Este protocolo é usado para isolar cardiomiócitos atriais únicos do coração do rato adulto usando uma abordagem de digestão do pedaço. Esta aproximação é usada para isolar os miócitos atrial direito ou esquerdos que podem ser usados para caracterizar a electrofisiologia atrial do miócitos em estudos da remendo-braçadeira.
As propriedades electrofisiológicas de miócitos atrial afetam importante a função cardíaca total. Alterações nas correntes iônicas subjacentes responsáveis pelo potencial de ação podem causar substratos pró-arrítmicos que sustentam arritmias, como fibrilação atrial, que são altamente prevalentes em muitas condições e Estados de doença. Isolar os cardiomiócitos atriais do camundongo adulto para uso em experimentos de patch-Clamp tem avançado muito nosso conhecimento e compreensão da eletrofisiologia celular no miocárdio atrial saudável e no ajuste da fisiopatologia atrial. Além disso, estudos que utilizam modelos genéticos de camundongo elucidaram o papel de uma vasta gama de proteínas na regulação da eletrofisiologia atrial. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento dos cardiomiócitos dos apêndices atriais de camundongos adultos usando uma combinação de digestão enzimática e dissociação mecânica desses tecidos. Essa abordagem produz de forma consistente e confiável os cardiomiócitos atriais isolados que podem ser usados para caracterizar a eletrofisiologia celular medindo potenciais de ação e correntes iônicas em experimentos de patch-Clamp um número experimental de Condições.
Os átrios, que são as câmaras de paredes finas, de baixa pressão do coração que recebem sangue da veia cava superior e inferior, bem como as veias pulmonares, são integrais na fisiologia cardíaca normal. Como outras regiões do coração, os átrios contêm um número de tipos de células, incluindo cardiomiócitos, fibroblastos, células endoteliais, células musculares lisas vasculares, e outros. Os miócitos atriais são células eletricamente excitável que desempenham um papel essencial na condução de sinais elétricos através do coração, assegurando assim a contração atrial adequada durante cada batimento cardíaco1. A disfunção elétrica nos átrios pode levar a um número de arritmias específicas atriais, como flutter atrial e fibrilação atrial2,3. Estas são altamente prevalentes, contudo mal compreendidas, arritmias atrial que conduzem à morbosidade e à mortalidade significativas. A fibrilação atrial pode ocorrer em associação com mutações genéticas, em associação com o envelhecimento ou no estabelecimento de formas adquiridas de doença cardíaca, incluindo hipertensão, insuficiência cardíaca e diabetes2,4,5 ,6. Essas condições podem alterar as propriedades elétricas dos miócitos atriais que podem criar um substrato que aumente a prevalência de arritmogênese1,2.
A função elétrica normal nos átrios, bem como a arritmogênese atrial, são mais afetadas pela morfologia do potencial de ação (AP) produzido em miócitos atriais. O AP atrial é gerado a partir da atividade de um número de correntes iônicas, incluindo a corrente de sódio (Ina, transportado por naV1,5 canais), o L-tipo corrente de cálcio (iCA, l, transportado por cav1,2 e CAv1,3 canais ), e diversas correntes do potássio que incluem a corrente retardada ultra-rápida do potássio do retificador (IKur, carreg por Kv1,5 canaletas), a corrente externa transiente do potássio (ia, carreg por kv4,2 e kv4,3 canais), uma corrente de potássio de estado estacionário (iKSS, transportado por KV2,1 canais), e a corrente de potássio do retificador interno(iK1, transportado por Kir2,1 canais)1,7, a 8. Embora não desempenhe um papel importante nos átrios do camundongo, os componentes rápidos e lentos do retificador tardio K+ Current (iKr e iKS) também contribuem para a repolarização AP em algumas espécies7. Alterações em uma ou mais dessas correntes iônicas podem alterar significativamente as propriedades elétricas dos miócitos atriais, o que pode levar a arritmias atriais. Por exemplo, uma redução de Ina pode retardar a velocidade de condução através dos átrios, reduzindo a velocidade de subida AP. Por outro lado, uma redução nas correntes de potássio repolarizante ou um aumento em ICA, L ou o ina tardia pode resultar no desenvolvimento de afterdepolarizações que podem desencadear atividade espontânea nos átrios1, 2,9.
É importante reconhecer que existem diferenças na morfologia da AP em diferentes partes do miocárdio atrial que são prováveis devido a diferenças na expressão ou regulação desses canais iônicos subjacentes. Por exemplo, as diferenças na duração da AP entre os átrios direito e esquerdo em associação com as diferenças na densidade atual foram bem descritas10,11,12,13. Além disso, temos demonstrado recentemente que existem padrões distintos de remodelação elétrica nos átrios direito e esquerdo de camundongos com hipertensão crônica6,14. A parede posterior atrial direita também contém o nó sinoatrial, que tem seus próprios padrões distintos de morfologia AP e padrões de queima15. As propriedades distintas dos miócitos em cada um destas partes diferentes dos átrios podem ser investigadas em detalhe usando miócitos isolados de cada uma destas regiões.
Existem diferentes abordagens que podem ser usadas para isolar os miócitos atriais para estudos de eletrofisiologia de patch-Clamp16. Uma possibilidade é usar uma aproximação retrógrada da perfusão onde o coração seja canulados através da aorta para a entrega das enzimas. Embora esta seja uma abordagem viável, pode produzir variabilidade na qualidade dos miócitos atriais devido a inconsistências na perfusão dos átrios. Nós adotamos um ‘ pedaço ‘ abordagem de digestão para o isolamento de miócitos atriais que elimina a necessidade de perfusão retrógrada do coração. Nossa aproximação usa uma combinação de digestão enzimática e de dissociação mecânica do tecido atrial que produz consistentemente e confiantemente o grande número de miócitos atrial isolados que são apropriados para estudos da remendo-braçadeira. Quando nós descrevemos nossa aproximação aqui usando o tecido atrial do apêndice, a aproximação pode ser usada em toda a região do miocárdio atrial (isto é, apêndices atrial direito ou esquerdos, paredes livres, paredes posteriores) que o investigador escolhe. Esta abordagem é ideal para estudos de eletrofisiologia de miócitos atrial em camundongos geneticamente modificados, em modelos de camundongo de doença cardiovascular, ou para o estudo dos efeitos de compostos farmacológicos5,6,17 , 18 anos de , a 19.
Nosso laboratório rotineiramente usa este protocolo para isolar os miócitos atriais do camundongo para uso em experimentos de patch-Clamp, a fim de investigar os efeitos de diferentes formas de doença cardiovascular, mutações genéticas ou compostos farmacológicos em miócitos atriais Eletrofisiologia. Embora altamente reprodutível, a qualidade dos dados obtidos dos miócitos atriais isolados depende da qualidade do isolamento. Além disso, a reintrodução do cálcio após o isolamento do miócitos atrial resultará na morte celular de uma população de miócitos isolados devido ao paradoxo do cálcio16. Assim, isolar os miócitos atriais viáveis e de alta qualidade usando essa abordagem requer prática e otimização em múltiplos pontos ao longo do isolamento. Uma vez otimizado, estima-se que entre 70-90% dos miócitos atrial totais isolados usando esta abordagem será tanto o cálcio tolerante e haste em forma. As etapas que exigem mais prática e otimização são discutidas abaixo.
A velocidade e a eficiência da dissecção terão efeitos a jusante sobre a qualidade das células isoladas. É importante tomar o tempo para assegurar-se de que todo o sangue esteja removido do tecido atrial e que as tiras do tecido estejam cortadas a um tamanho similar. Deve demorar aproximadamente 5 min para remover o Apêndice Atrial, cortar o tecido em tiras e transferir as tiras de tecido para o primeiro tubo da solução de pH 6,9 modificada de Tyrode. No entanto, se esta etapa demorar muito, a qualidade do tecido pode ser comprometida.
Também é importante que as tiras de tecido são cortadas para um tamanho uniforme dentro de um isolamento e entre os corações. Se tiras de tecido são muito grandes ou muito pequenas, ou se eles não são uniformes dentro de um isolamento, isso pode causar problemas durante a digestão enzimática e trituração. Isto é porque as tiras pequenas serão digeridas mais completamente e as grandes tiras estarão digerido. É igualmente importante considerar o genótipo e o ajuste da doença que está sendo estudado enquanto o tamanho do apêndice atrial pode variar entre animais. Por exemplo, os corações hipertróficos têm apêndices atriais maiores em comparação com corações saudáveis, e, portanto, o experimentador pode cortar mais tiras em corações hipertróficos em comparação com os corações de tamanho normal. Assim, otimizar o tamanho das tiras de tecido cortado e aplicar essas dimensões a cada Apêndice Atrial individual melhorará muito a reprodutibilidade das isolações de miócitos entre as condições experimentais.
O delicado equilíbrio entre a digestão enzimática e a dissociação mecânica é a chave para um isolamento de miócitos atrial bem-sucedido usando este protocolo. Se o tecido não é adequadamente roto durante a digestão enzimática, as tiras de tecido individuais tenderão a se amontoarem e ficar juntas, o que limitará a eficácia da digestão enzimática. Se agitado com demasiada frequência ou vigorosamente, isso pode danificar o tecido atrial, o que resultará no isolamento de células não viáveis. A dissociação mecânica de miócitos atriais isolados de tiras de tecido durante a trituração é o passo mais crítico para a prática e otimização usando essa abordagem para isolar os miócitos atriais. Se a trituração for muito delicada, o rendimento das células será baixo. Por outro lado, se a trituração for muito dura, então uma abundância de miócitos não viáveis será isolada, e a qualidade dos dados obtidos durante os experimentos de patch-Clamp será comprometida. Além disso, a composição dos átrios pode afetar o isolamento. Por exemplo, se o tecido é fibrótico, a digestão enzimática e as etapas de trituração podem precisar ser modificadas. Portanto, é importante ter tempo para desenvolver as habilidades necessárias para obter células de alta qualidade durante a trituração que pode ser usado para experimentos de patch-Clamp.
Como em todas as técnicas experimentais existem limitações. Essa técnica requer prática para isolar de forma revisível os miócitos viáveis e de alta qualidade, o que, por sua vez, impactará a viabilidade de quaisquer experimentos a serem realizados usando esses miócitos. Esta aproximação é igualmente os miócitos terminais e atrial isolados usando esta aproximação podem ser usados no dia do isolamento somente. Nosso laboratório usa as células dentro de 6-7 h de isolamento.
Esta aproximação de isolar cardiomiócitos atrial tem diversas aplicações. Por exemplo, esta abordagem pode ser modificada para isolar os miócitos atriais (bem como os fibroblastos cardíacos) de outras espécies, incluindo biópsias de tecido atrial humano. Além disso, um benefício para o uso deste método de bloco para o isolamento de miócitos atrial (em contraste com a perfusão retrógrada do coração) é que ele pode ser modificado para isolar os cardiomiócitos de outras regiões do coração, como o nó sinoatrial ou outras regiões específicas do miocárdio atrial, ou abranger toda a região supraventricular do coração. Nosso laboratório utiliza cardiomiócitos atriais para experimentos de patch-Clamp para medir potenciais de ação e correntes iônicas, embora essa abordagem não precise ser limitada a essa técnica. Por exemplo, os miócitos isolados podem ser usados para investigar alterações em transientes de cálcio e contratilidade em uma variedade de configurações experimentais. Os cardiomiócitos atriais também podem ser usados em estudos de imunofluorescência para estudar a localização de proteínas ou estruturas de interesse. Consequentemente, esta aproximação é altamente versátil com muitas aplicações possíveis.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho é apoiado por subsídios operacionais da Canadian institutos de pesquisa em saúde (MOP 93718, 142486) e do coração e Stroke Foundation do Canadá para a ra. Rose. H.J. Jansen é o destinatário de uma bolsa de pós-doutorado Killam.
1, 2-Bis(2-Aminophenoxy)ethane-N, N, N', N'-tetraacetic acid 98% | Sigma | A4926-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra, > 99%, from microbial | Sigma | A7699-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt > 95%, bacterial | Sigma | A9187-1G | |
Amphocetericin B from Streptomyces sp. ~80% (HPLC), powder | Sigma | A4888-500 MG | |
Bovine serum albumin | Sigma | A3059-50G | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
Cesium chloride ReagentPlus, 99.9% | Sigma | 289329-100G | |
Cesium hydroxide monohydrate > 99.5% trace metals basis | Sigma | 562505-1KG | |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
Creatine anhydrous | Sigma | C0780 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
DL-Aspartic acid potassium salt | Sigma | A2025-100G | |
Elastase suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS002279 | |
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid >97.0% | Sigma | E4378-25G | |
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate > 95% (HPLC), powder | Sigma | G8877-250MG | |
Heparin 10 000 USP units/10mL | SANDOZ | 10750 | |
HEPES > 99.5% (titration) | Sigma | H3375-500G | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate > 99% (HPLC), powder | Sigma | G1501-500G | |
Magnesium sulfate | Sigma | M2643-500G | |
Nifedipine > 98% (HPLC), powder | Sigma | N7634-1G | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate enzymatic, approx 98% | Sigma | P7936-5G | |
Potassium chloride ACS reagent, 99.0-100.5% | Sigma | P3911-500G | |
Potassium hydroxide | EM Science | PX1480-1 | |
Potassium phosphate monobasic | EMD | PX1565-1 | |
Protease from Streptomyces griseus, type XIV, >3.5 units/mg solid, powder | Sigma | P5147-1G | |
Sodium chloride ACS reagent, > 99.0% | Sigma | S9888-2.5KG | |
Sodium hydroxide, pellets, 97+%, A.C.S. reagent | Sigma | 221465-500G | |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments Inc | SYLG184 | |
Taurine | Sigma | T0625-100G | |
Tetraethylammonium chloride > 98% (titration) | Sigma | T2265-100G |