该协议用于使用块消化方法从成年小鼠心脏分离单个心房心肌细胞。这种方法用于分离右心房或左心房肌细胞,可用于在贴片夹研究中描述心房肌细胞电生理学。
心房肌细胞的电生理特性对心脏整体功能有重要影响。负责作用电位的基础离子电流的改变可能导致心律失常的亲心律失常基板,如心房颤动,在许多条件和疾病状态中非常普遍。分离成年小鼠心房心肌细胞用于贴片夹实验,极大地促进了我们对健康心房心肌和心房病理生理学设置中细胞电生理学的知识和理解。此外,使用基因小鼠模型的研究已经阐明了大量蛋白质在调节心房电生理学中的作用。在这里,我们提供了一个详细的方案,从成年小鼠的心房附属物分离心肌细胞,使用酶消化和这些组织的机械分离的组合。这种方法一致可靠地产生孤立的心房心肌细胞,然后可用于在贴片夹实验中测量作用电位和离子电流,从而在一些实验条件下测量细胞电生理学特征条件。
atria 是心脏的薄壁低压室,接收来自上等和劣质静脉的血液以及肺静脉,是正常心脏生理学中不可或缺的一部分。与心脏的其他区域一样,心房包含许多细胞类型,包括心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞等。心房肌细胞是电兴奋细胞,在通过心脏传导电信号中起着至关重要的作用,从而确保每个心跳1时适当的心房收缩。耳动功能障碍可导致一些心房特异性心律失常,如心房颤动和心房颤动2,3。这些是高度普遍,但缺乏了解,心房心律失常,导致严重的发病率和死亡率。心房颤动可与基因突变有关,与衰老有关,或与后天形式的心脏病有关,包括高血压、心力衰竭和糖尿病2、4、5 ,6.这些条件可以改变心房肌细胞的电特性,可以创建一个基质,增加心律失常1,2的患病率。
耳膜的正常电功能,以及心房心律失常,受心房肌细胞中产生的行动电位(AP)形态的影响。心房AP产生于许多离子电流的活性,包括钠电流(I Na,由NaV1.5通道携带)、L型钙电流(ICa,L,由Cav1.2和CaV1.3通道携带)),和几个钾电流,包括超快延迟整流器钾电流(I Kur,由KV1.5通道携带),瞬态向外钾电流(I到,由 KV4.2 和 KV4.3 携带通道),稳定状态钾电流(IKss,由KV2.1通道携带),和向内整流器钾电流(IK1,由Kir2.1通道携带)1,7, 8.虽然它们在小鼠atria中不起主要作用,但延迟整流器K+电流(IKr和I K)的快速和缓慢成分也有助于某些物种7的AP重极化。一个或多个离子电流的改变可以显著改变心房肌细胞的电特性,这可能导致心房心律失常。例如,INa的减少可以通过降低 AP 上冲程速度来降低整个 Atria 的传导速度。另一方面,减少重极化钾电流或增加ICa,L或后期INa可能导致后脱极化的发展,可以触发在atria1的自发活动, 2,9.
重要的是要认识到,在心房心肌的不同部分,AP形态存在差异,这可能是由于这些基础的子通道的表达或调节的差异。例如,在 AP 持续时间上,左右 atria 之间的差异与 I与当前密度的差异有关,已经很好地描述了 10、11、12、13 。此外,我们最近亦证明,患有慢性高血压的小鼠的左右电重塑模式不同。右心房后壁还包含中心节点,它有自己独特的AP形态和点火模式15。可以使用每个区域的分离肌细胞详细研究肌细胞在癫痫症的每个不同部位的不同性质。
有不同的方法,可以用来分离心房肌细胞为贴片夹电生理学研究16。一种可能性是使用逆行灌注方法,心脏通过主塔进行酶的输送。虽然这是一种可行的方法,但由于心房灌注的不一致,它可以在心房肌细胞质量中产生变异性。我们采用了一种”块状”消化方法,用于分离心房肌细胞,无需逆行灌注心脏。我们的方法结合了酶消化和心房组织的机械分离,持续可靠地产生大量适合贴片夹研究的分离心房肌细胞。当我们使用心房附属组织描述我们的方法时,该方法可用于心房心肌的任何区域(即,右心房或左心房附属物、自由墙、后壁),由调查员选择。这种方法是理想的研究心房肌细胞电生理学在转基因小鼠,在小鼠模型心血管疾病,或研究药理化合物5,6,17的影响,18,19.
我们的实验室通常使用该协议分离小鼠心房肌细胞,用于贴片-夹子实验,以调查不同形式的心血管疾病、基因突变或药理化合物对心房肌细胞的影响电 生理。尽管高度可重复,但从隔离心房肌细胞获得的数据的质量取决于隔离的质量。此外,在心房肌细胞分离后重新引入钙将导致由于钙悖论16而分离的肌细胞人群的细胞死亡。因此,使用这种方法隔离可行、高质量的心房肌细胞需要在整个隔离过程中在多个点上进行练习和优化。一旦优化,估计使用这种方法分离的总心房肌细胞的70-90%将同时具有耐钙性和棒状。下面将讨论需要最实际练习和优化的步骤。
解剖的速度和效率将对分离细胞的质量产生下游影响。请务必花时间确保所有血液从心房组织中取出,并且组织条被切割到类似大小。它需要大约5分钟来取出心房附属品,将组织切成条状,并将组织条转移到改性Tyrode的pH 6.9溶液的第一管中。但是,如果此步骤时间过长,组织的质量可能会受到损害。
同样重要的是,组织条在隔离和心脏之间被切成均匀的大小。如果组织条太大或太小,或者如果它们在隔离中不均匀,这可能会导致酶消化和三聚体过程中的问题。这是因为小条条将更彻底地消化,大条条将被消化。同样重要的是,要考虑正在研究的基因型和疾病设置,因为心房附属件的大小可能因动物而异。例如,肥大心脏与健康心脏相比,心房附属物更大,因此实验者可以比正常大小的心脏在肥大心脏中切割更多的条。因此,优化切割组织条的大小并将这些尺寸应用于每个心房附属体,将大大提高实验条件之间肌细胞分离的可重复性。
酶消化和机械解散之间的微妙平衡是使用该协议成功分离心房肌细胞的关键。如果在酶消化过程中组织没有充分旋转,单个组织条将倾向于聚集并粘在一起,这将限制酶消化的有效性。如果激动过于频繁或剧烈,这会损害心房组织,这将导致分离不存活的细胞。在三聚过程中,从组织条中分离的分离心房肌细胞的机械分离是使用这种方法分离心房肌细胞的最关键的步骤。如果三角素太温和,细胞产量将较低。另一方面,如果三聚太苛刻,就会分离出大量无法存活的肌细胞,在贴片夹实验中获得的数据质量将受到损害。此外,atria 的组成会影响隔离。例如,如果组织是纤维化的,酶消化和三聚体步骤可能需要修改。因此,在三聚体过程中,花时间发展获得高质量细胞所需的技能非常重要,这些细胞可用于贴片夹实验。
与所有实验技术一样,也有局限性。这项技术需要实践才能重新分离出可行的高质量肌细胞,这反过来又会影响使用这些肌细胞进行的任何实验的可行性。这种方法也是终端和心房肌细胞隔离使用这种方法只能使用当天隔离。我们的实验室在隔离6-7小时内使用细胞。
这种隔离心房心肌细胞的方法有多种应用。例如,可以修改这种方法,以分离心房肌细胞(以及心脏成纤维细胞)与其他物种,包括人类心房组织活检。此外,使用这种块法分离心房肌细胞(与心脏逆行灌注相反)的好处是,它可以被修改,以分离心肌细胞从心脏的其他区域,如中阴度节点或其他特定区域心房心肌,或包括心脏的整个心室区域。我们的实验室使用心房心肌细胞进行贴片夹实验,以测量作用电位和离子电流,尽管这种方法不必局限于此技术。例如,分离的肌细胞可用于研究各种实验环境中钙瞬变和收缩性的改变。心膜心肌细胞也可用于免疫荧光研究,以研究感兴趣的蛋白质或结构的位置。因此,这种方法对于许多可能的应用都是高度通用的。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到加拿大卫生研究院(MOP 93718, 142486)和加拿大心脏和中风基金会对R.A.Rose的运营资助。 H.J.詹森是基拉姆博士后奖学金的获得者。
1, 2-Bis(2-Aminophenoxy)ethane-N, N, N', N'-tetraacetic acid 98% | Sigma | A4926-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra, > 99%, from microbial | Sigma | A7699-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt > 95%, bacterial | Sigma | A9187-1G | |
Amphocetericin B from Streptomyces sp. ~80% (HPLC), powder | Sigma | A4888-500 MG | |
Bovine serum albumin | Sigma | A3059-50G | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
Cesium chloride ReagentPlus, 99.9% | Sigma | 289329-100G | |
Cesium hydroxide monohydrate > 99.5% trace metals basis | Sigma | 562505-1KG | |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
Creatine anhydrous | Sigma | C0780 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
DL-Aspartic acid potassium salt | Sigma | A2025-100G | |
Elastase suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS002279 | |
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid >97.0% | Sigma | E4378-25G | |
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate > 95% (HPLC), powder | Sigma | G8877-250MG | |
Heparin 10 000 USP units/10mL | SANDOZ | 10750 | |
HEPES > 99.5% (titration) | Sigma | H3375-500G | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate > 99% (HPLC), powder | Sigma | G1501-500G | |
Magnesium sulfate | Sigma | M2643-500G | |
Nifedipine > 98% (HPLC), powder | Sigma | N7634-1G | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate enzymatic, approx 98% | Sigma | P7936-5G | |
Potassium chloride ACS reagent, 99.0-100.5% | Sigma | P3911-500G | |
Potassium hydroxide | EM Science | PX1480-1 | |
Potassium phosphate monobasic | EMD | PX1565-1 | |
Protease from Streptomyces griseus, type XIV, >3.5 units/mg solid, powder | Sigma | P5147-1G | |
Sodium chloride ACS reagent, > 99.0% | Sigma | S9888-2.5KG | |
Sodium hydroxide, pellets, 97+%, A.C.S. reagent | Sigma | 221465-500G | |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments Inc | SYLG184 | |
Taurine | Sigma | T0625-100G | |
Tetraethylammonium chloride > 98% (titration) | Sigma | T2265-100G |