Этот протокол используется для изоляции одного предсердного кардиомиоцитов от сердца взрослой мыши, используя подход к пищеварению. Этот подход используется для изоляции правых или левых миоцитов предсердий, которые могут быть использованы для характеристики тричной миоцитной электрофизиологии в исследованиях патч-зажима.
Электрофизиологические свойства предсердий миоцитов важно влияют на общую сердечную функцию. Изменения в основных ионных токов, ответственных за действие потенциал может вызвать про-аритмических субстратов, которые лежат в основе аритмии, таких как мерцательная аритмия, которые широко распространены во многих условиях и состояниях болезни. Изолировать взрослых мышей предсердий кардиомиоцитов для использования в патч-зажим экспериментов значительно продвинули наши знания и понимание клеточной электрофизиологии в здоровом предсердии миокарда и в условиях патофизиологии предсердий. Кроме того, исследования с использованием генетических моделей мыши прояснили роль широкого спектра белков в регулировании электрофизиологии предсердий. Здесь мы предоставляем подробный протокол для изоляции кардиомиоцитов от предсердных придатков взрослых мышей с использованием комбинации ферментативного пищеварения и механической диссоциации этих тканей. Этот подход последовательно и надежно дает изолированные предсердий кардиомиоцитов, которые затем могут быть использованы для характеристики клеточной электрофизиологии путем измерения потенциалов действия и ионных токов в патч-зажим экспериментов в рамках ряда экспериментальных Условия.
Предсердий, которые являются тонкими стенками, камеры низкого давления сердца, которые получают кровь из вышестоящей и нижней полы вены, а также легочных вен, являются неотъемлемой частью нормальной сердечной физиологии. Как и другие области сердца, атрия содержит ряд типов клеток, втомленые кардиомиоциты, фибробласты, эндотелиальные клетки, сосудистые гладкие мышечные клетки и другие. Предсердий миоциты электрически возбудимых клеток, которые играют важную роль в проведении электрических сигналов через сердце, тем самым обеспечивая надлежащее сокращение предсердий во время каждого удара сердца1. Электрическая дисфункция в предсердии может привести к ряду предсердий конкретных аритмий, таких как трепетание предсердий и мерцательной аритмии2,3. Это весьма распространенные, но плохо понимаемые, аритмии предсердий, которые приводят к значительной заболеваемости и смертности. Фибрилляция предсердий может происходить в связи с генетическими мутациями, в связи со старением или в условиях приобретенных форм сердечных заболеваний, включая гипертонию, сердечную недостаточность и диабет2,4,5 ,6. Эти условия могут изменить электрические свойства предсердий миоцитов, которые могут создать субстрат, который увеличивает распространенность аритмогенеза1,2.
Нормальная электрическая функция в предсердии, а также аритмогенез предсердий, важно зависит от морфологии действия потенциал (AP), вырабатываемых в предсердий миоцитов. Предсердий AP генерируется из деятельности ряда ионных токов, в том числе тока натрия (INa, осуществляется NaV1.5 каналов), L-типа кальция тока (ICa, L, осуществляется Cav1.2 и CaV1.3 каналов ), и несколько калийных токов, включая ультра-быстрый задержкой выправляющий калийный ток (IKur, осуществляется KV1.5 каналов), переходный внешний калийный ток (Iк, осуществляется KV4.2 и KV4.3 каналы), устойчивое состояние калия тока (IKss, осуществляется KV2.1 каналов), и внутренний выправлятель калия тока (IK1, осуществляется Kir2.1 каналов)1,7, 8. Хотя они не играют важную роль в мышке atria, быстрые и медленные компоненты задержки выправляющего Ки тока (IKr и IKs) также способствуют AP repolarization в некоторых видах7. Изменения в одном или нескольких из этих ионных токов могут значительно изменить электрические свойства предсердий миоцитов, что может привести к аритмии предсердий. Например, снижение INa может замедлить скорость проводимости через предию за счет снижения скорости АП вверх по мазку. С другой стороны, сокращение повторного поляризации калийных токов или увеличение либо ICa,L или поздно INa может привести к развитию afterdepolarizations, которые могут вызвать спонтанную активность в тририи1, 2,9.
Важно признать, что существуют различия в морфологии АП в различных частях предсердной миокарда, которые, вероятно, из-за различий в выражении или регулировании этих основных ионных каналов. Например, различия в продолжительности AP между правым и левым предстоятельным в связи с различиями в Iк текущей плотности были хорошо описаны10,11,12,13. Кроме того, мы недавно показали, что Существуют различные модели электрической реконструкции в правом и левом предшествующего мышей с хронической гипертензией6,14. Правая задняя стена предсердий также содержит синоатриальный узло, который имеет свои собственные различные модели морфологии AP и моделей стрельбы15. Различные свойства миоцитов в каждой из этих различных частей атрии могут быть подробно исследованы с помощью изолированных миоцитов из каждого из этих регионов.
Существуют различные подходы, которые могут быть использованы для изоляции предсердий миоцитов для патч-зажим электрофизиологии исследований16. Одна из возможностей заключается в использовании ретроградного перфузионного подхода, где сердце канисируется через аорту для доставки ферментов. Хотя это жизнеспособный подход, он может производить изменчивость в качестве миоцитов предсердий из-за несоответствий в перфузии предсердий. Мы приняли “кусок” пищеварения подход для изоляции предсердий миоцитов, что устраняет необходимость ретроградной перфузии сердца. Наш подход использует сочетание ферментативного пищеварения и механической диссоциации предсердной ткани, которая последовательно и надежно дает большое количество изолированных предсердных миоцитов, которые подходят для исследования патч-зажима. Хотя мы описываем наш подход здесь с помощью ткани предсердного придатка, подход может быть использован в любой области предсердий миокарда (т.е., правые или левые предсердий придатки, свободные стены, задние стены), что следователь выбирает. Этот подход идеально подходит для изучения тричных миоцитов электрофизиологии у генетически модифицированных мышей, в мышиных моделях сердечно-сосудистых заболеваний, или для изучения влияния фармакологических соединений5,6,17 , 18 лет , 19.
Наша лаборатория регулярно использует этот протокол для изоляции миоцитов предсердий мыши для использования в экспериментах с патч-зажимом для того, чтобы исследовать последствия различных форм сердечно-сосудистых заболеваний, генетических мутаций или фармакологических соединений на миоцитоте предсердий Электрофизиологии. Несмотря на высокую степень воспроизводства, качество данных, полученных из изолированных предсердных миоцитов, зависит от качества изоляции. Кроме того, реинтродукция кальция после изоляции предсердий миоцитов приведет к гибели клеток для популяции изолированных миоцитов из-за парадокса кальция16. Соответственно, изоляция жизнеспособных, высококачественных предсердных миоцитов с использованием этого подхода требует практики и оптимизации в нескольких точках на протяжении всей изоляции. После оптимизации, по оценкам, между 70-90% от общего числа предсердий миоцитов, изолированных с помощью этого подхода будет как кальций терпимым и стержня формы. Ниже рассматриваются шаги, требующие максимальной практики и оптимизации.
Скорость и эффективность вскрытия будет иметь вниз по течению влияние на качество изолированных клеток. Важно, чтобы занять время, чтобы обеспечить все кровь удаляется из ткани предсердий и что ткани полосы разрезаны до аналогичного размера. Это должно занять около 5 минут, чтобы удалить предсердий придаток, разрезать ткань на полоски, и передать ткани полосы в первую трубку модифицированных Tyrode рН 6.9 раствора. Однако, если этот шаг занимает слишком много времени, качество ткани может быть скомпрометировано.
Важно также, чтобы тканевые полосы были вырезаны до равномерного размера в изоляции и между сердцами. Если полоски ткани слишком большие или слишком малы, или если они не являются однородными в изоляции, это может вызвать проблемы как во время ферментативного пищеварения и трикуляции. Это потому, что небольшие полоски будут более тщательно переваривается и большие полосы будут под переваривается. Не менее важно учитывать генотип и болезни настройки изучается, как размер предсердного придатка может варьироваться между животными. Например, гипертрофические сердца имеют большие предсердий придатки по сравнению со здоровыми сердцами, и поэтому экспериментатор может сократить больше полос в гипертрофированные сердца по сравнению с нормальным размера сердца. Соответственно, оптимизация размера полосок вырезанной ткани и применение этих измерений к каждому отдельному придатку предсердий значительно улучшит воспроизводимость изоляции миоцитов между экспериментальными условиями.
Тонкий баланс между ферментативным пищеварением и механической диссоциацией является ключом к успешной изоляции миоцитов предсердий с помощью этого протокола. Если ткань не достаточно закрученных во время ферментативного пищеварения отдельные полоски ткани, как правило, слипаются и слипаются, что ограничит эффективность ферментативного пищеварения. Если взволнован слишком часто или энергично, это может привести к повреждению ткани предсердий, что приведет к изоляции нежизнеспособных клеток. Механическая диссоциация изолированных предсердных миоцитов от тканевых полос оклица во время тритурации является наиболее важным шагом на практике и оптимизации с помощью этого подхода для изоляции предсердных миоцитов. Если тритурация слишком мягкая, выход клеток будет низким. С другой стороны, если тритурация будет слишком жесткой, то обилие нежизнеспособных миоцитов будет изолировано, и качество данных, полученных в ходе экспериментов с патч-зажимом, будет поставлено под угрозу. Кроме того, состав притязания может повлиять на изоляцию. Например, если ткань фиброзна, ферментативное пищеварение и тритурации шаги, возможно, потребуется изменить. Поэтому важно взять время, чтобы развивать навыки, необходимые для получения высококачественных клеток во время тритурации, которые могут быть использованы для патч-зажим экспериментов.
Как и во всех экспериментальных методах есть ограничения. Этот метод требует практики для того, чтобы воспроизвкаки жизнеспособной, высококачественные миоциты высокого качества, которые, в свою очередь, повлияет на осуществимость любых экспериментов, которые будут проводиться с использованием этих миоцитов. Этот подход также является терминальным и предсердий миоцитов изолированы с помощью этого подхода могут быть использованы в день изоляции только. Наша лаборатория использует клетки в пределах 6-7 ч изоляции.
Такой подход к изоляции кардиомиоцитов предсердий имеет несколько применений. Например, этот подход может быть изменен, чтобы изолировать миоциты предсердий (а также сердечные фибробласты) от других видов, включая биопсию тканей человека. Кроме того, преимущество множась к использованию этого метода кусок для изоляции предсердий миоцитов (в отличие от ретроградной перфузии сердца) является то, что он может быть изменен, чтобы изолировать кардиомиоциты из других регионов сердца, таких как синоатриальный узло или других конкретных регионах предсердий миокарда, или охватывают всю суправентрикулярную область сердца. Наша лаборатория использует предсердий кардиомиоцитов для патч-зажим экспериментов для измерения потенциалов действия и ионных токов, хотя этот подход не должен ограничиваться этой техникой. Например, изолированные миоциты могут быть использованы для исследования изменений в переходных кальция и контрактности в различных экспериментальных условиях. Предсердий кардиомиоцитов также может быть использован в иммунофлуоресценции исследований для изучения расположения белков или структур, представляющих интерес. Соответственно, этот подход является весьма универсальным с большим количеством возможных приложений.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа поддерживается оперативными грантами От Канадских институтов исследований в области здравоохранения (MOP 93718, 142486) и Фонда сердца и инсульта Канады Р.А. Роузу. Х.Джей Янсен является получателем стипендий Киллама.
1, 2-Bis(2-Aminophenoxy)ethane-N, N, N', N'-tetraacetic acid 98% | Sigma | A4926-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra, > 99%, from microbial | Sigma | A7699-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt > 95%, bacterial | Sigma | A9187-1G | |
Amphocetericin B from Streptomyces sp. ~80% (HPLC), powder | Sigma | A4888-500 MG | |
Bovine serum albumin | Sigma | A3059-50G | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
Cesium chloride ReagentPlus, 99.9% | Sigma | 289329-100G | |
Cesium hydroxide monohydrate > 99.5% trace metals basis | Sigma | 562505-1KG | |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
Creatine anhydrous | Sigma | C0780 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
DL-Aspartic acid potassium salt | Sigma | A2025-100G | |
Elastase suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS002279 | |
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid >97.0% | Sigma | E4378-25G | |
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate > 95% (HPLC), powder | Sigma | G8877-250MG | |
Heparin 10 000 USP units/10mL | SANDOZ | 10750 | |
HEPES > 99.5% (titration) | Sigma | H3375-500G | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate > 99% (HPLC), powder | Sigma | G1501-500G | |
Magnesium sulfate | Sigma | M2643-500G | |
Nifedipine > 98% (HPLC), powder | Sigma | N7634-1G | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate enzymatic, approx 98% | Sigma | P7936-5G | |
Potassium chloride ACS reagent, 99.0-100.5% | Sigma | P3911-500G | |
Potassium hydroxide | EM Science | PX1480-1 | |
Potassium phosphate monobasic | EMD | PX1565-1 | |
Protease from Streptomyces griseus, type XIV, >3.5 units/mg solid, powder | Sigma | P5147-1G | |
Sodium chloride ACS reagent, > 99.0% | Sigma | S9888-2.5KG | |
Sodium hydroxide, pellets, 97+%, A.C.S. reagent | Sigma | 221465-500G | |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments Inc | SYLG184 | |
Taurine | Sigma | T0625-100G | |
Tetraethylammonium chloride > 98% (titration) | Sigma | T2265-100G |