Detta protokoll används för att isolera enstaka förmakskardiomyocyter från vuxna mus hjärta med hjälp av en bit matsmältning strategi. Denna metod används för att isolera höger eller vänster förmaksflimmer myocyter som kan användas för att karakterisera förmaksflimmer myocyt elektrofysiologi i patch-Clamp studier.
De elektrofysiologiska egenskaperna hos förmaksmyocyter huvudsakligen påverkar övergripande hjärtfunktion. Förändringar i de underliggande Joniska strömmarna som är ansvariga för åtgärdens potential kan orsaka proarytmiska substrat som ligger bakom arytmier, såsom förmaksflimmer, som är mycket utbredda i många tillstånd och sjukdomstillstånd. Isolera vuxna mus förmakskardiomyocyter för användning i patch-Clamp experiment har kraftigt Avancerat vår kunskap och förståelse av cellulära elektrofysiologi i friska förmaksmykardium och i inställningen av förmaksflimmer patofysiologi. Dessutom har studier med hjälp av genetiska musmodeller belysa rollen av ett brett spektrum av proteiner i regleringen av förmakselektrofysiologi. Här ger vi ett detaljerat protokoll för isolering av kardiomyocyter från förmaksbihang av vuxna möss med hjälp av en kombination av enzymatisk matsmältning och mekanisk dissociation av dessa vävnader. Detta tillvägagångssätt konsekvent och tillförlitligt ger isolerade förmakskardiomyocyter som sedan kan användas för att karakterisera cellulär elektrofysiologi genom att mäta åtgärder potentialer och Joniska strömmar i patch-Clamp experiment under ett antal experimentella Villkor.
Den Atria, som är den tunna muromgärdade, lågtrycks kammare i hjärtat som tar emot blod från den överlägsna och sämre Vena cavae samt pulmonell vener, är integrerad i normal hjärtfysiologi. Liksom andra regioner i hjärtat, den Atria innehåller ett antal celltyper, inklusive kardiomyocyter, fibroblaster, endotelceller, vaskulära glatta muskelceller, och andra. Förmaksmyocyter är elektriskt retbara celler som spelar en viktig roll i ledning av elektriska signaler genom hjärtat, vilket säkerställer korrekt förmakskontraktion under varje hjärtslag1. Elektrisk dysfunktion i Atria kan leda till ett antal förmaksflimmer specifika arytmier såsom förmaksfladder och förmaksflimmer2,3. Dessa är mycket utbredda, men dåligt förstått, förmaksflimmer arytmier som leder till betydande morbiditet och dödlighet. Förmaksflimmer kan förekomma i samband med genetiska mutationer, i samband med åldrande eller vid fastställandet av förvärvade former av hjärtsjukdom, inklusive hypertoni, hjärtsvikt och diabetes2,4,5 ,6. Dessa villkor kan förändra de elektriska egenskaperna hos förmaksmyocyter som kan skapa ett substrat som ökar prevalensen av arytmogenes1,2.
Normal elektrisk funktion i Atria, liksom förmaksflimmer arytmogenes, är huvudsakligen påverkas av morfologin av åtgärden potential (AP) produceras i förmaksmyocyter. Den förmaksflimmer genereras från aktiviteten hos ett antal Joniska strömmar, inklusive natriumströmmen (Ina, transporteras med NaV1,5 kanaler), l-typ kalcium ström (ica, L, transporteras med cav1,2 och cav1,3 kanaler ), och flera kalium strömmar inklusive Ultra-Rapid fördröjd likriktare kalium ström (Ikur, transporteras med KV1,5 kanaler), den transienta yttre kalium ström (itill, transporteras med kv4,2 och kv4,3 (iKSS, buren av kV2,1 kanaler), och den aktiva likriktaren kalium ström (iK1, buren av KIR2,1-kanaler)1,7, 8. Även om de inte spelar en viktig roll i musen Atria, de snabba och långsamma komponenterna i den fördröjda likriktaren K+ ström (ikr och jagKS) bidrar också till AP repolarisering i vissa arter7. Förändringar i en eller flera av dessa Joniska strömmar kan avsevärt förändra de elektriska egenskaperna hos förmaksflimmer myocyter, vilket kan leda till förmaksflimmer arytmier. Till exempel kan en minskning av ina sakta överledning hastighet över Atria genom att minska AP upstroke hastighet. Å andra sidan, en minskning av repolariserande kalium strömmar eller en ökning av antingen jagca, L eller den sena jagna kan resultera i utveckling av afterdepolarizations som kan utlösa spontan aktivitet i Atria1, 2,9.
Det är viktigt att inse att det finns skillnader i AP morfologi i olika delar av förmaksmyocardium som sannolikt beror på skillnader i uttryck eller reglering av dessa underliggande jonkanaler. Till exempel, skillnader i AP-varaktighet mellan höger och vänster Atria i samband med skillnader i itill nuvarande densitet har väl beskrivits10,11,12,13. Dessutom har vi nyligen visat att det finns distinkta mönster av elektrisk remodeling i höger och vänster Atria av möss med kronisk hypertoni6,14. Rätt förmaksflimmer bakre väggen innehåller också sinoatriellt noden, som har sina egna distinkta mönster av AP morfologi och bränning mönster15. De distinkta egenskaperna hos myocyter i var och en av dessa olika delar av Atria kan undersökas i detalj med hjälp av isolerade myocyter från var och en av dessa regioner.
Det finns olika metoder som kan användas för att isolera förmaksflimmer myocyter för patch-Clamp elektrofysiologi studier16. En möjlighet är att använda en retrograd perfusion metod där hjärtat kanyleras via aorta för leverans av enzymer. Även om detta är en livskraftig metod, det kan producera variationer i förmaksmyocyte kvalitet på grund av inkonsekvenser i perfusion av Atria. Vi har antagit en “Chunk” digestionsmetod för isolering av förmaksmyocyter som eliminerar behovet av retrograd perfusion av hjärtat. Vår metod använder en kombination av enzymatisk matsmältning och mekanisk dissociation av förmaksvävnad som konsekvent och tillförlitligt ger ett stort antal isolerade förmaksmyocyter som är lämpliga för patch-klämma studier. Medan vi beskriver vår strategi här med förmaksflimmer bihang vävnad, tillvägagångssättet kan användas på någon region av förmaksflimmer hjärtmuskeln (dvs, höger eller vänster förmaksbihang, fria väggar, bakre väggar) att prövaren väljer. Denna metod är idealisk för studier av förmaksflimmer myocyt elektrofysiologi hos genetiskt modifierade möss, i musmodeller av hjärt-kärlsjukdom, eller för att studera effekterna av farmakologiska föreningar5,6,17 , 18 , 19.
Vårt labb använder rutinmässigt detta protokoll för att isolera mus förmaksflimmer myocyter för användning i patch-Clamp experiment för att undersöka effekterna av olika former av hjärt-kärlsjukdom, genetiska mutationer, eller farmakologiska föreningar på förmaksflimmer myocyt Elektrofysiologi. Även om mycket reproducerbara, kvaliteten på de data som erhålls från isolerade förmaksmyocyter beror på kvaliteten på isoleringen. Dessutom kommer återinförande av kalcium efter förmaksflimmer myocyt isolering resultera i celldöd för en population av isolerade myocyter på grund av kalcium Paradox16. Följaktligen, isolera livskraftiga, högkvalitativa förmaksmyocyter med denna metod kräver övning och optimering på flera punkter under isoleringen. När optimerad, det uppskattas att mellan 70-90% av den totala förmaksflimmer myocyter isolerade med denna metod kommer att vara både kalcium tolerant och Rod formad. Stegen som kräver mest övning och optimering diskuteras nedan.
Hastigheten och effektiviteten av dissektion kommer att ha nedströms effekter på kvaliteten på de isolerade cellerna. Det är viktigt att ta tid att se till att allt blod avlägsnas från den förmaksflimmer vävnaden och att vävnad remsor skärs till en liknande storlek. Det bör ta cirka 5 min att ta bort den förmaksflimmer bihang, skär vävnaden i strimlor, och överföra vävnaden remsor i det första röret av modifierad Tyrodes pH 6,9 lösning. Men om detta steg tar för lång tid, kan kvaliteten på vävnaden äventyras.
Det är också viktigt att vävnads remsor skärs till en enhetlig storlek inom en isolering och mellan hjärtan. Om vävnad remsor är för stora eller för små, eller om de inte är enhetliga i en isolering, detta kan orsaka problem under både enzymatisk matsmältning och trituration. Detta beror på att små remsor kommer att vara mer grundligt smält och stora remsor kommer att vara under smält. Det är lika viktigt att överväga genotyp och sjukdoms inställningen studeras som storleken på den förmaksflimmer bihang kan variera mellan djur. Till exempel, hypertrofiska hjärtan har större förmaksbihang jämfört med friska hjärtan, och därför kan försöksledaren skära fler remsor i hypertrofiska hjärtan jämfört med normalstora hjärtan. Följaktligen, optimera storleken på skära vävnad remsor och tillämpa dessa dimensioner på varje enskild förmaksflimmer bihang kommer att avsevärt förbättra reproducerbarheten av myocyt isoleringar mellan Försöksförhållanden.
Den känsliga balansen mellan enzymatisk nedbrytning och mekanisk dissociation är nyckeln till en lyckad förmaksflimmer myocyt isolering med hjälp av detta protokoll. Om vävnaden inte är tillräckligt virvlade under enzymatisk nedbrytning de enskilda vävnads remsor tenderar att klumpa och hålla ihop, vilket kommer att begränsa effektiviteten i den enzymatiska matsmältningen. Om upprörd alltför ofta eller kraftfullt, detta kan skada den förmaksflimmer vävnaden, vilket kommer att resultera i isolering av nonlivskraftiga celler. Mekanisk dissociation av isolerade förmaksmyocyter från vävnad remsor under sönderdelning är det mest kritiska steget för att öva och optimera med hjälp av denna metod för att isolera förmaksmyocyter. Om triturering är för skonsam kommer cell utbytet att vara lågt. Å andra sidan, om sönderdelning är för hård, då ett överflöd av icke-livskraftiga myocyter kommer att isoleras, och kvaliteten på data som erhålls under patch-klämma experiment kommer att äventyras. Dessutom kan sammansättningen av Atria påverka isoleringen. Till exempel, om vävnaden är fibrotisk, den enzymatiska matsmältningen och sönderdelning stegen kan behöva ändras. Det är därför viktigt att ta sig tid att utveckla de färdigheter som krävs för att få hög kvalitet celler under sönderdelning som kan användas för patch-klämma experiment.
Som med alla experimentella tekniker finns det begränsningar. Denna teknik kräver praxis för att reproducerbart isolera livskraftiga, hög kvalitet myocyter, vilket i sin tur kommer att påverka genomförbarheten av alla experiment som skall utföras med dessa myocyter. Detta tillvägagångssätt är också Terminal och förmaksmyocyter isolerade med denna metod kan användas på dagen för isolering endast. Vårt labb använder cellerna inom 6-7 h isolering.
Denna metod för att isolera förmakskardiomyocyter har flera tillämpningar. Till exempel, denna metod kan ändras för att isolera förmaksmyocyter (liksom hjärt fibroblaster) från andra arter inklusive mänskliga förmaksflimmer vävnadbiopsier. Dessutom, en fördel med att använda denna Chunk metod för förmaksflimmer myocyt isolering (i motsats till retrograd perfusion av hjärtat) är att det kan ändras för att isolera kardiomyocyter från andra regioner i hjärtat, såsom sinoatriell nod eller andra specifika regioner av den förmaksflimmer myocardium, eller omfattar hela supraventrikulär regionen i hjärtat. Vårt labb använder förmakskardiomyocyter för patch-Clamp experiment för att mäta åtgärder potentialer och Joniska strömmar, även om detta tillvägagångssätt behöver inte begränsas till denna teknik. Till exempel, isolerade myocyter kan användas för att undersöka förändringar i kalcium transienter och kontraktilitet i en mängd olika experimentella inställningar. Atriella kardiomyocyter kan också användas i immunofluorescensstudier för att studera placeringen av proteiner eller strukturer av intresse. Därför är denna metod mycket mångsidig med många möjliga tillämpningar.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av driftsbidrag från de kanadensiska instituten för hälsoforskning (MOP 93718, 142486) och Heart and stroke Foundation i Kanada till ra Rose. H.J. Jansen är mottagare av en Killam postdoktor gemenskap.
1, 2-Bis(2-Aminophenoxy)ethane-N, N, N', N'-tetraacetic acid 98% | Sigma | A4926-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra, > 99%, from microbial | Sigma | A7699-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt > 95%, bacterial | Sigma | A9187-1G | |
Amphocetericin B from Streptomyces sp. ~80% (HPLC), powder | Sigma | A4888-500 MG | |
Bovine serum albumin | Sigma | A3059-50G | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
Cesium chloride ReagentPlus, 99.9% | Sigma | 289329-100G | |
Cesium hydroxide monohydrate > 99.5% trace metals basis | Sigma | 562505-1KG | |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
Creatine anhydrous | Sigma | C0780 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
DL-Aspartic acid potassium salt | Sigma | A2025-100G | |
Elastase suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS002279 | |
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid >97.0% | Sigma | E4378-25G | |
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate > 95% (HPLC), powder | Sigma | G8877-250MG | |
Heparin 10 000 USP units/10mL | SANDOZ | 10750 | |
HEPES > 99.5% (titration) | Sigma | H3375-500G | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate > 99% (HPLC), powder | Sigma | G1501-500G | |
Magnesium sulfate | Sigma | M2643-500G | |
Nifedipine > 98% (HPLC), powder | Sigma | N7634-1G | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate enzymatic, approx 98% | Sigma | P7936-5G | |
Potassium chloride ACS reagent, 99.0-100.5% | Sigma | P3911-500G | |
Potassium hydroxide | EM Science | PX1480-1 | |
Potassium phosphate monobasic | EMD | PX1565-1 | |
Protease from Streptomyces griseus, type XIV, >3.5 units/mg solid, powder | Sigma | P5147-1G | |
Sodium chloride ACS reagent, > 99.0% | Sigma | S9888-2.5KG | |
Sodium hydroxide, pellets, 97+%, A.C.S. reagent | Sigma | 221465-500G | |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments Inc | SYLG184 | |
Taurine | Sigma | T0625-100G | |
Tetraethylammonium chloride > 98% (titration) | Sigma | T2265-100G |