Her præsenteres en kvantitativ real-time polymerase kæde reaktions baseret protokol til bestemmelse af det oprindelige Micro-RNA indhold (absolutte/relative) af lipoprotein partikler. Desuden er en metode til at øge mikro-RNA-niveauet, samt en metode til bestemmelse af cellulære optagelse sats af lipoprotein partikler, påvist.
Lipoprotein partikler er overvejende transportører af lipider og kolesterol i blodbanen. Desuden, de indeholder små mængder af tråde af Noncoding microRNA (miRNA). Generelt ændrer miRNA protein udtryks profilen på grund af interaktioner med Messenger-RNA (mRNA). Således, viden om det relative og absolutte miRNA indhold af lipoprotein partikler er afgørende for at anslå den biologiske effekt af cellulære partikel optagelse. Her, en kvantitativ real-time polymerase kædereaktion (qPCR)-baseret protokol er præsenteret for at bestemme det absolutte miRNA indhold af lipoprotein partikler-eksemplificeret vist for indfødte og miRNA-beriget lipoprotein partikler. Det relative Mirna-indhold kvantificeres ved hjælp af flerhulsplader mikrofluidisk kapllærelektroforese array-kort. Endvidere, denne protokol giver forskerne mulighed for at estimere cellulære miRNA og dermed lipoprotein partikel Optagelseshastigheden. En signifikant stigning i cellulære miRNA niveau er observerbare, når du bruger high-density lipoprotein (HDL) partikler kunstigt lastet med miRNA, hvorimod inkubation med indfødte HDL-partikler ikke giver nogen signifikant effekt på grund af deres temmelig lav miRNA indhold. I modsætning hertil ændrede cellulære optagelse af lav-density lipoprotein (LDL) partikler-hverken med indfødte miRNA eller kunstigt lastet med det-ikke ændre det cellulære miRNA niveau.
Lipoprotein partikler er sammensat af en enkeltlags af amfifile lipider og kolesterol omsluttende en kerne af kolesterylestere estere og triglycerid fedtstoffer. Hele partiklen stabiliseres af membran indlejrede apolipoproteiner, som definerer partiklens biologiske funktionalitet. Lipoprotein partikler kan skelnes i henhold til deres respektive stigende tæthed og dermed faldende størrelse, nemlig som meget lav densitet lipoprotein (VLDL), intermediær-density lipoprotein (IDL), LDL, og HDL-partikler. På trods af transport af vanduopløselige komponenter i blodbanen, det er blevet påvist, at HDL-partikler bære Noncoding tråde af Mirna1,2. Micro-RNAs er en klasse af korte (sædvanligvis to dusin nukleotider) RNA-tråde, som nedbryder intracellulære komplementære mRNA-tråde og derved ændrer udtryks profilen for visse proteiner3,4,5, 6. det er Desuden er der fundet ændringer af miRNA profilen i en række forskellige sygdomme, og profilen kan således anvendes som en biomarkør til diagnose og prognose. Den ekstracellulære transport af Mirnas mellem celler via lipoprotein partikler kan tjene som en supplerende mekanisme for intercellulære mRNA-niveau modulation. For kvantitativt at anslå den biologiske effekt, viden om det absolutte og relative miRNA indhold af lipoprotein partikler er nødvendig.
Kvantitativ real-time PCR er en passende og relativt hurtig metode til at få disse oplysninger. Derfor kan den relative kvantificerings værdi (RQ) beregnes, og relative forskelle mellem forskellige prøver og lipoprotein fraktioner er skønelige. Multiwell mikrofluidisk kapllærelektroforese array kort er en hurtig og nem at bruge metode til at bestemme den relative tilstedeværelse (svarer til RQ-værdien) af Mirnas i en prøve. Multiwell mikrofluidisk kapllærelektroforese array kort består af 96 eller 384 individuelle reaktions kamre til individuelle qPCR-reaktioner indlejret i en mikrofluidic enhed. Hvert kammer indeholder den påkrævede hydrolyse sonde og specifikke qPCR-primere til én enkelt miRNA. Fordelene er en kort ekspeditionstid på grund af standardisering, en enkel arbejdsgang og et reduceret antal pipette Rings trin. Desuden minimeres den påkrævede prøvemængde. I modsætning til den relative kvantificering, kræver absolut miRNA indhold en sammenligning af qPCR prøveresultater med standard kurver af kendte absolutte tal af miRNA tråde. Det skal bemærkes, at på grund af deres relativt lave miRNA indhold, standard og i øvrigt, selv enkelt-molekyle følsomme billedbehandlings teknikker er ikke muligt-den kunstige berigelse af lipoprotein partikler med miRNA er uundgåelig at studere cellulære lipoprotein partikel interaktion og miRNA Transfer. Med hensyn til dette, delipidation af HDL-partiklen fulgt med efterfølgende relipidation7 tillader inkorporering af og dermed berigelse med Mirna tråde. Lignende berigelse af LDL-partikler med miRNA er ikke muligt på grund af hydrofobicitet af apoB-100 protein, som er den vigtigste bestanddel af LDL-partiklen. Men, ved tilsætning af Polar solvent dimethylsulfoxid (DMSO), som er i stand til at trænge ind i lipid membraner, kan LDL-partikler være kunstigt lastet med miRNA tråde samt.
High-Speed atomkraft mikroskopi (HS-AFM) er et kraftfuldt værktøj til karakterisering af biologiske prøver, der tilbyder subnanometer rumlig og subsecond tidsmæssig opløsning8. Derfor er det en velegnet teknik til kvalitetskontrol af modificerede lipoprotein partikler som indfødte/rekonstituerede/mærkede lipoprotein partikler kan være indlagret under en nær-fysiologiske miljø.
Her præsenteres en qPCR-baseret protokol trin for trin for at bestemme den absolutte/relative miRNA indhold af lipoprotein partikler og celleprøver, som giver mulighed for en vurdering af cellulære lipoprotein partikel Optagelseshastigheden. Desuden er der påvist en metode til berigelse af lipoprotein-partikler med miRNA. Denne metode kan tilpasses til den generelle manipulation af lipoprotein indhold og, dermed, viser anvendeligheden af lipoprotein partikler som mål for lægemiddel levering.
Her er isoleringen af lipoprotein partikel fraktioner fra humant blod og bestemmelse af deres individuelle miRNA indhold beskrevet trin for trin. Det er afgørende at arbejde i et RNase-frit miljø, mens håndtering af isolerede og syntetiserede miRNA-partikel-Embedded miRNA er naturligvis beskyttet mod Enzymatisk nedbrydning. Da miRNA/partikel forholdet mellem Native lipoprotein partikler er temmelig lav, kunstig berigelse med miRNA er forpligtet til at studere Holo partikel optagelse af celler. Dermed, rekonstitution af HDL-partikler som beskrevet tidligere7 er modificeret til at indarbejde Mirna tråde. Desuden, adskillelsen af lipid og protein fraktion under denne procedure giver forskerne til at undersøge lipid-og protein-associerede komponenter i lipoprotein partikel19. På en lignende måde, mærkning procedure af LDL-partikler er tilpasset. Interessant, tilsætning af spermine-en naturlig stabilisator af nukleotider-påvirkede ikke miRNA/partikel forholdet. Det skal bemærkes, at metoden i princippet gør det muligt at indfolde andre stoffer end miRNA inden for en lipoprotein-partikel. Der er naturligvis en grænse med hensyn til stoffets fysiske størrelse baseret på den samlede størrelse af HDL (diameter: 5-12 nm) og LDL-partikler (diameter: 18-25 nm).
Med hensyn til kvalitetskontrol af rekonstituerede/mærkede lipoprotein partikler, HS-AFM er en anvendelig metode til at karakterisere HDL/LDL-partikler på enkelt partikel niveau. I sammenligning med EM, det giver mulighed for kortere tilberedningstider og nær-fysiologiske forhold (våd, stuetemperatur).
På grund af sin iboende følsomhed og forstærkning, qPCR er den metode til valg til at detektere lav miRNA koncentrationer. Alternativt, enkelt-molekyle følsom Fluorescens mikroskopi, som er i stand til at detektere selv individuelle molekyler, ville ikke være egnet på grund af de lave koncentrationer af, for eksempel, fluorescerende mærket miRNA tråde per partikel. Således er forholdet mellem miRNA tråde pr Native lipoprotein partikel har vist sig at være 10-8. Kunstig berigelse forøger forholdet med en faktor på 10.000, hvilket letter skønnet af optagelsen af cellulære lipoprotein (der påvises ingen signifikant forskel ved brug af Native lipoprotein-partikler 19). Den høje følsomhed af qPCR gør det muligt at bestemme denne optagelseshastighed ved at måle antallet af miRNA tråde efter inkubationstid og miRNA/partikel-forholdet. Det skal bemærkes, at den beregnede værdi ignorerer cellulære nedbrydning og frigivelse af miRNA og dermed udgør mindst en nedre grænse for lipoprotein partikel optagelses forholdet.
I fremtiden kan metoden tilpasses til at overføre farmaceutiske stoffer (især også lipofile) i celler og korrelere deres biologiske virkning til den intracellulære koncentration (bestemt via Optagelseshastigheden af lipoprotein-partikler).
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Østrigs videnskabs fonds projekt P29110-B21, “Hochschuljubiläumsstiftung der Stadt Wien Zur Förderung der Wissenschaft”, projekt H-3065/2011, den europæiske fond for regional udvikling (EFRE, IWB2020), den føderale stat i øvre Østrig og “land OÖ Basisfinanzierung”.
Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP | Lipoprotein isolation |
Ultracentrifuge rotor | Beckman | TI 55.2 | Lipoprotein isolation |
Vacutainer (EDTA) | Becton Dickinson | 366643 | Lipoprotein isolation |
Kaliumbromid | Sigma Aldrich | 2110 | Lipoprotein isolation |
Ultracentrifuge tubes | Beckman | 342414 | Lipoprotein isolation |
Ultracentrifuge tube sealer | Beckman | 342428 | Lipoprotein isolation |
Sodiumchlorid | Carl Roth GmbH | P029.2 | Lipoprotein isolation |
EDTA | Fisher Scientific | D/0650/50 | Lipoprotein isolation |
Dialysis tubes, MWCO 12 – 14k | Spectra | 132700 | Lipoprotein isolation |
synthetic miRNA | microSynth | – | synthetic miRNA |
TRIS buffer pH 7 | Ambion | AM9850G | synthetic miRNA |
TRIS buffer pH 8 | Ambion | AM9855G | synthetic miRNA |
sterile tubes | Carl Roth GmbH | ENE8.1 | synthetic miRNA |
Photometer | Eppendorf | Eppendorf Biophotometer | Bradford assay |
Cuvette | Carl Roth GmbH | XK20 | Bradford assay |
Coomassie G-250 Stain | BioRad GmbH | 161-0786 | Bradford assay |
Sodiumchlorid | Carl Roth GmbH | 3957.1 | Delipitation |
EDTA | Fluka Analytical | 03690-100ML | Delipitation |
TRIS buffer pH 8.0 | Ambion | AM9855G | Delipitation |
Ethanol 100% | AustrAlco | Ethanol Absolut 99.9% | Delipitation |
Diethyl ether | Carl Roth GmbH | 3942.1 | Delipitation |
Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge X3R | Delipitation |
Chloroform | Carl Roth GmbH | 3313.1 | Reconstitution |
Methanol | Carl Roth GmbH | 4627.1 | Reconstitution |
Phosphatidylcholine | Sigma Aldrich GmbH | P3556-25mg | Reconstitution |
Cholesterol oleate | Sigma Aldrich GmbH | C-9253-250mg | Reconstitution |
cholesterol | Sigma Aldrich GmbH | C8667-500mg | Reconstitution |
glass tubes | Carl Roth GmbH | K226.1 | Reconstitution |
spermine | Sigma Aldrich GmbH | S3256-1G | Reconstitution |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer comfort | Reconstitution |
Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich GmbH | 3097-25G | Reconstitution |
Magnetic stir bar | Carl Roth GmbH | 0955.2 | Reconstitution |
100µL micropipettes | Carl Roth GmbH | A762.1 | Reconstitution |
PBS | Carl Roth GmbH | 9143.2 | Dialysis |
Amberlite XAD-2 beads | Sigma Aldrich GmbH | 10357 | Dialysis |
Slide-A-Lyzer casette (cut-off 20 kDa) | Thermo Scientific | 66003 | Dialysis |
Syringe | Braun | 9161406V | Dialysis |
Syringe needle | Braun | 465 76 83 | Dialysis |
EGTA | Carl Roth GmbH | 3054.2 | Labeling of LDL particles |
DMSO | life technologies | D12345 | Labeling of LDL particles |
Atomic Force Microscope | RIBM | SS-NEX | Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles |
Muscovite Mica (V-1 Grade) | Christine Gröpl | G250-1/V1 | Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles |
AFM Cantilever | Nanoworld | USC-F1.2-k0.15 | Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles |
Gwyddion 2.49 | Czech Metrology Institute | http://gwyddion.net | Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles |
Chamber slides, Nunc Lab-Tek | VWR | 734-2122 | Cell culture |
HBSS | Carl Roth GmbH | 9117.1 | Cell culture |
Cell counter | Omni Life Science GmbH | Casy | Cell culture |
miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | miRNA extraction |
Centrifuge | Eppendorf | 5415R | miRNA extraction |
20G needle | Braun | Sterican 465 75 19 | miRNA extraction |
5ml syringe | Becton Dickinson | 309050 | miRNA extraction |
PCR cabinet | Esco | PCR-3A1 | Reverse Transcription |
TaqMan Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4366596 | Reverse Transcription |
Rnase-free water | Carl Roth GmbH | T143 | Reverse Transcription |
0.2 ml tubes | Brand | 781305 | Reverse Transcription |
Centrifuge | Carl Roth GmbH | Microcentrifuge AL | Reverse Transcription |
Thermocycler | Sensoquest | Labcycler | Reverse Transcription |
TaqMan Primer | Thermo Scientific | – | qPCR |
iTaq Universal probe supermix | BioRad GmbH | 1725131 | qPCR |
PCR machine | Corbett | Rotor-Gene RG-6000 | qPCR |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4366596 | TaqMan Array |
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems | 4399966 | TaqMan Array |
TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems | 4391128 | TaqMan Array |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems | 4399933 | TaqMan Array |
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Applied Biosystems | 4440040 | TaqMan Array |
TaqMan Advanced miRNA Human A Cards | Applied Biosystems | A31805 | TaqMan Array |
Nuclease-free water | Thermo Scientific | R0581 | TaqMan Array |
MgCl2 (25mM) | Thermo Scientific | R0971 | TaqMan Array |
TE, pH 8.0 | Invitrogen | AM9849 | TaqMan Array |
7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351405 | TaqMan Array |
TaqMan Array Card Sealer | Applied Biosystems | – | TaqMan Array |