Bu protokol, bir öbek sindirim yaklaşımı kullanarak yetişkin fare kalbi tek atriyal kardiyomiyositler izole etmek için kullanılır. Bu yaklaşım, yama kelepçe çalışmalarında atriyal miyosit elektrofizyolojisini karakterize etmek için kullanılabilecek sağ veya sol atriyal miyositleri izole etmek için kullanılır.
Atriyal miyositlerin elektrofizyolojik özellikleri en önemlisi, genel kalp fonksiyonunu etkiler. Eylem potansiyelinden sorumlu altta yatan iyonik akımlarda yapılan değişiklikler, birçok koşulda ve hastalık Devletlerinde son derece yaygın olan atriyal fibrilasyon gibi aritmilerin altını çizen Pro-aritmik substratlar neden olabilir. Yama-kelepçe deneylerinde kullanılmak üzere yetişkin fare atriyal kardiyomiyositleri izole etmek, sağlıklı atriyal miyokard ve atriyal Patofizyoloji ortamında hücresel Elektrofizyolojinin bilgimizi ve anlayışını büyük ölçüde geliştirmiştir. Buna ek olarak, genetik fare modelleri kullanan çalışmalar atriyal Elektrofizyoloji düzenleyen protein geniş bir dizi rolünü aydınlatılamamıştır var. Burada, bu dokuların enzimatik sindirim ve mekanik dağılımının bir kombinasyonu ile yetişkin farelerin atriyal uzantılarıyla kardiyomiyositlerin izolasyonuna yönelik ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. Bu yaklaşım sürekli ve güvenilir bir dizi deneysel altında yama-kelepçe deneylerinde eylem potansiyelleri ve iyonik akımları ölçerek hücresel Elektrofizyoloji karakterize etmek için kullanılabilir izole atriyal kardiyomiyositler verir Koşul -ları.
Üstün ve inferior vena cavae ‘nin yanı sıra pulmoner damarlardan kan alan kalbin ince duvarlı, düşük basınçlı odaları olan Atria, normal kardiyak fizyolojide ayrılmaz bir parçasıdır. Kalbin diğer bölgeleri gibi, atriyumda kardiyomiyositler, fibroblastlar, endotel hücreler, vasküler pürüzsüz Kas hücreleri ve diğerleri de dahil olmak üzere bir dizi hücre türü bulunur. Atriyal miyositler, kalp yoluyla elektrik sinyallerinin iletilmede önemli bir rol oynayan elektriksel olarak heyecanlı hücrelerdir, böylece her kalp atışı sırasında uygun atriyal kasılma sağlanması1. Atria ‘daki elektrik fonksiyon bozukluğu, atriyal flutter ve atriyal fibrilasyon gibi bir dizi atriyal spesifik aritmilerin2,3‘ e yol açabilir. Bunlar önemli morbidite ve mortaliteye yol açabilecek son derece yaygın, henüz kötü anlaşılmayan atriyal aritmiler. Atriyal fibrilasyon, yaşlanma ile veya hipertansiyon, kalp yetmezliği ve diyabet dahil olmak üzere elde edilen kalp hastalığı formları ayarında, genetik mutasyonlar ile birlikte ortaya çıkabilir2,4,5 ,6. Bu koşullar, aritmojenin prevalansını artıran bir substrat oluşturabilen atriyal miyositlerin elektrik özelliklerini değiştirebilir1,2.
Atriyal aritmojeninin yanı sıra Atria ‘daki normal elektrik fonksiyonu da daha da önemlisi, atriyal miyositlerde üretilen eylem potansiyelinin (AP) morfolojisinin etkilenir. Atriyal AP, sodyum akımı (ına, nav1,5 kanallar tarafından taşınan), l-tipi kalsiyum akımı (ıCA, l, cav1,2 ve CAv1,3 kanallar tarafından taşınan dahil olmak üzere bir dizi iyonik akımın aktivitesinden üretilir. ) ve ultra hızlı gecikmeli doğrultucu potasyum akımı (ıKur, kv1,5 kanallar tarafından taşınan), geçici dışa doğru potasyum akımı (Kv4,2 ve kv4,3 tarafından taşınan)dahil olmak üzere çeşitli potasyum akımları kanallar), sabit bir durum potasyum akımı (ıKSS, kV2,1 kanallar tarafından taşınan), ve içe doğrultucu potasyum akımı (ıK1, kir2,1 kanallar tarafından taşınan)1,7, 8‘ den itibaren. Onlar fare Atria önemli bir rol oynamıyor rağmen, Gecikmeli doğrultucu K+ akım hızlı ve yavaş bileşenleri (ıKR ve benKS) Ayrıca bazı türler AP repolarizasyon katkıda7. Bu iyonik akımlardan bir veya birkaçı içinde yapılan değişiklikler, atriyal aritmilerin elektrik özelliklerini önemli ölçüde değiştirebilir. Örneğin, ına ‘da BIR azalma AP darbesi hızını azaltarak Atria genelinde iletim hızını yavaşlatabilir. Öte yandan, potasyum akımlarının repolarize edilmesi veya ıCA, L veya Late ına ‘da bir artış, Atria1‘ de spontan aktivite tetikleyebilen afterdepolarizasyon gelişimine neden olabilir, 2,9.
Atriyal miyokardinin farklı bölgelerinde AP morfolojisinde, bu temel iyon kanallarının ifadesinde veya düzenlenmesinde farklılıklar nedeniyle muhtemel farklılıklar olduğunu tanımak önemlidir. Örneğin, sağ ve sol Atria arasındaki AP süresinde, ı ‘nin geçerli yoğunluğa farklılıklarla ilişkilendirdiği farklılıklar iyi10,11,12,13olarak tanımlanmıştır. Ayrıca, son zamanlarda, kronik hipertansiyon ile farelerin sağ ve sol Atria elektrik remodeling farklı desenler olduğunu göstermiştir6,14. Sağ atriyal posterior duvar da AP Morfoloji ve ateş desenleri15kendi farklı desenleri vardır Sinoatriyal düğüm içerir. Atria ‘nın bu farklı bölümlerinin her birinde miyositlerin ayrı özellikleri, bu bölgelerin her birinden izole miyositler kullanılarak ayrıntılı olarak incelenebilir.
Atriyal miyositler için yama-kelepçe Elektrofizyoloji çalışmaları16yalıtmak için kullanılabilecek farklı yaklaşımlar vardır. Bir olasılık, kalp enzimlerin teslim için aort aracılığıyla kanüle bir retrograd perfüzyon yaklaşımı kullanmaktır. Bu uygun bir yaklaşım olsa da, atriyal miyosit kalitesinde, Atria perfüzyon tutarsızlıkları nedeniyle değişkenlik üretebilir. Biz kalp retrograd perfüzyon ihtiyacını ortadan kaldıran atriyal miyositlerin yalıtım için bir ‘ öbek ‘ sindirim yaklaşımı benimsemiştir. Yaklaşımımız, yama-kelepçe çalışmaları için uygun olan çok sayıda izole atriyal miyositlerin sürekli ve güvenilir bir şekilde verebilmesi için enzimatik sindirim ve atriyal dokuların mekanik dağılımının bir kombinasyonunu kullanır. Burada atriyal uzantı dokusu kullanarak yaklaşımımızı tarif ederken, bu yaklaşım, dedektifin seçtiği atriyal miyokard (yani sağ veya sol atriyal eklentileri, serbest duvarlar, arka duvarlar) herhangi bir bölgede kullanılabilir. Bu yaklaşım, genetiği değiştirilmiş fareler atriyal miyoksit elektrofizyolojisi çalışmaları için idealdir, kardiyovasküler hastalığın fare modellerinde, veya farmakolojik bileşiklerin etkilerini incelemek için5,6,17 , 18 , 19 yaşında.
Laboratuvarımız, farklı kardiyovasküler hastalıklar, genetik mutasyonlar veya farmakolojik bileşiklerin atriyal miyosit üzerindeki etkilerini incelemek amacıyla, fare atriyal miyositlerini yama kelepçe deneylerinde kullanılmak üzere izole etmek için bu protokolü düzenli olarak kullanır Elektrofizyoloji. Son derece tekrarlanabilir olsa da, izole atriyal miyositlerden elde edilen verilerin kalitesi yalıtım kalitesine bağlıdır. Buna ek olarak, atriyal miyosit izolasyonunun ardından kalsiyum yeniden giriş kalsiyum paradoks16nedeniyle izole miyositlerin bir nüfus için hücre ölümü neden olacaktır. Buna göre, bu yaklaşımı kullanarak uygun, yüksek kaliteli atriyal miyositlerin yalıtılması, yalıtım boyunca birden fazla noktaya uygulama ve optimizasyon gerektirir. Bir kez optimize edilmiş, bu yaklaşım kullanılarak izole toplam atriyal miyositlerin% 70-90 arasında hem kalsiyum toleranslı ve çubuk şeklinde olacaktır tahmin edilmektedir. En iyi uygulama ve optimizasyon gerektiren adımlar aşağıda açıklanmıştır.
Diseksiyon hızı ve verimliliği izole hücrelerin kalitesi üzerinde aşağı etkileri olacaktır. Tüm kanın atriyal dokudan çıkarıldığından ve doku şeritlerinin benzer bir boyuta kesildiğinden emin olmak için zaman almak önemlidir. Atriyal uzantının kaldırılması, dokuyu şeritler halinde kesmek ve doku şeritleri değiştirilmiş Tyrode pH 6,9 çözeltisi ilk tüp içine aktarmak için yaklaşık 5 dakika sürer. Ancak, bu adım çok uzun sürerse, doku kalitesi tehlikeye olabilir.
Aynı zamanda doku şeritler bir yalıtım içinde ve kalpler arasında tek boyutlu bir boyutta kesilir önemlidir. Doku şeritler çok büyük veya çok küçük ise, ya da bir izolasyon içinde üniforma değilse, bu enzimatik sindirim ve trituration sırasında sorunlara neden olabilir. Küçük şeritler daha iyice sindirilmiş olacak ve büyük şeritler sindirilmiş altında olacak çünkü bu. Atriyal uzantının büyüklüğü hayvanlar arasında farklılık gösterebileceğinden, genotip ve hastalık ayarının incelenmesini dikkate almak aynı derecede önemlidir. Örneğin, hipertrofik kalpleri sağlıklı kalpleri ile karşılaştırıldığında daha büyük atriyal eklentileri vardır, ve bu nedenle deney normal boyutta kalpleri ile karşılaştırıldığında hipertrofik kalpleri daha şeritler kesebilir. Buna göre, kesme dokusu şeritleri boyutunu optimize etmek ve her bir atriyal uzantının bu boyutlarını uygulamak, deneysel koşullar arasındaki miyoksit izolasyonlarının yeniden üretilebilirliği büyük ölçüde artıracaktır.
Enzimatik sindirim ve mekanik dissociasyon arasındaki hassas denge, bu protokol kullanılarak başarılı bir atriyal miyosit izolasyonunun anahtarıdır. Eğer doku yeterli enzimatik sindirim sırasında swirled değilse bireysel doku şeritler küp eğiliminde ve birlikte sopa, hangi enzimatik sindirim etkinliğini sınırlayacaktır. Çok sık veya şiddetle tedirgin iseniz, bu atriyal dokuya zarar verebilir, bu da uygun olmayan hücrelerin izolasyonuna neden olur. Triturasyon sırasında izole atriyal miyositlerin doku şeritlerinin mekanik olarak dağılması, atriyal miyositleri izole etmek için bu yaklaşımı kullanarak uygulama ve optimize etmek için en önemli adımdır. Eğer toz çok nazik ise, hücre verimi düşük olacaktır. Öte yandan, eğer toz çok sert ise, o zaman uygun olmayan miyositlerin bir bolluk izole edilecektir, ve yama-kelepçe deneyleri sırasında elde edilen veri kalitesi tehlikeye olacak. Ayrıca, Atria bileşimi yalıtımı etkileyebilir. Örneğin, doku fibrotik ise, enzimatik sindirim ve triturasyon adımlarının değiştirilmesi gerekebilir. Bu nedenle, yama-kelepçe deneyleri için kullanılabilecek triturasyon sırasında yüksek kaliteli hücreler elde etmek için gereken becerileri geliştirmek için zaman almak önemlidir.
Tüm deneysel tekniklerde olduğu gibi sınırlamalar vardır. Bu teknik, bu miyositler kullanılarak gerçekleştirilecek herhangi bir deneylerin fizibilitesini etkileyebilecek, uygun, yüksek kaliteli miyositlerin yeniden üretilmesini sağlamak için pratik gerektirir. Bu yaklaşım aynı zamanda Terminal ve bu yaklaşım kullanılarak izole atriyal miyositler sadece yalıtım gününde kullanılabilir. Laboratuvarımız hücreleri 6-7 içinde kullanır.
Atriyal kardiyomiyositlerin izolasyon yaklaşımı çeşitli uygulamalara sahiptir. Örneğin, bu yaklaşım, insan atriyal doku biyopsisi de dahil olmak üzere diğer türlerinden atriyal miyositler (hem de kardiyak fibroblastlar) izole etmek için değiştirilebilir. Buna ek olarak, atriyal miyoksit yalıtımı için bu öbek yöntemini kullanmanın bir yararı (kalbin retrograd perfüzyonunun aksine), kardiyomiyositlerin Sinoatriyal düğüm veya diğer belirli bölgeler gibi kalbin diğer bölgelerinden izole edilmesi için değiştirilebilen bir yöntemdir. ya da kalbin tüm supraventriküler bölgesini kapsar. Laboratuvarımız, eylem potansiyelleri ve iyonik akımları ölçmek için yama kelepçe deneyleri için atriyal kardiyomiyositler kullanır, ancak bu yaklaşım bu teknikle sınırlı olmamalıdır. Örneğin, izole miyositler çeşitli deneysel ayarlarında kalsiyum geçişler ve kontrazlık değişiklikleri araştırmak için kullanılabilir. Atriyal kardiyomiyositler Ayrıca immünofluoresesans çalışmalarda proteinlerin veya ilgi yapılarının yerini incelemek için de kullanılabilir. Buna göre, bu yaklaşım birçok olası uygulamalar ile çok yönlü.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (MOP 93718, 142486) ve Kanada kalp ve Inme Vakfı ‘ndan R.A. gül ‘e kadar çalışan hibe tarafından desteklenmektedir. HG Jansen, Killam doktora sonrası bursu sahibidir.
1, 2-Bis(2-Aminophenoxy)ethane-N, N, N', N'-tetraacetic acid 98% | Sigma | A4926-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra, > 99%, from microbial | Sigma | A7699-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt > 95%, bacterial | Sigma | A9187-1G | |
Amphocetericin B from Streptomyces sp. ~80% (HPLC), powder | Sigma | A4888-500 MG | |
Bovine serum albumin | Sigma | A3059-50G | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
Cesium chloride ReagentPlus, 99.9% | Sigma | 289329-100G | |
Cesium hydroxide monohydrate > 99.5% trace metals basis | Sigma | 562505-1KG | |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
Creatine anhydrous | Sigma | C0780 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
DL-Aspartic acid potassium salt | Sigma | A2025-100G | |
Elastase suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS002279 | |
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid >97.0% | Sigma | E4378-25G | |
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate > 95% (HPLC), powder | Sigma | G8877-250MG | |
Heparin 10 000 USP units/10mL | SANDOZ | 10750 | |
HEPES > 99.5% (titration) | Sigma | H3375-500G | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate > 99% (HPLC), powder | Sigma | G1501-500G | |
Magnesium sulfate | Sigma | M2643-500G | |
Nifedipine > 98% (HPLC), powder | Sigma | N7634-1G | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate enzymatic, approx 98% | Sigma | P7936-5G | |
Potassium chloride ACS reagent, 99.0-100.5% | Sigma | P3911-500G | |
Potassium hydroxide | EM Science | PX1480-1 | |
Potassium phosphate monobasic | EMD | PX1565-1 | |
Protease from Streptomyces griseus, type XIV, >3.5 units/mg solid, powder | Sigma | P5147-1G | |
Sodium chloride ACS reagent, > 99.0% | Sigma | S9888-2.5KG | |
Sodium hydroxide, pellets, 97+%, A.C.S. reagent | Sigma | 221465-500G | |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments Inc | SYLG184 | |
Taurine | Sigma | T0625-100G | |
Tetraethylammonium chloride > 98% (titration) | Sigma | T2265-100G |