Här, ett kvantitativt i real tid polymeras kedje reaktion-baserat protokoll presenteras för bestämning av den infödda Micro-RNA innehåll (absoluta/relativa) av lipoproteinpartiklar. Dessutom, en metod för att öka mikro-RNA-nivån, samt en metod för att bestämma den cellulära upptagshastigheten av lipoproteinpartiklar, visas.
Lipoproteinpartiklar är huvudsakligen transportörer av lipider och kolesterol i blodet. Dessutom innehåller de små mängder av strängar av kodande mikroRNA (Mirna). I allmänhet förändrar miRNA protein uttrycks profilen på grund av interaktioner med Messenger-RNA (mRNA). Således är kunskapen om det relativa och absoluta miRNA-innehållet i lipoproteinpartiklar avgörande för att uppskatta den biologiska effekten av cellernas partikel upptag. Här, en kvantitativ real tid polymeras kedje reaktion (QPCR)-baserat protokoll presenteras för att bestämma den absoluta Mirna innehållet av lipoproteinpartiklar-exemplifieras visas för infödda och Mirna-berikad lipoprotein partiklar. Det relativa Mirna-innehållet kvantifieras med multispot mikroflödessystem array-kort. Dessutom, detta protokoll gör det möjligt för forskare att uppskatta cellulära miRNA och därmed lipoprotein partikel upptagshastigheten. En signifikant ökning av cellulär miRNA nivå är observerbar när du använder High-density lipoprotein (HDL) partiklar artificiellt laddad med miRNA, medan inkubation med inhemska HDL-partiklar ger ingen signifikant effekt på grund av deras ganska låga miRNA innehåll. I kontrast, det cellulära upptaget av low-density lipoprotein (LDL) partiklar-varken med infödda miRNA eller artificiellt laddad med det-inte ändra cellulär miRNA nivå.
Lipoproteinpartiklar består av en enskiktslager av amfifila molekylers lipider och kolesterol innesluter en kärna av kolesterylestrar estrar och triglycerid fetter. Hela partikeln stabiliseras av membraninbäddade apolipoproteiner, som definierar partikelns biologiska funktionalitet. Lipoproteinpartiklar kan särskiljas beroende på deras respektive ökande densitet och därmed minskande storlek, nämligen som mycket-low-density lipoprotein (VLDL), mellanliggande densitet lipoprotein (IDL), LDL, och HDL-partiklar. Trots transporten av vatten olösliga komponenter i blod omloppet, det har visats att HDL-partiklar bär kodande strängar av Mirna1,2. Mikro-rnas är en klass av korta (vanligt vis två dussin nukleotider) RNA-strängar, som försämrar intracellulärt kompletterande mRNA strängar och därmed ändra uttrycks profilen för vissa proteiner3,4,5, och 6. Vidare har förändringar av miRNA-profilen hittats i en mängd olika sjukdomar och därför är profilen tillämplig som bio markör för diagnos och prognos. Den extracellulära transporten av miRNAs mellan celler via lipoproteinpartiklar kan fungera som en extra mekanism för intercellulär mRNA-nivåmodulering. För att kvantitativt uppskatta den biologiska effekten behövs kunskap om det absoluta och relativa miRNA-innehållet i lipoproteinpartiklar.
Kvantitativ realtids-PCR är en lämplig och relativt snabb metod för att få denna information. Därför kan värdet för relativ kvantifiering (RQ) beräknas, och relativa skillnader mellan olika prover och lipoproteinfraktioner är uppskattnings bara. Multiwell mikroflödessystem array kort är en snabb och enkel att använda metod för att bestämma den relativa närvaron (motsvarar RQ värde) av mirnas i ett prov. Multiwell mikroflödessystem array kort består av 96 eller 384 individuella reaktionskammare för enskilda QPCR reaktioner inbäddade i en mikroflödessystem enhet. Varje kammare innehåller den erforderliga hydrolyssonden och specifika qPCR-primers för en individuell miRNA. Fördelarna är en kort hanterings tid på grund av standardisering, ett enkelt arbets flöde och ett minskat antal pipetteringsteg. Dessutom minimeras den nödvändiga prov volymen. I motsats till den relativa kvantifieringen kräver det absoluta miRNA-innehållet en jämförelse av resultaten av qPCR-provet med standard kurvor av det kända absoluta antalet miRNA-strängar. Det bör noteras att, på grund av deras relativt låga miRNA innehåll, standard och dessutom även Single-molekylen känsliga Imaging tekniker inte är genomförbara-den artificiella berikningen av lipoproteinpartiklar med miRNA är oundvikligt att studera cellulära lipoproteinpartikelinteraktion och miRNA-överföring. När det gäller detta, delipidation av HDL-partikel följt med efterföljande relipidation7 tillåter införlivande av och, därmed, berikning med Mirna strängar. Liknande berikning av LDL-partiklar med miRNA är inte genomförbart på grund av hydrofobicity av apoB-100 protein, som är den viktigaste bestånds delen i LDL-partikeln. Men genom tillsats av Polar lösnings medel dimetylsulfoxid (DMSO), som kan penetrera Lipidmembran, kan LDL-partiklar vara artificiellt laddad med miRNA strängar också.
Hög hastighet atomär mikroskopi (HS-AFM) är ett kraftfullt verktyg för karakterisering av biologiska prover som erbjuder subnanometer rumsliga och subsecond temporal resolution8. Därför är det en väl lämpad teknik för kvalitets kontroll av modifierade lipoproteinpartiklar som infödda/rekonstituerade/märkta lipoproteinpartiklar kan avbildas under en nästan fysiologisk miljö.
Här presenteras ett qPCR-baserat protokoll steg-för-steg för att bestämma det absoluta/relativa miRNA-innehållet i lipoproteinpartiklar och cellprover, vilket möjliggör en uppskattning av den cellulära lipoproteinpartikelupptagshastigheten. Dessutom demonstreras en metod för berikning av lipoproteinpartiklar med miRNA. Denna metod kan anpassas för allmän manipulation av lipoproteinhalten och, därmed, visar tillämpligheten av lipoproteinpartiklar som mål för läkemedels leverans.
Här beskrivs isoleringen av lipoproteinpartikelfraktioner från humant blod och bestämningen av deras individuella miRNA-innehåll steg för steg. Det är viktigt att arbeta i en RNase-fri miljö samtidigt hantera isolerade och syntetiserade miRNA-partikel-Embedded miRNA är uppenbarligen skyddad från enzymatisk nedbrytning. Eftersom miRNA/partikel förhållandet mellan infödda lipoproteinpartiklar är ganska låg, konstgjord berikning med miRNA krävs för att studera Holo partikel upptag av celler. Därmed, rekonstituering av HDL-partiklar som beskrivits tidigare7 modifieras för att införliva Mirna strängar. Dessutom, separation av lipid och protein fraktion under detta förfarande gör det möjligt för forskare att undersöka lipid-och proteinassocierade komponenter i lipoproteinpartikel19. På liknande sätt är märknings förfarandet för LDL-partiklar anpassat. Intressant, tillsatsen av spermine-en naturlig stabilisator av nukleotider-påverkade inte miRNA/partikel förhållandet. Det bör noteras att metoden i princip gör det möjligt att lägga till andra ämnen än miRNA inom en lipoproteinpartikel. Naturligtvis finns det en gräns när det gäller den fysiska storleken på ämnet baserat på den totala storleken på HDL (diameter: 5-12 nm) och LDL-partiklar (diameter: 18-25 nm).
När det gäller kvalitets kontroll av rekonstituerade/märkta lipoproteinpartiklar, HS-AFM är en tillämplig metod för att karakterisera HDL/LDL-partiklar på den enda partikel nivå. I jämförelse med EM, det möjliggör kortare förberedelse tider och nästan fysiologiska förhållanden (våt, rums temperatur).
Tack vare sin inneboende känslighet och amplifiering är qPCR den metod som används för att detektera låga miRNA-koncentrationer. Alternativt, enkelmolekylen känslig fluorescensmikroskopi, som kan detektera även enskilda molekyler, skulle inte vara lämplig på grund av de låga koncentrationerna av, till exempel, fluorescensmarkerade märkt Mirna strängar per partikel. Sålunda, förhållandet mellan miRNA trådar per Native lipoprotein partikel har visat sig vara 10-8. Konstgjord berikning ökar förhållandet med en faktor på 10 000, vilket underlättar uppskattningen av cellulär lipoproteinupptagningsförmåga (ingen signifikant skillnad detekteras med hjälp av infödda lipoproteinpartiklar 19). Den höga känsligheten hos qPCR gör det möjligt att bestämma denna upptagnings hastighet genom att mäta antalet miRNA-strängar efter inkubations tiden och förhållandet mellan miRNA och partikel. Det bör noteras att det beräknade värdet ignorerar cellulär nedbrytning och frisättning av miRNA och därmed utgör åtminstone en lägre gräns för lipoproteinpartikelupptagningsförhållandet.
I framtiden, metoden kan anpassas för att överföra farmaceutiska substanser (särskilt också lipofila sådana) i celler och korrelera deras biologiska effekt till den intracellulära koncentrationen (bestäms via upptag hastighet av lipoproteinpartiklar).
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av den österrikiska vetenskaps fonden projektet P29110-B21, “Hochschuljubiläumsstiftung der Stadt Wien zur Förderung der wissenschaft” projekt H-3065/2011, Europeiska fonden för regional utveckling (EFRE, IWB2020), den federala delstaten övre Österrike, och “land OÖ Basisfinanzierung”.
Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP | Lipoprotein isolation |
Ultracentrifuge rotor | Beckman | TI 55.2 | Lipoprotein isolation |
Vacutainer (EDTA) | Becton Dickinson | 366643 | Lipoprotein isolation |
Kaliumbromid | Sigma Aldrich | 2110 | Lipoprotein isolation |
Ultracentrifuge tubes | Beckman | 342414 | Lipoprotein isolation |
Ultracentrifuge tube sealer | Beckman | 342428 | Lipoprotein isolation |
Sodiumchlorid | Carl Roth GmbH | P029.2 | Lipoprotein isolation |
EDTA | Fisher Scientific | D/0650/50 | Lipoprotein isolation |
Dialysis tubes, MWCO 12 – 14k | Spectra | 132700 | Lipoprotein isolation |
synthetic miRNA | microSynth | – | synthetic miRNA |
TRIS buffer pH 7 | Ambion | AM9850G | synthetic miRNA |
TRIS buffer pH 8 | Ambion | AM9855G | synthetic miRNA |
sterile tubes | Carl Roth GmbH | ENE8.1 | synthetic miRNA |
Photometer | Eppendorf | Eppendorf Biophotometer | Bradford assay |
Cuvette | Carl Roth GmbH | XK20 | Bradford assay |
Coomassie G-250 Stain | BioRad GmbH | 161-0786 | Bradford assay |
Sodiumchlorid | Carl Roth GmbH | 3957.1 | Delipitation |
EDTA | Fluka Analytical | 03690-100ML | Delipitation |
TRIS buffer pH 8.0 | Ambion | AM9855G | Delipitation |
Ethanol 100% | AustrAlco | Ethanol Absolut 99.9% | Delipitation |
Diethyl ether | Carl Roth GmbH | 3942.1 | Delipitation |
Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge X3R | Delipitation |
Chloroform | Carl Roth GmbH | 3313.1 | Reconstitution |
Methanol | Carl Roth GmbH | 4627.1 | Reconstitution |
Phosphatidylcholine | Sigma Aldrich GmbH | P3556-25mg | Reconstitution |
Cholesterol oleate | Sigma Aldrich GmbH | C-9253-250mg | Reconstitution |
cholesterol | Sigma Aldrich GmbH | C8667-500mg | Reconstitution |
glass tubes | Carl Roth GmbH | K226.1 | Reconstitution |
spermine | Sigma Aldrich GmbH | S3256-1G | Reconstitution |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer comfort | Reconstitution |
Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich GmbH | 3097-25G | Reconstitution |
Magnetic stir bar | Carl Roth GmbH | 0955.2 | Reconstitution |
100µL micropipettes | Carl Roth GmbH | A762.1 | Reconstitution |
PBS | Carl Roth GmbH | 9143.2 | Dialysis |
Amberlite XAD-2 beads | Sigma Aldrich GmbH | 10357 | Dialysis |
Slide-A-Lyzer casette (cut-off 20 kDa) | Thermo Scientific | 66003 | Dialysis |
Syringe | Braun | 9161406V | Dialysis |
Syringe needle | Braun | 465 76 83 | Dialysis |
EGTA | Carl Roth GmbH | 3054.2 | Labeling of LDL particles |
DMSO | life technologies | D12345 | Labeling of LDL particles |
Atomic Force Microscope | RIBM | SS-NEX | Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles |
Muscovite Mica (V-1 Grade) | Christine Gröpl | G250-1/V1 | Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles |
AFM Cantilever | Nanoworld | USC-F1.2-k0.15 | Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles |
Gwyddion 2.49 | Czech Metrology Institute | http://gwyddion.net | Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles |
Chamber slides, Nunc Lab-Tek | VWR | 734-2122 | Cell culture |
HBSS | Carl Roth GmbH | 9117.1 | Cell culture |
Cell counter | Omni Life Science GmbH | Casy | Cell culture |
miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | miRNA extraction |
Centrifuge | Eppendorf | 5415R | miRNA extraction |
20G needle | Braun | Sterican 465 75 19 | miRNA extraction |
5ml syringe | Becton Dickinson | 309050 | miRNA extraction |
PCR cabinet | Esco | PCR-3A1 | Reverse Transcription |
TaqMan Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4366596 | Reverse Transcription |
Rnase-free water | Carl Roth GmbH | T143 | Reverse Transcription |
0.2 ml tubes | Brand | 781305 | Reverse Transcription |
Centrifuge | Carl Roth GmbH | Microcentrifuge AL | Reverse Transcription |
Thermocycler | Sensoquest | Labcycler | Reverse Transcription |
TaqMan Primer | Thermo Scientific | – | qPCR |
iTaq Universal probe supermix | BioRad GmbH | 1725131 | qPCR |
PCR machine | Corbett | Rotor-Gene RG-6000 | qPCR |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4366596 | TaqMan Array |
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems | 4399966 | TaqMan Array |
TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems | 4391128 | TaqMan Array |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems | 4399933 | TaqMan Array |
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Applied Biosystems | 4440040 | TaqMan Array |
TaqMan Advanced miRNA Human A Cards | Applied Biosystems | A31805 | TaqMan Array |
Nuclease-free water | Thermo Scientific | R0581 | TaqMan Array |
MgCl2 (25mM) | Thermo Scientific | R0971 | TaqMan Array |
TE, pH 8.0 | Invitrogen | AM9849 | TaqMan Array |
7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351405 | TaqMan Array |
TaqMan Array Card Sealer | Applied Biosystems | – | TaqMan Array |