Denne protokol bruges til at isolere enkelt atrieflimren kardiomyocytter fra den voksne mus hjerte ved hjælp af en bid fordøjelse tilgang. Denne fremgangsmåde bruges til at isolere højre eller venstre atrieflimren myocytter, der kan bruges til at karakterisere atrieflimren nekrotiske Elektrofysiologi i patch-clamp undersøgelser.
De elektrofysiologiske egenskaber af atrieflimren myocytter vigtigt påvirker den samlede hjertefunktion. Ændringer i de underliggende ionstrømninger med ansvar for aktionspotentialet kan forårsage Pro-arytmiske substrater, der ligger til grund for arytmika, såsom atrieflimren, som er meget udbredt i mange tilstande og sygdomstilstande. Isolering af voksne mus atrieflimren kardiomyocytter til brug i patch-clamp eksperimenter har i høj grad fremmet vores viden og forståelse af cellulær Elektrofysiologi i det raske atriale myokardiet og i fastsættelsen af atrieflimren. Desuden har undersøgelser ved hjælp af genetiske musemodeller belyst rollen som en bred vifte af proteiner i reguleringen af atrieflimfysiologi. Her giver vi en detaljeret protokol til isolering af kardiomyocytter fra atrieflimren vedhæng af voksne mus ved hjælp af en kombination af enzymatisk fordøjelse og mekanisk dissociation af disse væv. Denne fremgangsmåde sikrer konsekvent og pålideligt isolerede atriale kardiomyocytter, som derefter kan bruges til at karakterisere cellulær Elektrofysiologi ved at måle aktionspotentialer og ionstrømninger i forsøg med plaster klemmer under en række eksperimentelle Betingelser.
Atria, som er de tynde murede, lavtryks kamre i hjertet, der modtager blod fra den overlegne og ringere Vena cavae samt de pulmonale vener, er integreret i normal hjerte fysiologi. Ligesom andre regioner i hjertet, Atria indeholder en række celletyper, herunder kardiomyocytter, fibroblaster, endotelceller, vaskulære glatte muskelceller, og andre. Atrieflimren myocytter er elektrisk overgearet celler, der spiller en væsentlig rolle i ledning af elektriske signaler gennem hjertet, og dermed sikre ordentlig atrieflimning under hver hjerterytme1. Elektrisk dysfunktion i Atria kan føre til en række atriefarytmider såsom atrieflagren og atrieflimren2,3. Disse er meget udbredt, men dårligt forstået, atriefarytmier, der fører til signifikant sygelighed og dødelighed. Atrieflimren kan forekomme i forbindelse med genetiske mutationer, i tilknytning til aldring eller i fastsættelsen af erhvervede former for hjertesygdomme, herunder hypertension, hjertesvigt og diabetes2,4,5 ,6. Disse betingelser kan ændre de elektriske egenskaber af atrieflimren myocytter, som kan skabe et substrat, der øger forekomsten af arytmogenesis1,2.
Normal elektrisk funktion i Atria, samt atriefarytmogenesis, er vigtigere påvirket af morfologien af aktionspotentialet (AP) produceret i atrieflimren myocytter. Atrieflimren AP genereres fra aktiviteten af en række Ioniske strømme, herunder natrium strømmen (ina, båret af naV1,5 kanaler), L-typen calcium strøm (ica, l, båret af cav1,2 og cav1,3 kanaler ), og flere kalium strømme, herunder den ultrahurtige forsinkede ensretter kalium strøm (Ikur, båret af kv1,5 kanaler), den forbigående passiv kalium strøm (itil, båret af kv4,2 og kv4,3 (iKss, båret af kV2,1-kanaler) og den indadrettede ensretter kalium strøm (iK1, båret af kIR2,1 kanaler)1,7, 8. Selv om de ikke spiller en stor rolle i mus Atria, de hurtige og langsomme komponenter i den forsinkede ensretter K+ strøm (ikr og iKS) også bidrage til AP repolarisering i nogle arter7. Ændringer i en eller flere af disse ionstrømninger kan i væsentlig grad ændre de elektriske egenskaber af atrieflimren myocytter, hvilket kan føre til atriefarytmier. For eksempel kan en reduktion i ina bremse lednings hastigheden på tværs af Atria ved at reducere AP-opstød-hastigheden. På den anden side, en reduktion i repolariserende kalium strømme eller en stigning i enten jegca, L eller den sene ina kan resultere i udviklingen af afterdepolariseringer, der kan udløse spontan aktivitet i Atria1, 2,9.
Det er vigtigt at erkende, at der er forskelle i AP morfologi i forskellige dele af atrialmyokardiet, som sandsynligvis skyldes forskelle i ekspression eller regulering af disse underliggende ion-kanaler. For eksempel, forskelle i AP varighed mellem højre og venstre Atria i forening med forskelle i itil nuværende tæthed er blevet godt beskrevet10,11,12,13. Også, vi har for nylig demonstreret, at der er særskilte mønstre af elektrisk remodeling i højre og venstre Atria af mus med kronisk hypertension6,14. Den højre atriale posterior Wall indeholder også den sinoatriale node, som har sine egne forskellige mønstre af AP morfologi og fyring mønstre15. De distinkte egenskaber af myocytter i hver af disse forskellige dele af Atria kan undersøges i detaljer ved hjælp af isolerede myocytter fra hver af disse regioner.
Der er forskellige tilgange, der kan bruges til at isolere atrieflimren myocytter for patch-clamp Elektrofysiologi undersøgelser16. En mulighed er at bruge en retrograd perfusion tilgang, hvor hjertet er bannuleret via aorta til levering af enzymer. Selv om dette er en holdbar tilgang, det kan producere variation i atrieflimren nekrotiske kvalitet på grund af uoverensstemmelser i perfusion af Atria. Vi har vedtaget en “chunk” fordøjelse tilgang til isolering af atrieflimren myocytter, der eliminerer behovet for retrograd perfusion af hjertet. Vores tilgang bruger en kombination af enzymatisk fordøjelse og mekanisk dissociation af atrieflimren, der konsekvent og pålideligt giver et stort antal isolerede atrieflimmyocytter, der egner sig til patch-clamp undersøgelser. Mens vi beskriver vores tilgang her ved hjælp af atrieflimren vedhæng væv, kan tilgangen anvendes på enhver region af atrialmyokardiet (dvs., højre eller venstre atrieflimmer, frie vægge, posterior vægge), som investigator vælger. Denne fremgangsmåde er ideel til studier af atrieflimren myocyt Elektrofysiologi i genetisk modificerede mus, i musemodeller af hjerte-kar-sygdomme, eller til at studere virkningerne af farmakologiske forbindelser5,6,17 , 18 , 19.
Vores laboratorium bruger rutinemæssigt denne protokol til at isolere mus atrieflimren myocytter til brug i patch-clamp eksperimenter for at undersøge virkningerne af forskellige former for hjerte-kar-sygdom, genetiske mutationer, eller farmakologiske forbindelser på atrieflimren nekrotiske Elektrofysiologi. Selv om det er meget reproducerbart, afhænger kvaliteten af de data, som opnås fra de isolerede atriale myocytter, af isoleringen. Desuden vil genindførelsen af calcium efter atrieflimren nekrotiske isolation resultere i celledød for en population af isolerede myocytter på grund af calcium Paradox16. Derfor kræver isolering af levedygtige atrialmyocytter af høj kvalitet ved hjælp af denne fremgangsmåde praksis og optimering på flere punkter i hele isolationen. Når optimeret, anslås det, at mellem 70-90% af de samlede atrieflimren myocytter isoleret ved hjælp af denne fremgangsmåde vil være både calcium tolerant og stang formet. De trin, der kræver mest praksis og optimering diskuteres nedenfor.
Den hastighed og effektivitet af dissektion vil have downstream virkninger på kvaliteten af de isolerede celler. Det er vigtigt at tage sig tid til at sikre, at alt blod fjernes fra atrieflimvævet, og at vævs strimler skæres i samme størrelse. Det bør tage ca. 5 minutter at fjerne atrieflimren, klippe vævet ind i strimler og overføre vævs strimlerne til det første rør af modificeret Tyrode pH 6,9-opløsning. Men hvis dette trin tager for lang tid, kan kvaliteten af vævet blive kompromitteret.
Det er også vigtigt, at vævs strimler skæres til en ensartet størrelse inden for en isolation og mellem hjerter. Hvis vævs strimler er for store eller for små, eller hvis de ikke er ensartede i en isolation, kan dette give problemer under både enzymatisk fordøjelse og trituration. Dette skyldes, at små strimler vil være mere grundigt fordøjet og store strimler vil være under fordøjet. Det er lige så vigtigt at betragte den genotype og sygdoms indstilling, der er undersøgt, som størrelsen af atrieflimren kan variere mellem dyrene. For eksempel har hypertrofisk hjerter større atrieflimren vedhæng sammenlignet med sunde hjerter, og derfor eksperimententer kan skære flere strimler i hypertrofisk hjerter i forhold til normal størrelse hjerter. Derfor vil optimering af størrelsen af de afskårne vævs strimler og anvendelse af disse dimensioner til hver enkelt atrieflimning i høj grad forbedre reproducerbarhed af nekrotiske isoleringer mellem eksperimentelle betingelser.
Den delikate balance mellem enzymatisk fordøjelse og mekanisk dissociation er nøglen til en vellykket atrieflimren nekrotiske isolation ved hjælp af denne protokol. Hvis vævet ikke er tilstrækkeligt hvirvlet under den enzymatiske fordøjelse de enkelte vævs strimler vil tendens til at klump og holde sammen, hvilket vil begrænse effektiviteten af den enzymatiske fordøjelse. Hvis ophidset for ofte eller energisk, dette kan beskadige atrieflimvævet, hvilket vil resultere i isolering af ikke-levedygtige celler. Mekanisk dissociation af isolerede atriale myocytter fra vævs strimler under formalings er det mest kritiske skridt til at øve og optimere ved hjælp af denne tilgang til at isolere atrieflimren myocytter. Hvis formalings er for blid, vil celle udbyttet være lavt. På den anden side, hvis formalings er for hård, så en overflod af ikke-levedygtige myocytter vil blive isoleret, og kvaliteten af data opnået under patch-klemme eksperimenter vil blive bragt i fare. Desuden kan sammensætningen af Atria påvirke isolationen. For eksempel, hvis væv er fibrotisk, den enzymatiske fordøjelse og formalings trin kan være nødvendigt at blive ændret. Det er derfor vigtigt at tage sig tid til at udvikle de færdigheder, der kræves for at opnå høj kvalitet celler under formalings, der kan anvendes til patch-clamp eksperimenter.
Som med alle eksperimentelle teknikker er der begrænsninger. Denne teknik kræver praksis for at reproducerbart isolere levedygtige, høj kvalitet myocytter, som igen vil påvirke gennemførligheden af eventuelle eksperimenter, der skal udføres ved hjælp af disse myocytter. Denne fremgangsmåde er også Terminal og atrieflimren myocytter isoleret ved hjælp af denne fremgangsmåde kan anvendes på dagen for isolation kun. Vores laboratorium bruger cellerne inden for 6-7 h isolation.
Denne tilgang til isolering atrieflimren kardiomyocytter har flere anvendelser. For eksempel kan denne fremgangsmåde modificeres for at isolere atrieflimren myocytter (såvel som kardiale fibroblaster) fra andre arter, herunder humane atrieflimbider. Desuden er en fordel ved at bruge denne chunk metode til atrieflimren nekrotiske isolation (i modsætning til retrograd perfusion af hjertet), at det kan ændres til at isolere kardiomyocytter fra andre områder af hjertet, såsom sinoatrialt knude eller andre specifikke regioner af atrialmyokardiet, eller omfatter hele den supraventrikulære region i hjertet. Vores laboratorium bruger atrieflimren kardiomyocytter til patch-clamp eksperimenter til at måle aktionspotentialer og ionstrømninger, selv om denne fremgangsmåde ikke behøver at være begrænset til denne teknik. For eksempel kan isolerede myocytter bruges til at undersøge ændringer i calcium transienter og kontraktilitet i en række eksperimentelle indstillinger. Atrial kardiomyocytter kan også anvendes i immunofluorescens undersøgelser for at studere placeringen af proteiner eller strukturer af interesse. Derfor er denne fremgangsmåde meget alsidig med mange mulige applikationer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde understøttes af driftstilskud fra de canadiske institutter for sundhedsforskning (MOP 93718, 142486) og Heart and Stroke Foundation of Canada til R.A. Rose. H.J. Jansen er modtager af et postdoc-stipendium fra Killam.
1, 2-Bis(2-Aminophenoxy)ethane-N, N, N', N'-tetraacetic acid 98% | Sigma | A4926-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra, > 99%, from microbial | Sigma | A7699-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt > 95%, bacterial | Sigma | A9187-1G | |
Amphocetericin B from Streptomyces sp. ~80% (HPLC), powder | Sigma | A4888-500 MG | |
Bovine serum albumin | Sigma | A3059-50G | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
Cesium chloride ReagentPlus, 99.9% | Sigma | 289329-100G | |
Cesium hydroxide monohydrate > 99.5% trace metals basis | Sigma | 562505-1KG | |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
Creatine anhydrous | Sigma | C0780 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
DL-Aspartic acid potassium salt | Sigma | A2025-100G | |
Elastase suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS002279 | |
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid >97.0% | Sigma | E4378-25G | |
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate > 95% (HPLC), powder | Sigma | G8877-250MG | |
Heparin 10 000 USP units/10mL | SANDOZ | 10750 | |
HEPES > 99.5% (titration) | Sigma | H3375-500G | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate > 99% (HPLC), powder | Sigma | G1501-500G | |
Magnesium sulfate | Sigma | M2643-500G | |
Nifedipine > 98% (HPLC), powder | Sigma | N7634-1G | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate enzymatic, approx 98% | Sigma | P7936-5G | |
Potassium chloride ACS reagent, 99.0-100.5% | Sigma | P3911-500G | |
Potassium hydroxide | EM Science | PX1480-1 | |
Potassium phosphate monobasic | EMD | PX1565-1 | |
Protease from Streptomyces griseus, type XIV, >3.5 units/mg solid, powder | Sigma | P5147-1G | |
Sodium chloride ACS reagent, > 99.0% | Sigma | S9888-2.5KG | |
Sodium hydroxide, pellets, 97+%, A.C.S. reagent | Sigma | 221465-500G | |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments Inc | SYLG184 | |
Taurine | Sigma | T0625-100G | |
Tetraethylammonium chloride > 98% (titration) | Sigma | T2265-100G |