Summary
Detta protokoll används för att isolera enstaka förmakskardiomyocyter från vuxna mus hjärta med hjälp av en bit matsmältning strategi. Denna metod används för att isolera höger eller vänster förmaksflimmer myocyter som kan användas för att karakterisera förmaksflimmer myocyt elektrofysiologi i patch-Clamp studier.
Abstract
De elektrofysiologiska egenskaperna hos förmaksmyocyter huvudsakligen påverkar övergripande hjärtfunktion. Förändringar i de underliggande Joniska strömmarna som är ansvariga för åtgärdens potential kan orsaka proarytmiska substrat som ligger bakom arytmier, såsom förmaksflimmer, som är mycket utbredda i många tillstånd och sjukdomstillstånd. Isolera vuxna mus förmakskardiomyocyter för användning i patch-Clamp experiment har kraftigt Avancerat vår kunskap och förståelse av cellulära elektrofysiologi i friska förmaksmykardium och i inställningen av förmaksflimmer patofysiologi. Dessutom har studier med hjälp av genetiska musmodeller belysa rollen av ett brett spektrum av proteiner i regleringen av förmakselektrofysiologi. Här ger vi ett detaljerat protokoll för isolering av kardiomyocyter från förmaksbihang av vuxna möss med hjälp av en kombination av enzymatisk matsmältning och mekanisk dissociation av dessa vävnader. Detta tillvägagångssätt konsekvent och tillförlitligt ger isolerade förmakskardiomyocyter som sedan kan användas för att karakterisera cellulär elektrofysiologi genom att mäta åtgärder potentialer och Joniska strömmar i patch-Clamp experiment under ett antal experimentella Villkor.
Introduction
Den Atria, som är den tunna muromgärdade, lågtrycks kammare i hjärtat som tar emot blod från den överlägsna och sämre Vena cavae samt pulmonell vener, är integrerad i normal hjärtfysiologi. Liksom andra regioner i hjärtat, den Atria innehåller ett antal celltyper, inklusive kardiomyocyter, fibroblaster, endotelceller, vaskulära glatta muskelceller, och andra. Förmaksmyocyter är elektriskt retbara celler som spelar en viktig roll i ledning av elektriska signaler genom hjärtat, vilket säkerställer korrekt förmakskontraktion under varje hjärtslag1. Elektrisk dysfunktion i Atria kan leda till ett antal förmaksflimmer specifika arytmier såsom förmaksfladder och förmaksflimmer2,3. Dessa är mycket utbredda, men dåligt förstått, förmaksflimmer arytmier som leder till betydande morbiditet och dödlighet. Förmaksflimmer kan förekomma i samband med genetiska mutationer, i samband med åldrande eller vid fastställandet av förvärvade former av hjärtsjukdom, inklusive hypertoni, hjärtsvikt och diabetes2,4,5 ,6. Dessa villkor kan förändra de elektriska egenskaperna hos förmaksmyocyter som kan skapa ett substrat som ökar prevalensen av arytmogenes1,2.
Normal elektrisk funktion i Atria, liksom förmaksflimmer arytmogenes, är huvudsakligen påverkas av morfologin av åtgärden potential (AP) produceras i förmaksmyocyter. Den förmaksflimmer genereras från aktiviteten hos ett antal Joniska strömmar, inklusive natriumströmmen (Ina, transporteras med NaV1,5 kanaler), l-typ kalcium ström (ica, L, transporteras med cav1,2 och cav1,3 kanaler ), och flera kalium strömmar inklusive Ultra-Rapid fördröjd likriktare kalium ström (Ikur, transporteras med KV1,5 kanaler), den transienta yttre kalium ström (itill, transporteras med kv4,2 och kv4,3 (iKSS, buren av kV2,1 kanaler), och den aktiva likriktaren kalium ström (iK1, buren av KIR2,1-kanaler)1,7, 8. Även om de inte spelar en viktig roll i musen Atria, de snabba och långsamma komponenterna i den fördröjda likriktaren K+ ström (ikr och jagKS) bidrar också till AP repolarisering i vissa arter7. Förändringar i en eller flera av dessa Joniska strömmar kan avsevärt förändra de elektriska egenskaperna hos förmaksflimmer myocyter, vilket kan leda till förmaksflimmer arytmier. Till exempel kan en minskning av ina sakta överledning hastighet över Atria genom att minska AP upstroke hastighet. Å andra sidan, en minskning av repolariserande kalium strömmar eller en ökning av antingen jagca, L eller den sena jagna kan resultera i utveckling av afterdepolarizations som kan utlösa spontan aktivitet i Atria1, 2,9.
Det är viktigt att inse att det finns skillnader i AP morfologi i olika delar av förmaksmyocardium som sannolikt beror på skillnader i uttryck eller reglering av dessa underliggande jonkanaler. Till exempel, skillnader i AP-varaktighet mellan höger och vänster Atria i samband med skillnader i itill nuvarande densitet har väl beskrivits10,11,12,13. Dessutom har vi nyligen visat att det finns distinkta mönster av elektrisk remodeling i höger och vänster Atria av möss med kronisk hypertoni6,14. Rätt förmaksflimmer bakre väggen innehåller också sinoatriellt noden, som har sina egna distinkta mönster av AP morfologi och bränning mönster15. De distinkta egenskaperna hos myocyter i var och en av dessa olika delar av Atria kan undersökas i detalj med hjälp av isolerade myocyter från var och en av dessa regioner.
Det finns olika metoder som kan användas för att isolera förmaksflimmer myocyter för patch-Clamp elektrofysiologi studier16. En möjlighet är att använda en retrograd perfusion metod där hjärtat kanyleras via aorta för leverans av enzymer. Även om detta är en livskraftig metod, det kan producera variationer i förmaksmyocyte kvalitet på grund av inkonsekvenser i perfusion av Atria. Vi har antagit en "Chunk" digestionsmetod för isolering av förmaksmyocyter som eliminerar behovet av retrograd perfusion av hjärtat. Vår metod använder en kombination av enzymatisk matsmältning och mekanisk dissociation av förmaksvävnad som konsekvent och tillförlitligt ger ett stort antal isolerade förmaksmyocyter som är lämpliga för patch-klämma studier. Medan vi beskriver vår strategi här med förmaksflimmer bihang vävnad, tillvägagångssättet kan användas på någon region av förmaksflimmer hjärtmuskeln (dvs, höger eller vänster förmaksbihang, fria väggar, bakre väggar) att prövaren väljer. Denna metod är idealisk för studier av förmaksflimmer myocyt elektrofysiologi hos genetiskt modifierade möss, i musmodeller av hjärt-kärlsjukdom, eller för att studera effekterna av farmakologiska föreningar5,6,17 , 18 , 19.
Protocol
Alla djur förfaranden godkändes av University of Calgary djuromsorg och användning kommitté och genomfördes i enlighet med riktlinjerna från det kanadensiska rådet om djuromsorg. Den förmaksflimmer myocyt isolering, bilder och representativa resultat som beskrivs nedan erhölls från en 15 veckors gammal manlig vildtyp C57BL/6 mus. Vi använder rutinmässigt detta protokoll för att isolera förmaksmyocyter från vildtyp möss17,18, möss som transporterar genetiska mutationer19,20 och musmodeller av sjukdom såsom kronisk hypertoni6, 14. Protokollet kan användas på samma sätt för manliga eller kvinnliga möss. Vi utnyttjade också en liknande version av detta isolerings förfarande för att isolera sinoatriellt nod myocyter från mus hjärta17,21,22,23. Ett flödesschema av detta experimentella protokoll finns i figur 1.
1. beredning av stamlösningar och-utrustning
- Förbered 1 dissekera skålen genom att tillsätta silikonelastomer enligt tillverkarens anvisningar. Tillsätt tillräckligt silikon elastomer förening för att täcka botten av en 10 cm petriskål till ett djup av 1 cm. Låt bota och sedan sätta in 6 insekt stift i skålen.
Anmärkning: Detta silikon dissekera skålen kan återanvändas i månader och lagras i rumstemperatur. - Förbered 3 brandpolerade Pasteur-pipetter med en öppning på 1 mm (liten cylinderdiameter), 3 mm (medium Bore) eller 5 mm (stort hål) i diameter som visas i figur 2A. För att göra dessa pipetter, gör en Pasteur-pipett och knäpp sedan längs med Poäng markeringen för att framställa en öppning som är något större än den önskade borrstorleken. Använd en metall fil för att jämna ut ytan och sedan avfyra-polera denna öppning med en öppen låga.
Anmärkning: Detta kommer att producera en slät, brandpolerad kant med en öppning av den önskade diametern. Det är viktigt att öppningen är fri från sprickor och grova ytor. Dessa brandpolerade pipetter kan förvaras i rumstemperatur och återanvändas i månader. - Bered stamlösningar för Tyrodes pH 6,9-lösning och Tyrodes pH 7,4-lösning enligt tabell 1. Förbered också 10 mL vardera av 1 M MgCl2, 1 m CaCl2, och 100 mm CaCl2. Använd ultrarent vatten för alla lösningar och förvara vid 4 ° c i upp till 2 månader.
- Bered 1 L av modifierad kraft-Brühe (KB) lösning enligt tabell 2. Använd ultrarent vatten. Dela upp lösningen i 20 mL-aliquoter och förvara vid-20 ° c i upp till 2 månader.
2. beredning av lösningar och isolerings inställningar för förmaksflimmer myocyte isolering
- Bered 50 mL av en modifierad Tyrodes pH 7,4-lösning enligt beskrivningen i tabell 3 i en 125 ml Erlenmeyerkolv med 1 m CaCl2 och 1 m mgcl2 -lagerlösningar. Placera Erlenmeyerkolven i ett vattenbad i 35 ° c tills den används, som visas i figur 2b.
- Bered den modifierade Tyrodes pH 6,9-lösning som beskrivs i tabell 4 i ett 50 ml-rör med hjälp av 100 mm CaCl2 -lagerlösningen. Alikvot 2,5 mL av denna lösning i vart och ett av de tre 5 mL runda botten rören. Placera dessa rör i ett tråd rack placerat i ett 35 ° c vattenbad tills det används, som visas i figur 2b.
- Bered den enzymlösning som beskrivs i tabell 5 i ett 14 ml runt botten rör. För att göra proteaslösningen, tillsätt 1 mg proteas per 100 μl av ultrarent vatten. Placera röret som innehåller denna enzymlösning i trådhållaren och inkubera i ett vattenbad på 35 ° c tills det används.
- Tina en alikvot av modifierad KB-lösning i en 35 ° c vattenbad. Alikvot 2,5 mL av KB-lösning i var och en av tre 5 mL runda botten rör och 2,5 mL i en 14 mL rund botten röret. Placera dessa rör i trådhållaren och inkubera i ett vattenbad på 35 ° c tills det används, som visas i figur 2b.
- Lägg ut den dissekera plattan, dissekera verktyg, en Pasteur pipett, och de brandpolerade pipetter som visas i figur 2b.
3. dissektion av mus förmaks bihang (s)
- Injicera musen med 0,2 mL heparin (10 000 USP U/10 mL) via intraperitoneal injektion och vänta 5 min för absorption.
- Placera musen i en induktions kammare och söva av isofluran inandning (3-4%). Isofluran och syre levereras med hjälp av en anestesi maskin och avfall bedövningsmedel gas rensas. När musen är anesthetized, och inte uppvisar en tå nypa reflex, euthanize musen genom snabb cervikal dislokation. Placera musen på en pappershandduk eller en kork ombord och tejpa tassar ner för att hålla musen på plats.
- Fukta musens bröst med 70% etanol. Ta bort pälsen och huden som täcker bröstet med böjda saxar. Nästa, Använd råtta tand tång för att lyfta bröstbenet och sedan klippa membranet längs kanten av revbenen. Ta bort hela bröstkorgen med böjda saxar för att exponera hjärtat.
- För att ta bort förmaksflimmer bihang (höger eller vänster), försiktigt lyfta bihang med fina dissekera tång och skär ut det med våren sax. Överför omedelbart det atriella bihang till en silikonbelagd dissekterande skål som innehåller 20 mL av den värmda modifierade Tyrodes pH 7,4 lösning som beskrivs i steg 2,1.
- Placera en dissekera stift på toppen och en nål på botten av öppningen av förmaksflimmer bihang. Med hjälp av en betpipett, spola Atria med den värmda modifierade Tyrodes pH 7,4 lösning för att avlägsna blod. Öppna förmaksflimmer bihang genom att skära längs den övre och nedre kanten av förmaksflimmer bihang. Nästa, stift hörnen av den förmaksflimmer bihang ner för att skapa en platt, rektangulär bit vävnad, som visas i figur 3a.
4. isolering av Förmaksmyocyter
Anmärkning: Stegen i detta avsnitt är alla utförda vid 35 ° c, med rör nedsänkt i en 35 ° c vattenbad. Var försiktig när du överför vävnad remsor mellan runda botten rör för att säkerställa att endast vävnaden (och inte lösningen) överförs mellan rören.
- Skär förmaket bihang i cirka 8-10 lika stora remsor (ca 0,7 mm i bredd) med hjälp av våren sax och fina pintippar. Ett exempel på remsor av förmaksflimmer vävnad visas i figur 3b. Observera att remsorna kontraktet när de är skurna fria från de viktigaste bit vävnad. Använd den lilla, brandpolerade pipetten och överför vävnads remsorna till det första röret som innehåller värmd modifierad Tyrodes pH 6,9 lösning som beskrivs i steg 2,2. Vänta 5 min.
- Tvätta vävnads remsorna genom att överföra dem till den andra och sedan den tredje runda botten röret som innehåller modifierad Tyrodes pH 6,9 lösning beredd i steg 2,2 med hjälp av medium Bore Fire-polerad pipett.
- För att tvätta vävnaden remsor, locket 5 mL runda botten röret och försiktigt Invertera röret 3 gånger. Låt vävnads remsor bosätta sig på botten av röret innan du överför vävnad remsor till nästa röret med hjälp av medium Bore Fire-polerad pipett.
- Överför vävnads remsorna till den enzymlösning som beskrivs i steg 2,3 med en medelstor, brandpolerad pipett och inkubera i 30 min. snurra röret varje 3-5 min för att förhindra att vävnads remsor fastnar tillsammans.
Anmärkning: I början av den enzymatiska matsmältningen, vävnad remsor bosätta sig snabbt efter virvlande. Vid cirka 20 min av matsmältningen, vävnads remsor börjar flyta i enzymatisk lösning efter virvlande. Under denna tid, den förmaksflimmer vävnad remsor också ändra utseende från blek rosa till vitt som de smälts. - Efter enzymatisk nedbrytning, utför tre tvättar med 2,5 mL KB-lösning i 5 mL runda botten rören beredda i steg 2,4. För varje tvätt, vänd försiktigt röret 3 gånger innan du flyttar vävnaden till nästa rör med hjälp av medium Bore Fire-polerad pipett. Efter den sista tvätten, överför remsorna till den 14 mL runda botten röret som innehåller 2,5 mL KB-lösning. Vänta 5 min.
- Försiktigt triturera vävnaden för 7,5 min med hjälp av Wide bore Fire-polerad pipett. Detta kommer att mekaniskt separera vävnaden remsor och ge en grumlig lösning fylld med enskilda förmaksflimmer myocyter.
Anmärkning: Under trituration blir vävnaden vit och lösningen blir grumlig. Den kraft av trituration, uppnås genom att ändra både frekvens och hastighet att utträda vävnad remsor från den breda bar brandpolerade pipett, bör skräddarsys för den enskilda isoleringen. Om sönderdelning är för mild, kommer cell avkastningen vara låg, medan sönderdelning som är för hård kommer att ge många döda celler. Undvik bubblor medan triturating. - Fyll det 14 mL runda botten röret som innehåller de triturerade vävnads remsorna med KB-lösning till en slutlig volym på 7-10 mL beroende på önskad densitet av celler för experimentell användning. Placera detta rör i rumstemperatur under 1 h. Efter denna inkubationstid kan celler användas för en mängd olika experiment i upp till 7 timmar. cellerna kan också förvaras vid 4 ° c i upp till 7 timmar.
Representative Results
De förmaksmyocyter isolerade med detta protokoll kan användas för att karakterisera de elektrofysiologiska egenskaperna hos dessa celler med hjälp av patch-Clamp teknik. Alikvoter av förmaksmyocyter i KB lösning kan läggas till inspelnings kammaren av en standard patch-klämma apparater och översmält med lösningar lämpliga för den typ av inspelning experimentalist vill utföra. Förmaksmyocyter isolerade med detta protokoll är bäst används för elektrofysiologiska studier inom 6-7 h av isolering. Representativa patch-Clamp data från vårt laboratorium presenteras nedan.
Figur 4 illustrerar exempel på isolerade förmaksmyocyter från normala möss som bereds med hjälp av protokollet ovan. Isolerade förmaksmyocyter är typiskt på order av 100 μm i längd och 10 μm i bredd med tydliga stridningar. Kapacitansen av isolerade förmaksmyocyter är typiskt 40-70 pF.
Figur 5a illustrerar ett exempel på en förmaksflimmer myocyt AP registreras med hjälp av perforerade patch-Clamp teknik i nuvarande kläm läge, som vi har beskrivit tidigare6,19,20. Sammanfattande data som illustrerar typiska förmaksmyocyte AP-parametrar finns i tabell 6. Specifikt presenterar vi sammanfattningsdata för mätningar av vilande membran potential (RMP), maximal upptakt hastighet (VMax), överskridandet (OS) och AP varaktighet på 50% (APD50), 70% (APD70) och 90% (APD90) repolarisering tid (tabell 6). APs kan också spelas in i hela cellen konfiguration14. Superfusion-och pipettlösningarna för registrering av APs finns i tabell 7 och tabell 8.
Figur 5b illustrerar en representativ familj av na+ strömmar (ina) som registrerats i hela cell konfigurationen av patch-Clamp-tekniken. Dessa strömmar spelades in med 50 ms spännings klämma steg mellan-100 och + 10 mV från en anläggning potential-120 mV. Vi har beskrivit metoder och protokoll för inspelning Ina tidigare6,14,20. En sammanfattning ina IV-relationen presenteras också i Figur 5b. Lösningar som används för att registrera ina presenteras i tabell 7 och tabell 8.
Figur 5c illustrerar en representativ familj med ca2 + strömmar (ica, L) som registrerats i hela cell konfigurationen av patch-Clamp-tekniken. Dessa strömmar spelades in med 250 MS spännings klämma steg mellan-60 och + 80 mV från en anläggning potential-70 mV. De experimentella förhållanden som kan användas för att mäta ica, L har tidigare beskrivits17,18,20. En sammanfattning Ica, L IV relation presenteras också i figur 5c. De lösningar som används för att registrera Ica, L finns i tabell 7 och tabell 8.
Figur 5D illustrerar en representativ familj av k+ strömmar (IK) som registrerats i hela cell konfigurationen av patch-Clamp-tekniken. Dessa strömmar spelades in från en holdingpotential på-80 MV med 500 ms spännings klämma steg mellan-120 MV och + 80 MV, som vi har beskrivit tidigare6,14. Den sammanfattande IV-relationen för total IK presenteras också i figur 5D. De lösningar som används för att registrera iK finns i tabell 7 och tabell 8.
Med hjälp av dessa metoder för att registrera APs och stora familjer av Joniska strömmar, inklusive na+, ca2 + och K+ strömmar (som illustreras ovan), tillåter prövaren att rigoröst förhöra förmaksmyocyte elektrofysiologi i en mängd experimentella förhållanden. Vårt laboratorium har rutinmässigt använt dessa tekniker för att studera förmaksflimmer myocyt elektrofysiologi i normala möss, i musmodeller av hjärtsjukdom, och i genetiskt modifierade möss6,14,17,18 ,19,20.
Figur 1: flödesschema för det förmaksflimmer myocyt isolerings protokollet. Sammanfattning av de steg som används för att isolera förmaksmyocyter med detta protokoll. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: experimentell inställning och dissekeringsverktyg för förmaksflimmer myocyt isolering. A) en liten, brandpolerad pipett med en öppning på 1 mm i diameter (till vänster) används för vävnads överföring efter dissektion, en medelbar, brandpolerad pipett med en öppning på 3 mm i diameter (mitten) används för att överföra vävnads remsor under isolering, och en stor bar brandpolerad pipett med en öppning 5 mm i diameter (höger) används för sönderdelning av smält förmaksvävnad. (B). experimentell inställning för förmaksflimmer myocyt isolering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: bild av förmaksflimmer bihang dissektion. (A). representativ ljus fält bild av en censurerade förmaksflimmer klippa öppen och nålas ut. (B). representativa ljusa fältet bild av förmaksflimmer bihang skuren i vävnad remsor av cirka 0,7 mm i bredd. Scale bar = 1 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: bilder av isolerade förmaksmyocyter. (A). brightfield bild av isolerade förmaksmyocyter omedelbart efter isolering. Skalstapel = 50 μm. (B). brightfield bild av en enda isolerad förmaksmyocyt. Skalstapel = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativ patch-klämma data som erhållits från isolerade förmaksmyocyter. (A). representativ STIMULERAD AP-inspelning från en isolerad förmaksmyocyt. Sammanfattning av AP-parametrarna presenteras i tabell 6. Amfotericin B (200 μg/mL) lades till pipettlösningen för att permeabilisera det cellulära membranet. (B). representativa ina inspelningar (vänster) och sammanfattning Ina IV kurva (höger) från en isolerad förmaksmyocyt. Nifedipin (10 μM) lades till den modifierade Tyrodes lösning för att blockera Ica, L vid inspelning Ina. C. representant Ica, l inspelningar (vänster) och sammanfattning Ica, l IV kurva (höger) från en isolerad förmaksmyocyt. (D). representativa ik inspelningar (vänster) och sammanfattning Ik IV kurva (höger) från en isolerad förmaksmyocyt. De lösningar som används för att registrera var och en av dessa strömmar listas i tabell 7 och tabell 8. Sammanfattning IV kurvor är genomsnittliga mätningar från 10 förmaksflimmer myocyter isolerade från en 15 veckors gammal hane vildtyp C57Bl/6 mus. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Stock Tyrodes pH 6,9 | Stock Tyrodes pH 7,4 | |
| Kemiska | i mM | i mM |
| Nacl | 140 | 140 |
| KCl | 5,4 | 5,4 |
| KH2Po4 | 1,2 | 1,2 |
| HEPES | 5 | 5 |
| Slutlig volym | 500 mL | 1 L |
| Slutligt pH med NaOH | 6,9 | 7,4 |
Tabell 1: Stock Tyrodes ph 7,4 och Stock Tyrodes ph 6,9 Solutions. Sammansättningen av beståndet Tyrodes lösningar (pH 7,4 och pH 6,9) som kan göras i förväg och förvaras vid 4 ° c i upp till 2 månader.
| Kemiska | i mM |
| K-glutamat | 100 |
| K-aspartat | 10 |
| KCl | 25 |
| KH2PO4 | 10 |
| MgSO4 | 2 |
| Taurin | 20 |
| Kreatin | 5 |
| EGTA | 0,5 |
| Glukos | 20 |
| HEPES | 5 |
| Bsa | 0,10% |
| Slutlig volym | 1 L |
| Final pH med KOH | 7,2 |
Tabell 2: modifierad KB-lösning. Recept på modifierad KB-lösning som kan göras i förväg, aliciterat och lagrat vid-20 ° c i upp till 2 månader.
| Kemiska | Belopp |
| Glukos | 5,55 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| CaCl2 | 1,8 mM |
| Stock Tyrodes pH 7,4 | 50 mL |
| Heparin | 250 μL |
Tabell 3: modifierad Tyrodes pH 7,4 lösning med glukos, magnesium, kalcium och heparin. Sammansättningen av modifierad Tyrodes pH 7,4-lösning som används för förmaksdissektion. Denna lösning bör göras fräsch och förvaras i en 35 ° c vattenbad tills den används.
| Kemiska | Belopp |
| Glukos | 18,5 mM |
| Taurin | 49,96 mM |
| Bsa | 15 mg |
| CaCl2 | 0,066 mM |
| Stock Tyrodes pH 6,9 | 15 mL |
Tabell 4: modifierad Tyrodes pH 6,9 lösning innehållande glukos, taurin, BSA och lågt kalcium. Sammansättningen av den modifierade tyrodes pH 6,9-lösning som används för förmaksflimmer myocyt isolering. Denna lösning bör göras fräsch och förvaras i en 35 ° c vattenbad tills den används.
| Kemiska | Belopp |
| Kollagenas från | 1 064 U |
| Elastase | 9 U |
| Proteaslösning | 65,2 μL |
| Modifierad Tyrodes pH 6,9 | 5 mL |
Tabell 5: enzymatisk lösning. Sammansättningen av den enzymatiska lösning som används för att enzymatiskt smälta förmaksvävnad remsor. Denna lösning bör göras fräsch och förvaras i en 35 ° c vattenbad tills den används.
| Parametern | Genomsnittliga |
| RMP (mV) | -74,2 ± 0,7 |
| Vmax (V/s) | 144,6 ± 5,8 |
| OS (mV) | 71,9 ± 3,0 |
| APD50 (MS) | 11,1 ± 1,7 |
| APD70 (MS) | 23,0 ± 4,6 |
| APD90 (MS) | 54,7 ± 7,8 |
Tabell 6: Sammanfattning av AP-parametrar från isolerade förmaksmyocyter. Data presenteras som medelvärdet ± SEM, n = 10 förmaksmyocyter isolerade från en 15 veckors manlig vildtyp C57BL/6 mus.
| Kalium strömmar och APs | Natrium strömmar | Kalcium strömmar | |
| Kemiska | i mM | i mM | i mM |
| Nacl | 140 | 5 | |
| KCl | 5,4 | ||
| MgCl2 | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | 1 | 1 | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| Glukos | 5,5 | 5,5 | 5,5 |
| Europe | 130 | ||
| TEA-cl | 5,4 | 145,5 | |
| Ph | 7,4 med NaOH | 7,4 med CsOH | 7,4 med CsOH |
Tabell 7: sammansättningen av tyrodes lösningar som används under patch-Clamp experiment. Sammansättningen av Tyrode lösningar som används för att registrera APs, jagna, jagca, L, och jagK från isolerade förmaksmyocyter.
| Kalium strömmar och APs | Natrium strömmar | Kalcium strömmar | |
| Kemiska | i mM | i mM | i mM |
| Nacl | 5 | 5 | 5 |
| KCl | 140 | ||
| MgCl2 | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| EGTA | 5 | 5 | |
| Mg-ATP | 4 | 5 | 4 |
| Na-GTP | 0,3 | 0,3 | 0,3 |
| Na-fosfokreatin | 6,6 | 6,6 | |
| Europe | 130 | 135 | |
| BAPTA | 5 | ||
| Ph | 7,2 med KOH | 7,2 med CsOH | 7,2 med CsOH |
Tabell 8: sammansättningen av den interna pipettlösningen som används under patch-Clamp-experiment. Sammansättningen av pipetten fyllnings lösningar som används för att registrera APs, jagna, jagca, L, och jagK från isolerade förmaksmyocyter.
Discussion
Vårt labb använder rutinmässigt detta protokoll för att isolera mus förmaksflimmer myocyter för användning i patch-Clamp experiment för att undersöka effekterna av olika former av hjärt-kärlsjukdom, genetiska mutationer, eller farmakologiska föreningar på förmaksflimmer myocyt Elektrofysiologi. Även om mycket reproducerbara, kvaliteten på de data som erhålls från isolerade förmaksmyocyter beror på kvaliteten på isoleringen. Dessutom kommer återinförande av kalcium efter förmaksflimmer myocyt isolering resultera i celldöd för en population av isolerade myocyter på grund av kalcium Paradox16. Följaktligen, isolera livskraftiga, högkvalitativa förmaksmyocyter med denna metod kräver övning och optimering på flera punkter under isoleringen. När optimerad, det uppskattas att mellan 70-90% av den totala förmaksflimmer myocyter isolerade med denna metod kommer att vara både kalcium tolerant och Rod formad. Stegen som kräver mest övning och optimering diskuteras nedan.
Hastigheten och effektiviteten av dissektion kommer att ha nedströms effekter på kvaliteten på de isolerade cellerna. Det är viktigt att ta tid att se till att allt blod avlägsnas från den förmaksflimmer vävnaden och att vävnad remsor skärs till en liknande storlek. Det bör ta cirka 5 min att ta bort den förmaksflimmer bihang, skär vävnaden i strimlor, och överföra vävnaden remsor i det första röret av modifierad Tyrodes pH 6,9 lösning. Men om detta steg tar för lång tid, kan kvaliteten på vävnaden äventyras.
Det är också viktigt att vävnads remsor skärs till en enhetlig storlek inom en isolering och mellan hjärtan. Om vävnad remsor är för stora eller för små, eller om de inte är enhetliga i en isolering, detta kan orsaka problem under både enzymatisk matsmältning och trituration. Detta beror på att små remsor kommer att vara mer grundligt smält och stora remsor kommer att vara under smält. Det är lika viktigt att överväga genotyp och sjukdoms inställningen studeras som storleken på den förmaksflimmer bihang kan variera mellan djur. Till exempel, hypertrofiska hjärtan har större förmaksbihang jämfört med friska hjärtan, och därför kan försöksledaren skära fler remsor i hypertrofiska hjärtan jämfört med normalstora hjärtan. Följaktligen, optimera storleken på skära vävnad remsor och tillämpa dessa dimensioner på varje enskild förmaksflimmer bihang kommer att avsevärt förbättra reproducerbarheten av myocyt isoleringar mellan Försöksförhållanden.
Den känsliga balansen mellan enzymatisk nedbrytning och mekanisk dissociation är nyckeln till en lyckad förmaksflimmer myocyt isolering med hjälp av detta protokoll. Om vävnaden inte är tillräckligt virvlade under enzymatisk nedbrytning de enskilda vävnads remsor tenderar att klumpa och hålla ihop, vilket kommer att begränsa effektiviteten i den enzymatiska matsmältningen. Om upprörd alltför ofta eller kraftfullt, detta kan skada den förmaksflimmer vävnaden, vilket kommer att resultera i isolering av nonlivskraftiga celler. Mekanisk dissociation av isolerade förmaksmyocyter från vävnad remsor under sönderdelning är det mest kritiska steget för att öva och optimera med hjälp av denna metod för att isolera förmaksmyocyter. Om triturering är för skonsam kommer cell utbytet att vara lågt. Å andra sidan, om sönderdelning är för hård, då ett överflöd av icke-livskraftiga myocyter kommer att isoleras, och kvaliteten på data som erhålls under patch-klämma experiment kommer att äventyras. Dessutom kan sammansättningen av Atria påverka isoleringen. Till exempel, om vävnaden är fibrotisk, den enzymatiska matsmältningen och sönderdelning stegen kan behöva ändras. Det är därför viktigt att ta sig tid att utveckla de färdigheter som krävs för att få hög kvalitet celler under sönderdelning som kan användas för patch-klämma experiment.
Som med alla experimentella tekniker finns det begränsningar. Denna teknik kräver praxis för att reproducerbart isolera livskraftiga, hög kvalitet myocyter, vilket i sin tur kommer att påverka genomförbarheten av alla experiment som skall utföras med dessa myocyter. Detta tillvägagångssätt är också Terminal och förmaksmyocyter isolerade med denna metod kan användas på dagen för isolering endast. Vårt labb använder cellerna inom 6-7 h isolering.
Denna metod för att isolera förmakskardiomyocyter har flera tillämpningar. Till exempel, denna metod kan ändras för att isolera förmaksmyocyter (liksom hjärt fibroblaster) från andra arter inklusive mänskliga förmaksflimmer vävnadbiopsier. Dessutom, en fördel med att använda denna Chunk metod för förmaksflimmer myocyt isolering (i motsats till retrograd perfusion av hjärtat) är att det kan ändras för att isolera kardiomyocyter från andra regioner i hjärtat, såsom sinoatriell nod eller andra specifika regioner av den förmaksflimmer myocardium, eller omfattar hela supraventrikulär regionen i hjärtat. Vårt labb använder förmakskardiomyocyter för patch-Clamp experiment för att mäta åtgärder potentialer och Joniska strömmar, även om detta tillvägagångssätt behöver inte begränsas till denna teknik. Till exempel, isolerade myocyter kan användas för att undersöka förändringar i kalcium transienter och kontraktilitet i en mängd olika experimentella inställningar. Atriella kardiomyocyter kan också användas i immunofluorescensstudier för att studera placeringen av proteiner eller strukturer av intresse. Därför är denna metod mycket mångsidig med många möjliga tillämpningar.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av driftsbidrag från de kanadensiska instituten för hälsoforskning (MOP 93718, 142486) och Heart and stroke Foundation i Kanada till ra Rose. H.J. Jansen är mottagare av en Killam postdoktor gemenskap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1, 2-Bis(2-Aminophenoxy)ethane-N, N, N', N'-tetraacetic acid 98% | Sigma | A4926-1G | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra, > 99%, from microbial | Sigma | A7699-1G | |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt > 95%, bacterial | Sigma | A9187-1G | |
| Amphocetericin B from Streptomyces sp. ~80% (HPLC), powder | Sigma | A4888-500 MG | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059-50G | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
| Cesium chloride ReagentPlus, 99.9% | Sigma | 289329-100G | |
| Cesium hydroxide monohydrate > 99.5% trace metals basis | Sigma | 562505-1KG | |
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
| Creatine anhydrous | Sigma | C0780 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| DL-Aspartic acid potassium salt | Sigma | A2025-100G | |
| Elastase suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS002279 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid >97.0% | Sigma | E4378-25G | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate > 95% (HPLC), powder | Sigma | G8877-250MG | |
| Heparin 10 000 USP U/10 mL | SANDOZ | 10750 | |
| HEPES > 99.5% (titration) | Sigma | H3375-500G | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate > 99% (HPLC), powder | Sigma | G1501-500G | |
| Magnesium sulfate | Sigma | M2643-500G | |
| Nifedipine > 98% (HPLC), powder | Sigma | N7634-1G | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate enzymatic, approx 98% | Sigma | P7936-5G | |
| Potassium chloride ACS reagent, 99.0-100.5% | Sigma | P3911-500G | |
| Potassium hydroxide | EM Science | PX1480-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | EMD | PX1565-1 | |
| Protease from Streptomyces griseus, type XIV, >3.5 units/mg solid, powder | Sigma | P5147-1G | |
| Sodium chloride ACS reagent, > 99.0% | Sigma | S9888-2.5KG | |
| Sodium hydroxide, pellets, 97+%, A.C.S. reagent | Sigma | 221465-500G | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments Inc | SYLG184 | |
| Taurine | Sigma | T0625-100G | |
| Tetraethylammonium chloride > 98% (titration) | Sigma | T2265-100G |
References
- Bartos, D. C., Grandi, E., Ripplinger, C. M.
- Heijman, J., Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Cellular and molecular electrophysiology of atrial fibrillation initiation, maintenance, and progression. Circulation Research. 114 (9), 1483-1499 (2014).
- Jalife, J.
- Nattel, S., Maguy, A., Le Bouter, S., Yeh, Y. H. Arrhythmogenic ion-channel remodeling in the heart: heart failure, myocardial infarction, and atrial fibrillation. Physiological Reviews. 87 (2), 425-456 (2007).
- Jansen, H. J., et al. Atrial structure, function and arrhythmogenesis in aged and frail mice. Scientific Reports. 7, 44336 (2017).
- Jansen, H. J., et al. Distinct patterns of atrial electrical and structural remodeling in angiotensin II mediated atrial fibrillation. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 124, 12-25 (2018).
- Nerbonne, J. M., Kass, R. S.
- Grant, A. O.
- Schmitt, N., Grunnet, M., Olesen, S. P. Cardiac potassium channel subtypes: new roles in repolarization and arrhythmia. Physiological Reviews. 94 (2), 609-653 (2014).
- Lomax, A. E., Kondo, C. S., Giles, W. R. Comparison of time- and voltage-dependent K+ currents in myocytes from left and right atria of adult mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 285 (5), H1837-H1848 (2003).
- Li, D., Zhang, L., Kneller, J., Nattel, S. Potential ionic mechanism for repolarization differences between canine right and left atrium. Circ Res. 88 (11), 1168-1175 (2001).
- Wirth, K. J., Knobloch, K. Differential effects of dofetilide, amiodarone, and class lc drugs on left and right atrial refractoriness and left atrial vulnerability in pigs. Naunyn Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 363 (2), 166-174 (2001).
- Qi, A., Yeung-Lai-Wah, J. A., Xiao, J., Kerr, C. R. Regional differences in rabbit atrial repolarization: importance of transient outward current. American Journal of Physiology. 266 (2 Pt 2), H643-H649 (1994).
- Jansen, H. J., et al. NPR-C (Natriuretic Peptide Receptor-C) Modulates the Progression of Angiotensin II-Mediated Atrial Fibrillation and Atrial Remodeling in Mice. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 12 (1), e006863 (2019).
- Mangoni, M. E., Nargeot, J. Genesis and regulation of the heart automaticity. Physiological Reviews. 88 (3), 919-982 (2008).
- Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).
- Springer, J., et al. The natriuretic peptides BNP and CNP increase heart rate and electrical conduction by stimulating ionic currents in the sinoatrial node and atrial myocardium following activation of guanylyl cyclase-linked natriuretic peptide receptors. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (5), 1122-1134 (2012).
- Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. A. Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium. PLoS One. 7 (10), e47652 (2012).
- Egom, E. E., et al. Impaired sinoatrial node function and increased susceptibility to atrial fibrillation in mice lacking natriuretic peptide receptor C. Journal of Physiology. 593 (5), 1127-1146 (2015).
- Hua, R., et al. Effects of Wild-Type and Mutant Forms of Atrial Natriuretic Peptide on Atrial Electrophysiology and Arrhythmogenesis. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 8 (5), 1240-1254 (2015).
- Krishnaswamy, P. S., et al. Altered parasympathetic nervous system regulation of the sinoatrial node in Akita diabetic mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 82, 125-135 (2015).
- Mackasey, M., et al. Natriuretic peptide receptor C (NPR-C) protects against angiotensin II mediated sinoatrial disease in mice. JACC Basic to Translational Science. , (2018).
- Azer, J., Hua, R., Vella, K., Rose, R. A. Natriuretic peptides regulate heart rate and sinoatrial node function by activating multiple natriuretic peptide receptors. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 53 (5), 715-724 (2012).
