Denne protokollen brukes til å isolere enkelt atrieflimmer cardiomyocytes fra den voksne musen hjertet ved hjelp av en blings fordøyelsen tilnærming. Denne tilnærmingen brukes til å isolere høyre eller venstre atrieflimmer myocytter som kan brukes til å karakterisere atrieflimmer myocyte elektrofysiologi i patch-Clamp studier.
Den elektrofysiologisk egenskaper av atrieflimmer myocytter viktigere påvirke generelle hjertefunksjon. Endringer i de underliggende joniske strømmene som er ansvarlige for handlings potensialet kan forårsake arrhythmic underlag som ligger til grunn arytmi, slik som atrieflimmer, som er svært utbredt i mange tilstander og sykdomstilstander. Isolere voksen mus atrieflimmer cardiomyocytes for bruk i patch-Clamp eksperimenter har i stor grad avansert vår kunnskap og forståelse av mobilnettet elektrofysiologi i sunn atrieflimmer myokard og i innstillingen av atrieflimmer patofysiologi. I tillegg har studier med genetiske musemodeller belyst rollen som et stort utvalg av proteiner i regulering av atrieflimmer elektrofysiologi. Her gir vi en detaljert protokoll for isolering av cardiomyocytes fra atrieflimmer vedheng av voksne mus ved hjelp av en kombinasjon av enzymatisk fordøyelse og mekaniske dissosiasjon av disse vev. Denne tilnærmingen konsekvent og pålitelig gir isolerte atrieflimmer cardiomyocytes som deretter kan brukes til å karakterisere cellulære elektrofysiologi ved å måle handlings potensialer og ioniske strømninger i patch-klemme eksperimenter under en rekke eksperimentelle Forhold.
Atria, som er de tynne vegger, lavt trykk kamre av hjertet som mottar blod fra den overlegne og underlegne vena cavae samt lunge årer, er integrert i normal hjerte fysiologi. Som andre regioner av hjertet, inneholder Atria en rekke celletyper, inkludert cardiomyocytes, fibroblaster, endothelial celler, vaskulære glatte muskelceller, og andre. Atrieflimmer myocytter er elektrisk nervøs celler som spiller en viktig rolle i ledning av elektriske signaler gjennom hjertet, og dermed sikre riktig atrieflimmer under hvert hjerteslag1. Elektrisk dysfunksjon i Atria kan føre til en rekke atrieflimmer, som atrieflimmer og atrieflimmer2,3. Disse er svært utbredt, men dårlig forstått, atrieflimmer som fører til betydelig sykelighet og dødelighet. Atrieflimmer kan forekomme i forbindelse med genetiske mutasjoner, i samarbeid med aldring eller i innstillingen av ervervet former for hjertesykdom, inkludert hypertensjon, hjertesvikt og diabetes2,4,5 ,6. Disse forholdene kan endre de elektriske egenskapene til atrieflimmer myocytter som kan skape et substrat som øker utbredelsen av arrhythmogenesis1,2.
Normal elektrisk funksjon i Atria, så vel som atrieflimmer, er viktigst påvirket av morfologi av handlingen potensial (AP) produsert i atrieflimmer myocytter. arrhythmogenesis Den atrieflimmer AP er generert fra aktiviteten til en rekke ioniske strømninger, inkludert natrium strøm (jegna, båret av NaV1,5 kanaler), l-type kalsium strøm (ica, L, båret av Cav1,2 og cav1,3 kanaler ), og flere kalium strømmer inkludert ultra-rask forsinket likeretter kalium strøm (jegkur, båret av KV1,5 kanaler), forbigående utover kalium strøm (jegtil, båret av kv4,2 og kv4,3 kanaler), en stabil tilstand kalium strøm (jegKSS, båret av KV2,1 kanaler), og innover likeretter kalium strøm (IK1, båret av KIR2,1 kanaler)1,7, 8i den. Selv om de ikke spiller en stor rolle i musen Atria, den raske og langsomme komponenter av den forsinkede likeretter K+ strøm (jegkr og jegKS) også bidra til Ap repolarisasjon i enkelte arter7. Endringer i en eller flere av disse ioniske strømmene kan i betydelig grad endre de elektriske egenskapene til atrieflimmer, noe som kan føre til myocytter arytmi. For eksempel, en reduksjon i ina kan langsom Lednings hastighet over Atria ved å redusere Ap oppstrekningen hastighet. På den annen side, en reduksjon i repolarizing kalium strømmer eller en økning i enten jegca, L eller sent jegna kan føre til utvikling av afterdepolarizations som kan utløse spontan aktivitet i Atria1, 2,9.
Det er viktig å erkjenne at det er forskjeller i AP morfologi i ulike deler av atrieflimmer myokard som sannsynligvis skyldes forskjeller i uttrykk eller regulering av disse underliggende ion kanaler. For eksempel er forskjeller i Ap varighet mellom høyre og venstre Atria i forbindelse med forskjeller i nåværende tetthet er godt beskrevet10,11,12,13. Også har vi nylig demonstrert at det er forskjellige mønstre av elektrisk remodeling i høyre og venstre Atria av mus med kronisk hypertensjon6,14. Retten atrieflimmer bakre vegg inneholder også sinoatriell noden, som har sin egen distinkte mønstre av AP morfologi og avfyring mønstre15. De distinkte egenskapene til myocytter i hver av disse ulike delene av Atria kan undersøkes i detalj ved hjelp av isolerte myocytter fra hver av disse regionene.
Det finnes ulike tilnærminger som kan brukes til å isolere atrieflimmer myocytter for patch-klemme elektrofysiologi studier16. En mulighet er å bruke en retrograd-tilnærming hvor hjertet kanylert via aorta for levering av enzymer. Selv om dette er en levedyktig tilnærming, kan det produsere variasjon i atrieflimmer myocyte kvalitet på grunn av inkonsekvenser i produksjon av Atria. Vi har vedtatt en “blings” fordøyelse tilnærming for isolering av atrieflimmer myocytter som eliminerer behovet for retrograd av hjertet. Vår tilnærming bruker en kombinasjon av enzymatisk fordøyelse og mekanisk dissosiasjon av atrieflimmer som konsekvent og pålitelig gir et stort antall isolerte atrieflimmer myocytter som er egnet for patch-klemme studier. Mens vi beskriver vår tilnærming her ved hjelp av atrieflimmer vedheng vev, kan tilnærmingen brukes på en hvilken som helst region av atrieflimmer myokard (dvs. høyre eller venstre atrieflimmer vedheng, gratis vegger, bakre vegger) som etterforsker velger. Denne tilnærmingen er ideell for studier av atrieflimmer myocyte elektrofysiologi i genmodifiserte mus, i musemodeller av hjerte-og karsykdommer, eller for å studere virkningene av farmakologiske forbindelser5,6,17 , 18 av år , 19i denne.
Vår Lab rutinemessig bruker denne protokollen til å isolere musen atrieflimmer myocytter for bruk i patch-Clamp eksperimenter for å undersøke virkningene av ulike former for hjerte-og karsykdommer, genetiske mutasjoner, eller farmakologiske forbindelser på atrieflimmer myocyte elektrofysiologi. Selv om det er svært reproduserbar, avhenger kvaliteten av dataene fra den isolerte atrieflimmer myocytter av kvaliteten på isolasjonen. I tillegg vil gjeninnføringen av kalsium etter atrieflimmer myocyte isolasjon føre til celle død for en befolkning på isolerte myocytter på grunn av kalsium paradokset16. Følgelig, isolere levedyktig, høy kvalitet atrieflimmer myocytter ved hjelp av denne tilnærmingen krever praksis og optimalisering på flere punkter i hele isolasjonen. Når optimalisert, er det anslått at mellom 70-90% av den totale atrieflimmer myocytter isolert ved hjelp av denne tilnærmingen vil være både kalsium tolerant og stang formet. Trinnene som krever mest praksis og optimalisering er diskutert nedenfor.
Hastigheten og effektiviteten av disseksjon vil ha nedstrøms effekter på kvaliteten på de isolerte cellene. Det er viktig å ta tid å sikre at alle blod er fjernet fra atrieflimmer og at vev strimler er kuttet til en tilsvarende størrelse. Det bør ta ca 5 min å fjerne atrieflimmer vedheng, kutt vevet i strimler, og overføre vevet strimler inn i det første røret av modifisert Tyrode ‘ s pH 6,9 løsning. Men hvis dette trinnet tar for lang, kan kvaliteten på vevet bli kompromittert.
Det er også viktig at vev strimler er skåret til en enhetlig størrelse innenfor en isolasjon og mellom hjerter. Hvis vevs strimler er for store eller for små, eller hvis de ikke er ensartet innenfor en isolasjon, kan dette føre til problemer under både enzymatisk fordøyelse og trituration. Dette er fordi små strimler vil bli mer grundig fordøyd og store strimler vil være under fordøyd. Det er like viktig å vurdere genotype og sykdoms innstillingen blir studert som størrelsen på atrieflimmer vedheng kan variere mellom dyr. For eksempel, hypertrofisk hjerter har større atrieflimmer vedheng sammenlignet med sunne hjerter, og derfor eksperimentator kan kutte flere strimler i hypertrofisk hjerter i forhold til normal størrelse hjerter. Følgelig vil optimering av størrelsen på vevs strimlene og bruk av disse dimensjonene på hver enkelt atrieflimmer vedheng i stor grad forbedre reproduserbarheten av myocyte isolasjoner mellom eksperimentelle forhold.
Den delikate balansen mellom enzymatisk fordøyelse og mekanisk dissosiasjon er nøkkelen til en vellykket atrieflimmer myocyte isolering ved hjelp av denne protokollen. Hvis vevet ikke er tilstrekkelig virvlet under enzymatisk fordøyelsen de enkelte vev strimler vil tendens til å klump og holde sammen, noe som vil begrense effektiviteten av enzymatisk fordøyelsen. Hvis opprørt for ofte eller kraftig, kan dette skade atrieflimmer, noe som vil resultere i isolering av uholdbare celler. Mekanisk dissosiasjon av isolerte myocytter fra vevs strimler under trituration er det mest kritiske steget for å øve og optimalisere bruken av denne tilnærmingen for å isolere atrieflimmer myocytter. Hvis trituration er for skånsom, vil celle utbyttet være lav. På den annen side, hvis trituration er for harde, så en overflod av ikke-levedyktig myocytter vil bli isolert, og kvaliteten på data innhentet under patch-Clamp eksperimenter vil bli jeopardized. I tillegg kan sammensetningen av Atria påvirke isolasjonen. For eksempel, hvis vev er antifibrotiske, enzymatisk fordøyelsen og de trituration trinnene må kanskje endres. Det er derfor viktig å ta seg tid til å utvikle de ferdighetene som kreves for å oppnå høy kvalitet celler under trituration som kan brukes til patch-klemme eksperimenter.
Som med alle eksperimentelle teknikker er det begrensninger. Denne teknikken krever praksis for å reproduserbar isolere levedyktig, høy kvalitet myocytter, som igjen vil påvirke muligheten for eksperimenter som skal utføres ved hjelp av disse myocytter. Denne tilnærmingen er også terminal og atrieflimmer myocytter isolert ved hjelp av denne tilnærmingen kan brukes på dagen av isolasjonen bare. Vår Lab bruker cellene innen 6-7 h av isolasjon.
Denne tilnærmingen av å isolere atrieflimmer cardiomyocytes har flere programmer. For eksempel, denne tilnærmingen kan endres for å isolere atrieflimmer myocytter (så vel som CARDIAC fibroblaster) fra andre arter, inkludert humant atrieflimmer vev biopsier. I tillegg er en fordel å bruke denne blings metode for atrieflimmer myocyte isolasjon (i motsetning til retrograd av hjertet) er at det kan endres for å isolere cardiomyocytes fra andre områder av hjertet, for eksempel sinoatriell node eller andre bestemte regioner av atrieflimmer myokard, eller omfatte hele supraventrikulær regionen i hjertet. Vår Lab bruker atrieflimmer cardiomyocytes for patch-Clamp eksperimenter for å måle handlings potensialer og ioniske strømninger, selv om denne tilnærmingen ikke trenger være begrenset til denne teknikken. Isolerte myocytter kan for eksempel brukes til å undersøke endringer i kalsium-transienter og contractility i en rekke eksperimentelle innstillinger. Atrieflimmer cardiomyocytes kan også brukes i immunofluorescence studier for å studere plasseringen av proteiner eller strukturer av interesse. Følgelig er denne tilnærmingen svært allsidig med mange mulige bruksområder.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er støttet av operasjonelle tilskudd fra Canadian Institutes of Health Research (MOP 93718, 142486) og hjertet og Stroke Foundation of Canada til R.A. Rose. H.J. Jansen er mottaker av en Killam postdoktor Fellowship.
1, 2-Bis(2-Aminophenoxy)ethane-N, N, N', N'-tetraacetic acid 98% | Sigma | A4926-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra, > 99%, from microbial | Sigma | A7699-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt > 95%, bacterial | Sigma | A9187-1G | |
Amphocetericin B from Streptomyces sp. ~80% (HPLC), powder | Sigma | A4888-500 MG | |
Bovine serum albumin | Sigma | A3059-50G | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
Cesium chloride ReagentPlus, 99.9% | Sigma | 289329-100G | |
Cesium hydroxide monohydrate > 99.5% trace metals basis | Sigma | 562505-1KG | |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
Creatine anhydrous | Sigma | C0780 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
DL-Aspartic acid potassium salt | Sigma | A2025-100G | |
Elastase suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS002279 | |
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid >97.0% | Sigma | E4378-25G | |
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate > 95% (HPLC), powder | Sigma | G8877-250MG | |
Heparin 10 000 USP units/10mL | SANDOZ | 10750 | |
HEPES > 99.5% (titration) | Sigma | H3375-500G | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate > 99% (HPLC), powder | Sigma | G1501-500G | |
Magnesium sulfate | Sigma | M2643-500G | |
Nifedipine > 98% (HPLC), powder | Sigma | N7634-1G | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate enzymatic, approx 98% | Sigma | P7936-5G | |
Potassium chloride ACS reagent, 99.0-100.5% | Sigma | P3911-500G | |
Potassium hydroxide | EM Science | PX1480-1 | |
Potassium phosphate monobasic | EMD | PX1565-1 | |
Protease from Streptomyces griseus, type XIV, >3.5 units/mg solid, powder | Sigma | P5147-1G | |
Sodium chloride ACS reagent, > 99.0% | Sigma | S9888-2.5KG | |
Sodium hydroxide, pellets, 97+%, A.C.S. reagent | Sigma | 221465-500G | |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments Inc | SYLG184 | |
Taurine | Sigma | T0625-100G | |
Tetraethylammonium chloride > 98% (titration) | Sigma | T2265-100G |