 8 000 x g в течение 15 с. Удалите элюент и повторите последний шаг с остальным решением. Добавьте первый стиральный буфер и центрифугу на 8 000 x g для 15 с. отбросить элюент, добавить второй буфер для мытья и центрифугу в 8 000 x g для 15 s. Повторите последний шаг с центрифугирования время 2 мин. Далее высушите мембрану с помощью центрифугирования на максимальной скорости в течение 1 мин. Елют miRNA с H2O и центрифуга на 80 000 x g для 1 мин. Store извлекается образец miRNA при температуре-20 °c. (B) обратная транскрипция: оттепель 10x буфер, H2O, ДНТП Mix, ингибитор, и фермент на льду и подготовить Мастер микс. Добавить извлеченные miRNA от панели а до Мастер микс и обратной транскрипции грунтовки и выполнять обратную транскрипцию с помощью Термоциклер машины. Храните образец cDNA при температуре-20 °C. (C) КЦР: оттепель Супермикс, H2O, и грунтовка на льду и подготовить Мастер микс. Добавьте кДНК из панели B в Мастер микс и выполните qPCR. Проанализируйте данные, чтобы получить значения cq и рассчитать абсолютное содержание miRNA образца (см. диаграмму 6 и репрезентативные результаты для подробностей). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Абсолютная Мирна содержание и скорость передачи
Абсолютное содержание miRNA местных и искусственно обогащенных частиц ЛПВЧ и ЛПНП было рассчитано с значений cq образцов и стандартной кривой соответствующего miRNA, как показано на рисунке 6. Диаграмма 6A показывает данные, вычисляемые программным обеспечением анализа (с активированной нормализацией динамическую трубку [для компенсации различных фоновых уровней с использованием второй производной каждого образца трассировки] и коррекции шумового склона [нормализация до уровня шума]). значения cq стандартных кривых были определены с использованием пороговой функции автоматического поиска пакета программного обеспечения на нормализованное флуоресцентное сигнала, измеряемого машиной qPCR. Таким, программное обеспечение максимально увеличила R-значение подгонки стандартной кривой. Пороговый уровень сохранился неизменным для каждого конкретного анализа образцов miRNA. Впоследствии значения cq были нанесены в зависимости от количества нитей miRNA, и была рассчитана Линия регрессии. Образец cq значения были определены с тем же уровнем порога, как показано на рисунке 6B; различия в эффективности реакции между различными запускаями КЦР были автоматически компенсированы программным обеспечением, используя одну дополнительную выборку кривой калибровки, включенную в каждый пробег. Используя уравнение линии регрессии, можно вычислить неизвестное количество miRNA в образце. Липопротеинов число частиц было оценено от начальной концентрации белка и его средний молекулярный вес (МВтЛпвг ~ 250 kDa). Таким образом, не липидный вклад в молекулярном весе было принято-таким образом, количество miRNA нитей на липопротеинов частица была слегка завышена. Кроме того, 100%-ный коэффициент восстановления miRNA на этапе извлечения miRNA был предположено. Кроме того, было определено содержание miRNA клеток до и после инкубации с частицами ЛПВВ, и коэффициент передачи miRNA был рассчитан как показано на рисунке 6C.

Figure 6
Рисунок 6: блок-схема расчета абсолютного Мирна содержание и скорость передачи. A) стандартная кривая для мира-155: a мир-155 Алиготе (100 мкл, 10 мкм) серийно разбавляется с РНК-свободной воды, как указано. qPCR дала значения cq для каждого серийного образца разбавления (измеряется дважды) с помощью автоматической найти порог функции пакета программного обеспечения. Отрицательные эксперименты управления (без добавления miRNA) дали значения cq > 35. Точки данных значений cq как функция количества нитей miRNA в объеме выборки (рассчитанного от начальной концентрации и серийных разведений) были оснащены представленным уравнением (красная линия, правое изображение), уступая M =-3,36 и B = 42,12. Определялась эффективность ЦР-0,98. Бары с ошибками были рассчитаны по результатам экспериментальных повторений и были меньше диаметра окружности точки данных. (B) значения cq для исконных/искусственно обогащенных частиц лпвч определились с тем же уровнем порога, что и в панели A и преобразованы в число нитей miRNA в томе выборки qPCR. Абсолютное соотношение Мирна исходного образца было рассчитано из количества (концентрации) частиц ЛПВВ в образце объема (3,2 х 1011 частиц). (C) образцы клеток (клеточная линия LDLA7-SRBI) инкубировали в течение 16 ч с искусственно обогащенными ЧАСТИЦАМИ лпвв (50 мкг/мл) и анализировали аналогичным образом. Определялись значения cq 22,5, 22,5 и 19,3 для ячеек только для клеток, инкубируемых с родным лпвч, или для клеток, инкубируемых с раствором частиц RDL (оба 50 мкг/мл) соответственно. Эти значения были преобразованы в число нитей miRNA, как сделано в панели B. Количество нитей miRNA после инкубации (7,3 х 106) было исправлено путем вычитания количества нитей miRNA до инкубации (8,6 х 105). Результат был разделен на количество ячеек в объеме выборки (3 100), соотношение miRNA-частица (1,5 x 10-4) и инкубационный период (16 ч). Это дало скорость передачи липопротеинов частиц через поглощение miRNA (240 случаев поглощения частиц ЛПВВ на ячейку и второй). Эта цифра была изменена с Axmann et al.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

MultiWell микрофлюидудический массив
Из-за небольшой урожайности miRNA добычи, обратная транскрипция добытого miRNA последовал шаг предусиления. Наконец, было проведено КЦР, как показано на рисунке 6. Для всех этапов, как описано производителем, использовались стандартные биохимические процедуры. Здесь показана часть мирового профиля miRNA на частицах ЛПВВ уремических пациентов, набранных для исследования о влиянии ОФД на холестерин эффлюкс из макрофагов18 . В этом исследовании, способность акцептора холестерина ЛПВЧ или сыворотки в-Кроме других-17 молодых взрослых уремических пациентов (CKD этапы 3-5) и 14 молодых взрослых гемодиализа пациентов без сопутствующих заболеваний и соответствием контроля была измерена. Для анализа данных были использованы настройки по умолчанию (предельно допустимое значение КТ: 40,0, включая максимальные значения КТ в расчетах и исключая выбросы среди реплицирует). P-значения были скорректированы с использованием ложного коэффициента обнаружения Бенджамина-Хохберга (коррекция возникновения ложных срабатываний), и в качестве метода нормализации была выбрана Глобальная нормализация , которая находит общие анализы среди всех образцы для использования медианного CT для нормализации. В репрезентативных результатах изображены некоторые RQs miRNAs, изолированные от HDLs пациентов uremim's (RQs элементов управления 1). Очевидно, что мир-122 и мир-224 высоко выражены в HDLs пациентов уремических. Весь этот шаг занял примерно 1 день.

Figure 7
Рисунок 7: блок-схема и репрезентативные результаты мультихорошо-микрофлюидудической решетки. После извлечения miRNA, как показано на рисунке 5A, смешайте образец miRNA с грунтом обратной транскрипции и Мастер-микс, содержащий 10x буфер, H2O, ДНТП Mix, ингибитор, MgCl2, и фермент. После инкубации на льду в течение 5 минут выполните обратную транскрипцию с помощью термоциклера. Добавьте Мастер-микс преусиления, Инкубируйте в течение 5 минут на лед и выполняйте предусиление с помощью термоциклера. Добавьте 0,1 x Te (pH 8,0) и смешайте Алиготе с миксом Master и H2O. Пипетка реакции КЦР в заливном порту мультихорошо микрофлюидовой массив и спина дважды в 3 000 x g для 1 мин каждый. Выполните КЦР с помощью системы ЦР и анализировать данные для получения RQ значений (здесь, на рисунке показано RQ значений ЛПВВ частиц уремии пациентов по сравнению с здоровой контрольной группы18).  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Discussion

Здесь, изоляция фракций липопротеинов частиц из крови человека и определение их отдельных miRNA содержание описывается шаг за шагом. Очень важно работать в среде, свободной от Nase при обработке изолированных и синтезированных miRNA-частица встроенного miRNA, очевидно, защищенном от ферментативной деградации. Как miRNA/частица соотношение частиц родного липопротеинов является довольно низким, Искусственное обогащение с miRNA требуется для изучения поглощения голочастицы клеток. Таким образом, восстановление частиц ЛПВВ, как описано ранее7 модифицируется для включения miRNA нитей. Кроме того, разделение липидной и белковой фракции во время этой процедуры позволяет ученым изучить липидные и белковые компоненты липопротеинов частицы19. Аналогичным образом адаптирована процедура маркировки частиц ЛПНП. Интересно, что добавление спермина — естественного стабилизатора нуклеотиды — не влияли на соотношение Мирна/частицы. Следует отметить, что, в принципе, метод позволяет инфолдинг других веществ, чем miRNA внутри липопротеидов частиц. Конечно, существует предел относительно физических размеров вещества на основе общего размера ЛПВТ (диаметр: 5-12 Нм) и частиц ЛПНП (диаметр: 18-25 Нм).

Что касается контроля качества восстановленных/помечены частиц липопротеинов, HS-АСМ является применимым методом для характеристики ЛПВБ/ЛПНП частиц на уровне единого частиц. По сравнению с EM, это позволяет сократить время подготовки и почти физиологические условия (влажная, комнатной температуры).

Из-за присущей ему чувствительности и усиления, qPCR является методом выбора для обнаружения низких концентраций miRNA. Альтернативно, одномолекула чувствительной флуоресцентной микроскопии, которая способна обнаруживать даже отдельные молекулы, не подходит из-за низких концентраций, например, флюоресцированные нити miRNA на частицу. Таким образом, соотношение Мирна нитей на родном липопротеинов частиц было установлено, что 10-8. Искусственное обогащение увеличивает коэффициент на коэффициент 10 000, что облегчает оценку коэффициента поглощения клеточных липопротеинов (не выявлено существенной разницы при использовании частиц с родным липопротеином 19). Высокая чувствительность КЦР позволяет определить эту скорость поглощения путем измерения количества нитей miRNA после инкубационного времени и соотношения miRNA/частица. Следует отметить, что расчетно значение игнорирует клеточную деградацию и высвобождение miRNA и, таким образом, представляет по крайней мере нижний предел для коэффициента поглощения липопротеинов частиц.

В будущем метод может быть адаптирован к передаче фармацевтических веществ (в частности, липофильных) в клетках и коррелирует их биологический эффект с внутриклеточной концентрацией (определяемых с помощью скорости поглощения частиц липопротеинов).

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана проектом австрийского научного фонда «P29110-B21», «Хоушулюбилямшстифтунг дер Штадт Вена-ЦУР Förderung der Виссеншафт», «проект H-3065/2011», Европейский фонд регионального развития (ЭФРЭ, IWB2020), федеральное государство верхнего Австрия, и "земля ОЁ Басисфинанзиерунг".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultracentrifuge Beckman Optima L-100 XP Lipoprotein isolation
Ultracentrifuge rotor Beckman TI 55.2 Lipoprotein isolation
Vacutainer (EDTA) Becton Dickinson 366643 Lipoprotein isolation
Kaliumbromid Sigma Aldrich 2110 Lipoprotein isolation
Ultracentrifuge tubes Beckman 342414 Lipoprotein isolation
Ultracentrifuge tube sealer Beckman 342428 Lipoprotein isolation
Sodiumchlorid Carl Roth GmbH P029.2 Lipoprotein isolation
EDTA Fisher Scientific D/0650/50 Lipoprotein isolation
Dialysis tubes, MWCO 12 - 14k Spectra 132700 Lipoprotein isolation
synthetic miRNA microSynth - synthetic miRNA
TRIS buffer pH 7 Ambion AM9850G synthetic miRNA
TRIS buffer pH 8 Ambion AM9855G synthetic miRNA
sterile tubes Carl Roth GmbH ENE8.1 synthetic miRNA
Photometer Eppendorf Eppendorf Biophotometer Bradford assay
Cuvette Carl Roth GmbH XK20 Bradford assay
Coomassie G-250 Stain BioRad GmbH 161-0786 Bradford assay
Sodiumchlorid Carl Roth GmbH 3957.1 Delipitation
EDTA Fluka Analytical 03690-100ML Delipitation
TRIS buffer pH 8.0 Ambion AM9855G Delipitation
Ethanol 100% AustrAlco Ethanol Absolut 99.9% Delipitation
Diethyl ether Carl Roth GmbH 3942.1 Delipitation
Centrifuge Thermo Scientific Multifuge X3R Delipitation
Chloroform Carl Roth GmbH 3313.1 Reconstitution
Methanol Carl Roth GmbH 4627.1 Reconstitution
Phosphatidylcholine Sigma Aldrich GmbH P3556-25mg Reconstitution
Cholesterol oleate Sigma Aldrich GmbH C-9253-250mg Reconstitution
cholesterol Sigma Aldrich GmbH C8667-500mg Reconstitution
glass tubes Carl Roth GmbH K226.1 Reconstitution
spermine Sigma Aldrich GmbH S3256-1G Reconstitution
Thermomixer Eppendorf Thermomixer comfort Reconstitution
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich GmbH 3097-25G Reconstitution
Magnetic stir bar Carl Roth GmbH 0955.2 Reconstitution
100µL micropipettes Carl Roth GmbH A762.1 Reconstitution
PBS Carl Roth GmbH 9143.2 Dialysis
Amberlite XAD-2 beads Sigma Aldrich GmbH 10357 Dialysis
Slide-A-Lyzer casette (cut-off 20 kDa) Thermo Scientific 66003 Dialysis
Syringe Braun 9161406V Dialysis
Syringe needle Braun 465 76 83 Dialysis
EGTA Carl Roth GmbH 3054.2 Labeling of LDL particles
DMSO life technologies D12345 Labeling of LDL particles
Atomic Force Microscope RIBM SS-NEX Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
Muscovite Mica (V-1 Grade) Christine Gröpl G250-1/V1 Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
AFM Cantilever Nanoworld USC-F1.2-k0.15 Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
Gwyddion 2.49 Czech Metrology Institute http://gwyddion.net Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
Chamber slides, Nunc Lab-Tek VWR 734-2122 Cell culture
HBSS Carl Roth GmbH 9117.1 Cell culture
Cell counter Omni Life Science GmbH Casy Cell culture
miRNeasy Mini Kit QIAGEN 217004 miRNA extraction
Centrifuge Eppendorf 5415R miRNA extraction
20G needle Braun Sterican 465 75 19 miRNA extraction
5ml syringe Becton Dickinson 309050 miRNA extraction
PCR cabinet Esco PCR-3A1 Reverse Transcription
TaqMan Reverse Transcription Kit Thermo Scientific 4366596 Reverse Transcription
Rnase-free water Carl Roth GmbH T143 Reverse Transcription
0.2 ml tubes Brand 781305 Reverse Transcription
Centrifuge Carl Roth GmbH Microcentrifuge AL Reverse Transcription
Thermocycler Sensoquest Labcycler Reverse Transcription
TaqMan Primer Thermo Scientific - qPCR
iTaq Universal probe supermix BioRad GmbH 1725131 qPCR
PCR machine Corbett Rotor-Gene RG-6000 qPCR
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4366596 TaqMan Array
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 Applied Biosystems 4399966 TaqMan Array
TaqMan PreAmp Master Mix Applied Biosystems 4391128 TaqMan Array
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 Applied Biosystems 4399933 TaqMan Array
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG Applied Biosystems 4440040 TaqMan Array
TaqMan Advanced miRNA Human A Cards Applied Biosystems A31805 TaqMan Array
Nuclease-free water Thermo Scientific R0581 TaqMan Array
MgCl2 (25mM) Thermo Scientific R0971 TaqMan Array
TE, pH 8.0 Invitrogen AM9849 TaqMan Array
7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 4351405 TaqMan Array
TaqMan Array Card Sealer Applied Biosystems - TaqMan Array

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nature Cell Biology. 13 (4), 423-435 (2011).
  2. Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, (2014).
  3. Wahid, F., Shehzad, A., Khan, T., Kim, Y. Y. MicroRNAs: Synthesis, mechanism, function, and recent clinical trials. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1803 (11), 1231-1243 (2010).
  4. Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
  5. Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA Translation and Stability by microRNAs. Annual Review of Biochemistry. 79 (1), 351-379 (2010).
  6. Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: Are the answers in sight? Nature Reviews Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).
  7. Jonas, A. Reconstitution of High-Density Lipoproteins. Methods in Enzymology. , 553-582 (1986).
  8. Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. High-Speed AFM and Applications to Biomolecular Systems. Annual Review of Biophysics. 42 (1), 393-414 (2013).
  9. Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  10. Patsch, J. R., Patsch, W. Zonal ultracentrifugation. Methods in Enzymology. 129 (1966), 3-26 (1986).
  11. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  12. Yamamoto, D., et al. High-Speed Atomic Force Microscopy Techniques for Observing Dynamic Biomolecular Processes. Methods in Enzymology. 475, 541-564 (2010).
  13. Stangl, H., Cao, G., Wyne, K. L., Hobbs, H. H. Scavenger receptor, class B, type I-dependent stimulation of cholesterol esterification by high density lipoproteins, low density lipoproteins, and nonlipoprotein cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 273 (47), 31002-31008 (1998).
  14. Hochberg, B. Controlling the False Discovery Rate: a Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. 57 (1), 289-300 (1995).
  15. Mestdagh, P., et al. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization. Genome Biology. 10 (6), (2009).
  16. Schumaker, V. N., Puppione, D. L. 6] Sequential Flotation Ultracentrifugation. Methods in Enzymology. 128 (C), 155-170 (1986).
  17. Wagner, J., et al. Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (6), 1392-1400 (2013).
  18. Meier, S. M., et al. Effect of chronic kidney disease on macrophage cholesterol efflux. Life Sciences. 136, 1-6 (2015).
  19. Axmann, M., et al. Serum and Lipoprotein Particle miRNA Profile in Uremia Patients. Genes. 9 (11), 533 (2018).

Tags

Биохимия выпуск 147 липопротеины частицы микро-РНК ЛПВВ ЛПНП КЦР абсолютное содержание ов значение скорость передачи сотовые поглощения
Обогащение частиц липопротеинов коренных народов с микроРНК и последующее определение их абсолютной/относительной микроРНК содержание и их сотовой скорость передачи
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Axmann, M., Karner, A., Meier, S.… More

Axmann, M., Karner, A., Meier, S. M., Stangl, H., Plochberger, B. Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate. J. Vis. Exp. (147), e59573, doi:10.3791/59573 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter