여기서, 정량적 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 기반 프로토콜은 지 단백질 입자의 천연 마이크로 RNA 함량 (절대/상대)의 결정을 위해 제시 된다. 또한, 마이크로 RNA 레벨을 증가 시키는 방법 뿐만 아니라, 지 단백질 입자의 세포 흡수 율을 결정 하는 방법이 입증 되어 있다.
단백 입자 주로 지질과 혈 류에서 콜레스테롤의 전송기. 또한, 그들은 소량의 비 부호화 마이크로 로르 (miRNA) 가닥을 포함 합니다. 일반적으로, miRNA는 메신저 RNA (mRNA)와의 상호작용으로 인해 단백질 발현 프로필을 변경 한다. 따라서, 지 단백질 입자의 상대적이 고 절대적인 miRNA 함량의 지식은 세포 입자 흡수의 생물학적 효과를 추정 하는데 필수적 이다. 여기서, 정량적 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qPCR) 기반 프로토콜은 지 단백질 입자의 절대적 miRNA 함량을 결정 하기 위해 제시 되 고-천연 및 miRNA 농축 된 단백질 입자에 대 한 것으로 예시 된다. 상대 miRNA 함량은 다 웰 미세 유체 어레이 카드를 사용 하 여 정량화 됩니다. 더욱이,이 프로토콜은 과학자 들이 세포 miRNA을 추정 하 고, 따라서, 지 단백질 입자 흡수 율을 추정할 수 있게 합니다. MiRNA와 인위적으로 로드 된 고밀도 지 단백질 (HDL) 입자를 사용할 때, 네이티브 HDL 입자와의 인큐베이션이 오히려 낮은 miRNA 콘텐츠로 인해 큰 영향을 미치지 않는 반면, 세포 miRNA 수준의 현저한 증가가 관찰 됩니다. 대조적으로, 저밀도 지 단백질 (LDL) 입자의 세포 흡수는 네이티브 miRNA도 인위적으로 로드 되지 않으며, 셀룰러 miRNA 수준을 변경 하지 않았습니다.
단백 입자는 콜레스테롤 에스테 르 및 트리 글리세라이드 지방의 코어를 둘러싸는 양친 매 성 지질과 콜레스테롤의 단층으로 구성 됩니다. 입자의 생물학적 기능을 정의 하는 멤브레인 임베디드 apolipoproteins 전체 입자가 안정화 됩니다. 지 단백질 입자는 그들의 각각 증가 하는 조밀도에 따라 구별 될 수 있고, 따라서, 아주 저밀도 지 단백질 (IDL), LDL 및 HDL 입자와 같은 크기를 감소 시킵니다. 혈 류에서 불용 성 성분의 수송에도 불구 하 고, HDL 입자가 miRNA1,2의 비 코딩 가닥을 수행 하는 것이 입증 되었습니다. 마이크로-rnas는 매우 짧은 (일반적으로 2 다스 뉴클레오티드) RNA 가닥으로 서,이로 인해 내 식 상보성 mRNA 가닥을 분해 하 고 특정 단백질의 발현 프로필을변경 합니다. 6. 더욱이, miRNA 프로 파일의 변경은 다양 한 질병에서 발견 되었으며, 따라서, 프로 파일은 진단과 예 후에 대 한 바이오 마커로 서 적용 가능 하다. 단백질 입자를 통해 세포 사이의 miRNAs의 세포 외 수송은 세포 간 mRNA 레벨 변조를 위한 추가 메커니즘으로 작용할 수 있다. 생물학적 효과를 정량적으로 추정 하기 위해, 지 단백질 입자의 절대적 및 상대적인 miRNA 함량에 관한 지식이 필요 하다.
정량적 실시간 PCR은 이러한 정보를 얻기에 적합 하 고 비교적 빠른 방법 이다. 따라서, 상대 정량 (RQ) 값은 계산 될 수 있고, 상이한 샘플과 지 단백질 분 획 간의 상대적인 차이는 추정 가능 합니다. 다 웰 미세 유체 어레이 카드는 샘플에서 miRNAs의 상대적인 존재 (RQ 값과 동일)를 결정 하는 빠르고 사용 하기 쉬운 방법입니다. 다 웰 미세 유체 어레이 카드는 미세 유체 장치에 내장 된 개별 qPCR 반응에 대해 96 또는 384 개별 반응 챔버로 구성 됩니다. 각 챔버에는 하나의 개별 miRNA에 필요한 가수분해 프로브 및 특정 qPCR 프라이 머가 포함 되어 있습니다. 표준화, 간단한 워크플로우 및 피 펫 팅 단계 수 감소로 인 한 짧은 처리 시간입니다. 또한 필요한 샘플 볼륨이 최소화 됩니다. 상대적인 정량화와는 대조적으로, 절대 miRNA 함량은 miRNA 가닥의 알려진 절대 수의 표준 곡선과 qPCR 샘플 결과의 비교를 필요로 한다. 상대적으로 낮은 miRNA 함량으로 인해 표준 및 또한 단일 분자 민감성 이미징 기술이 실현 가능 하지 않기 때문에 miRNA을 가진 지 단백질 입자의 인공 농축은 세포를 연구 하는 데 불가피 합니다. 단백 입자 상호 작용 및 miRNA 전송. 이와 관련 하 여, HDL 입자의 delipidation는 후속 성물 함7 의 통합을 허용 하 고, 따라서, miRNA 가닥으로 농축. MiRNA를 가진 LDL 입자의 유사한 농축은 LDL 입자의 주요 성분 인 apoB-100 단백질의 소수 성으로 인해 실현 가능 하지 않습니다. 그러나, 지질 막에 침투할 수 있는 극성 용 매 디 메 틸 설 폭 사이드 (DMSO)를 첨가 함으로써, LDL 입자는 miRNA 가닥과 함께 인위적으로 로딩 될 수 있다.
고속 원자 힘 현미경 검사 법 (HS-AFM)은 서브 나노미터 공간 및 2 초 시간 분해능을 제공 하는 생물학적 표본의 특성화를 위한 강력한 도구입니다8. 따라서, 천연/재구성/라벨링 된 지 단백질 입자가 근 생리 적 환경 하에서 이미징 될 수 있으므로 변형 된 단백질 입자의 품질 관리를 위한 잘 적합 한 기술입니다.
여기서, qPCR 기반 프로토콜은 지 단백질 입자 및 세포 샘플의 절대적/상대적인 miRNA 함량을 결정 하기 위해 단계별로 제시 되며,이는 세포 단백질 입자 흡수 율의 추정을 가능 하 게 한다. 더욱이, miRNA와 함께 지 단백질 입자의 농축을 위한 방법이 입증 된다. 이 방법은 단백 콘텐츠의 일반적인 조작을 위해 적응 될 수 있고, 따라서, 약물 전달을 위한 표적으로 서 지 단백질 입자의 적용을 입증 한다.
여기서, 인간 혈액 으로부터 지 단백질 입자 분 획의 분리 및 그들의 개별적인 miRNA 함량의 결정은 단계별로 설명 된다. 분리 되 고 합성 된 miRNA를 처리 하는 동안 RNase가 없는 환경에서 작업 하는 것이 중요 합니다-입자-임베디드 miRNA는 분명히 효소 분해 로부터 보호 됩니다. 네이티브 지 단백질 입자의 miRNA/입자 비율이 다소 낮기 때문에, miRNA를 사용한 인공 농축은 세포의 홀로 입자 흡수를 연구 하는 데 필요 합니다. 따라서, 앞서 설명한 바와 같이 HDL 입자의 재구성 은 miRNA 가닥을 통합 하도록 변형 된다. 추가적으로,이 절차 도중 지질과 단백질 분 율의 별거는 과학자가 지 단백질 입자19의 지질 및 단백질 관련 성분을 검사할 것을 허용 합니다. 유사한 방법으로, LDL 입자의 라벨링 절차가 적응 된다. 흥미롭게도, miRNA의 자연 안정제 인 spermine을 첨가 하면 입자 비율에 영향을 미치지 않습니다. 원칙적으로,이 방법은 단백질 입자 내에서 miRNA 보다 다른 물질의 인 폴딩을 허용 한다는 점에 유의 해야 합니다. 물론 전체 크기의 HDL (지름: 5-12 nm) 및 LDL 입자 (직경: 18-25 nm)에 기초한 물질의 물리적 크기에 대해서는 한계가 있다.
재구성/라벨링 된 지 단백질 입자의 품질 관리와 관련 하 여, HS-AFM은 단일 입자 수준에서 HDL/LDL 입자를 특성화 하는 적용 가능한 방법입니다. EM에 비해, 그것은 짧은 준비 시간 및 가까운 생리 적 조건 (습식, 실 온)을 허용 한다.
고유 한 감도와 증폭으로 인해 qPCR은 낮은 miRNA 농도를 감지 하는 방법입니다. 양자 택일로, 개별 분자 조차 검출할 수 있는 단 하나 분자 과민 한 형광 현미경 검사 법은, 예를 들면, 입자 당 형광 표지 된 miRNA 가닥의 낮은 사격 량 때문에 적당 하지 않을 것입니다. 따라서, 네이티브 지 단백질 입자 당 miRNA 가닥의 비율은 10-8이 되는 것으로 밝혀졌다. 인공 농축은 세포 단백 흡수 율의 추정을 용이 하 게 하는 1만의 비율로 비율을 증가 시킵니다 (네이티브 지 단백질 입자 19를 사용 하 여 유의 한 차이가 검출 되지 않음). QPCR의 높은 감도는 인큐베이션 시간 및 miRNA/입자 비율 후에 miRNA 가닥의 수를 측정 하 여이 흡수 율을 결정할 수 있게 합니다. 계산 된 값은 세포 분해 및 miRNA의 방출을 무시 하 고, 따라서, 지 단백질 입자 흡수 율에 대 한 적어도 낮은 제한을 나타낸다.
앞으로,이 방법은 세포에서 제약 물질 (특히 친 유성 것 들)을 전달 하 고 세포내 농도에 대 한 그들의 생물학적 효과를 상관 (지 단백질 입자의 흡수 율을 통해 결정) 하도록 조정 될 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 오스트리아 과학 기금 프로젝트 P29110-B21, “Hochschuljubiläumsstiftung 더 슈 타트 빈 주 르 푀 르 더 위 즈 센 뒤” 프로젝트 H-3065/2011, 지역 개발을 위한 유럽 기금 (EFRE, IWB2020), 어퍼의 연방 국가에 의해 지원 되었다 오스트리아, 그리고 “토지 오에 바 시 핀 안 쯔 렁”.
Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP | Lipoprotein isolation |
Ultracentrifuge rotor | Beckman | TI 55.2 | Lipoprotein isolation |
Vacutainer (EDTA) | Becton Dickinson | 366643 | Lipoprotein isolation |
Kaliumbromid | Sigma Aldrich | 2110 | Lipoprotein isolation |
Ultracentrifuge tubes | Beckman | 342414 | Lipoprotein isolation |
Ultracentrifuge tube sealer | Beckman | 342428 | Lipoprotein isolation |
Sodiumchlorid | Carl Roth GmbH | P029.2 | Lipoprotein isolation |
EDTA | Fisher Scientific | D/0650/50 | Lipoprotein isolation |
Dialysis tubes, MWCO 12 – 14k | Spectra | 132700 | Lipoprotein isolation |
synthetic miRNA | microSynth | – | synthetic miRNA |
TRIS buffer pH 7 | Ambion | AM9850G | synthetic miRNA |
TRIS buffer pH 8 | Ambion | AM9855G | synthetic miRNA |
sterile tubes | Carl Roth GmbH | ENE8.1 | synthetic miRNA |
Photometer | Eppendorf | Eppendorf Biophotometer | Bradford assay |
Cuvette | Carl Roth GmbH | XK20 | Bradford assay |
Coomassie G-250 Stain | BioRad GmbH | 161-0786 | Bradford assay |
Sodiumchlorid | Carl Roth GmbH | 3957.1 | Delipitation |
EDTA | Fluka Analytical | 03690-100ML | Delipitation |
TRIS buffer pH 8.0 | Ambion | AM9855G | Delipitation |
Ethanol 100% | AustrAlco | Ethanol Absolut 99.9% | Delipitation |
Diethyl ether | Carl Roth GmbH | 3942.1 | Delipitation |
Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge X3R | Delipitation |
Chloroform | Carl Roth GmbH | 3313.1 | Reconstitution |
Methanol | Carl Roth GmbH | 4627.1 | Reconstitution |
Phosphatidylcholine | Sigma Aldrich GmbH | P3556-25mg | Reconstitution |
Cholesterol oleate | Sigma Aldrich GmbH | C-9253-250mg | Reconstitution |
cholesterol | Sigma Aldrich GmbH | C8667-500mg | Reconstitution |
glass tubes | Carl Roth GmbH | K226.1 | Reconstitution |
spermine | Sigma Aldrich GmbH | S3256-1G | Reconstitution |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer comfort | Reconstitution |
Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich GmbH | 3097-25G | Reconstitution |
Magnetic stir bar | Carl Roth GmbH | 0955.2 | Reconstitution |
100µL micropipettes | Carl Roth GmbH | A762.1 | Reconstitution |
PBS | Carl Roth GmbH | 9143.2 | Dialysis |
Amberlite XAD-2 beads | Sigma Aldrich GmbH | 10357 | Dialysis |
Slide-A-Lyzer casette (cut-off 20 kDa) | Thermo Scientific | 66003 | Dialysis |
Syringe | Braun | 9161406V | Dialysis |
Syringe needle | Braun | 465 76 83 | Dialysis |
EGTA | Carl Roth GmbH | 3054.2 | Labeling of LDL particles |
DMSO | life technologies | D12345 | Labeling of LDL particles |
Atomic Force Microscope | RIBM | SS-NEX | Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles |
Muscovite Mica (V-1 Grade) | Christine Gröpl | G250-1/V1 | Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles |
AFM Cantilever | Nanoworld | USC-F1.2-k0.15 | Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles |
Gwyddion 2.49 | Czech Metrology Institute | http://gwyddion.net | Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles |
Chamber slides, Nunc Lab-Tek | VWR | 734-2122 | Cell culture |
HBSS | Carl Roth GmbH | 9117.1 | Cell culture |
Cell counter | Omni Life Science GmbH | Casy | Cell culture |
miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | miRNA extraction |
Centrifuge | Eppendorf | 5415R | miRNA extraction |
20G needle | Braun | Sterican 465 75 19 | miRNA extraction |
5ml syringe | Becton Dickinson | 309050 | miRNA extraction |
PCR cabinet | Esco | PCR-3A1 | Reverse Transcription |
TaqMan Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4366596 | Reverse Transcription |
Rnase-free water | Carl Roth GmbH | T143 | Reverse Transcription |
0.2 ml tubes | Brand | 781305 | Reverse Transcription |
Centrifuge | Carl Roth GmbH | Microcentrifuge AL | Reverse Transcription |
Thermocycler | Sensoquest | Labcycler | Reverse Transcription |
TaqMan Primer | Thermo Scientific | – | qPCR |
iTaq Universal probe supermix | BioRad GmbH | 1725131 | qPCR |
PCR machine | Corbett | Rotor-Gene RG-6000 | qPCR |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4366596 | TaqMan Array |
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems | 4399966 | TaqMan Array |
TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems | 4391128 | TaqMan Array |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems | 4399933 | TaqMan Array |
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Applied Biosystems | 4440040 | TaqMan Array |
TaqMan Advanced miRNA Human A Cards | Applied Biosystems | A31805 | TaqMan Array |
Nuclease-free water | Thermo Scientific | R0581 | TaqMan Array |
MgCl2 (25mM) | Thermo Scientific | R0971 | TaqMan Array |
TE, pH 8.0 | Invitrogen | AM9849 | TaqMan Array |
7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351405 | TaqMan Array |
TaqMan Array Card Sealer | Applied Biosystems | – | TaqMan Array |