在这里,我们提出了RNADNA依赖性裂解的协议。这使得RNA2′-O-甲基化能够进行快速和位点依赖性分析。这种方法可用于对打用RNA活性的初步或主要评估。
导箱C/D小核核核RNA(斯诺RNA)催化核糖体和小核RNA的甲基化2′-O-甲基化。然而,高真核生物中的大量打声RNA可能混杂地识别其他RNA物种和2′-O-甲基化多靶点。在这里,我们使用一种采用短DNA寡核苷酸(DNA)的成熟方法,对站点特异性2′-O-甲基化进行快速且非昂贵的分析,提供分步指南。这些DNA片段含有催化序列,在特定的共识位置将RNA裂断,以及将DNA定向到其RNA目标的可变同源性武器。脱氧核糖核酸活性被RNA中靠近裂解位点的核苷酸的2-O甲基化抑制。因此,DNA酶仅受被分块序列的共识限制,是快速分析介导的RNA 2′-O-甲基化的完美工具。我们分析了snoRNA snR13-和snR47引导2′-O-甲基化25S核糖体RNA在糖霉菌中,以证明该技术的简单性,并为脱氧核糖核酸酶依赖测定提供详细的方案。
RNA修饰在基因表达的调节中起着重要的作用。RNA 2′-O-甲基化和伪尿化,分别由盒C/D和盒H/ACA小核核RNA(snoRNA)引导,保护RNA免受降解并稳定其高阶结构1,2,3.鼻RNA靶点主要在核糖体RNA(rRNA)和小型核RNA(snRNA)中确定。然而,在较高的真核生物中,可能有数百种没有分配函数的snoRNA,其中一些可能识别多个RNA1,4,5,6,7。因此,能够识别和分析打手酸的抗性修饰的方法是发现控制细胞过程的机制的重要工具。
盒 C/D snoRNA 引导的假定2′-O-甲基化位点可以通过许多技术进行生物信息识别,并通过许多技术进行实验确认,包括RNase H定向裂解,或特定位点和全基因组方法,采用逆转录在低核苷酸(dNTPs)浓度接近8,9,10,11。这些技术非常敏感,但也费力和昂贵,因此,可能不适合初始或快速测试。识别2′-O-甲基化位点的最简单和低成本的方法之一是DNA酶依赖性RNA裂解12。脱氧核糖核酸是短的、单链的和催化活性的DNA分子,能够在特定位置对RNA进行内源性裂解。它们由保存和催化活性核心序列和 5′ 和 3′ 结合臂组成,由通过 Watson-Crick 碱基配对与RNA靶点杂交的可变序列组成(图1)。因此,5′ 和 3′ 臂将催化序列输送到特定的 RNA 位点。DNA依赖性裂解被位于裂解部位12、13正上游的核苷酸的2′-O-甲基化所抑制。这使得DNAzymes非常实用的工具,用于分析假定或已知的RNA 2′-O甲基化位点。
两种类型的脱核糖核酸用于RNA修饰分析12。10-23 DNAzyme 的活性序列(图 1A) 由 15 个核苷酸 (5’RGGCCTACACGA3’) 组成,这些核苷酸围绕靶向RNA purine-pyrimidine (RY) dinleotide 形成一个循环,并催化这两个核苷酸之间的裂解。RNA 紫红色 (R) 与脱氧核糖核酸不基配,在 DNA 酶上呈现的 2′-O 甲基化抑制裂解。10-23 DNAzyme 的结合臂通常为 10-15 核苷酸长。第二类脱核糖核酸(8-17 DNA酶(图1B)含有14核苷酸催化序列(5’TCCGAGCCGGACGA3’)。核苷酸C2、C3和G4对与C9 G10和G11形成短干环结构。8-17 脱核糖核酸将RNA在无瑕疵胺活性序列中与第一胸腺素不完全配对的任何瓜氨酸上游分离。瓜宁上游的RNA核苷酸与脱氧核糖核酸不基配,其2′-O-甲基化会损害裂解。8-17 脱核糖核酸需要大约20个核苷酸的较长同源臂,才能将脱核糖核酸定向到其特定序列。
在这里,我们提供了一个分步协议,用于使用10-23和8-17 DNA酶依赖方法12,13(图1C)分析糖精菌中2′-O-甲基化。该协议可以很容易地适应其他生物体和RNA物种,并用于对位点特异性RNA 2′-O-甲基化进行快速、初步或主要分析。
脱氧核糖核酸依赖性消化可用作分析位点特异性RNA 2′-O-甲基化12,13的简单而快速的方法。如果裂解部位上游的核苷酸未甲基化,DNA裂解RNA。与其他方法相反,包括RNase H定向消化、碱性降解或低核苷酸浓度逆转录,然后是定量PCR或测序8、10、11 ,16, DNAzyme 方法需要一个简单的 DNA 寡核苷酸和基本试剂,存在于任何分子生物学实验室.此外,脱毛核糖核酸可用于以类似方式分析由盒H/ACAsnoRNA12介导的RNA伪尿化,这使得它们成为研究斯诺RNA靶点的多功能工具。
脱口无音依赖性的方法仅受裂解部位共识序列17的限制。10-23 DNAzymes 仅用于分析 RY 二核苷酸位置 R 的 2′-O 甲基化,而 8-17 DNA 酶可识别位于瓜氨酸上游的核苷酸的修饰。因此,无法分析二核苷苷-二丁二烯(GA)、二丁胺-二丁胺(AA)、苯丙胺-二丁胺(YA)和苯丙胺-苯丙胺(YY)中第一核苷酸的2′-O甲基化等修饰。此外,还应考虑脱口核子依赖性裂解12的低效率。虽然一些脱发酶几乎完全地将RNA分十四(图3B),但许多脱发酶只部分消化其目标(图3B)。效率可能取决于裂解部位周围的顺序。例如,具有相同核苷酸延伸的RNA区域可能会影响脱核糖核酸活性序列的正确定位。此外,形成强二次结构的RNA区域可以重新杂交并抑制DNA酶结合到靶序列。为了克服这些问题,10-23 DNAzyme及其RNA基质的加热和冷却周期可以应用18。
我们使用脱氧核糖核酸方法研究rRNA的2′-O-甲基化。也可以使用这种技术来分析其他RNA修饰,如N6-甲基腺苷19。核糖体RNA,由于其丰度,可以通过电泳进行分析,裂解产物可以在紫外线下可视化。然而,这不适用于较丰富的RNA,如RNA聚合酶II生成的编码RNA(mRNA)和非编码RNA(ncRNA)。这些RNA通常不能通过在糖或聚丙烯酰胺凝胶中的RNA染色直接检测。在这种情况下,DNA依赖性裂解可以通过北方印迹可视化,通过PCR/定量PCR间接检测,或通过定量PCR分析,聚合酶(例如,KlenTaq DNA聚合酶),能够鉴别2+-O甲基化RNA无甲基化RNA20,21。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢玛雅·威尔逊和阿妮卡·莱尼对手稿的批判性解读。这项工作得到了由韦康信托基金和皇家学会共同资助的亨利·戴尔爵士奖学金的支持(200473/Z/16/Z)。
Chemicals | |||
Acid phenol | SIGMA | P4682 | |
Agarose | VWR | A2114 | |
Ammonium acetate | SIGMA | A1542 | |
Chlorophorm | Fisher scientific | 10293850 | |
DNase/RNase free water | Fischer Scientific | 10526945 | |
DNAzyme | Integrated DNA Technology | Custom oligo DNA | |
EDTA | SIGMA | E9884 | |
Ethanol Absolute | Fisher scientific | 10437341 | |
Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
Formamide | sigma | F9037 | |
Galactose | SIGMA | G0750 | |
Gel Loading Dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
Glucose | SIGMA | G7021 | |
Glycogen | Thermo Fisher Scientific | R0561 | |
HEPES | SIGMA | H3375 | |
Isoamyl | SIGMA | W205702 | |
KCl | SIGMA | P9333 | |
MgCl2 | SIGMA | M8266 | |
MnCl2 | SIGMA | 244589 | |
MOPS | SIGMA | M1254 | |
NaCl | SIGMA | S7653 | |
Oxoid Peptone Bacteriological | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
Oxoid Yeast Extract Powder | Thermo Fisher Scientific | LP0021 | |
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | EO0382 | |
SDS | SIGMA | 74255 | |
Sodium acetate trihydrate | SIGMA | S8625 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
Tris base | SIGMA | TRIS-RO | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
1.5 mL microtubes | Sarstedt | ||
152VR5C01M -80°C freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
250 mL Erlenmeyer flasks | Cole-Parmer | ||
50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
Combicup VX200 vortex | Appleton Woods | ||
DS-11 microspectrophotometer | Denovix | ||
Electrophoresis chamber (20 cm tray) | SIGMA | ||
FiveEasy F20 pH meter | Appleton Woods | ||
Gel documentation system | Syngene | ||
Heraeus Fresco 21 micro centrifuge | Fisher Scientific | ||
Megafuge 8R centrifuge with rotator suitable for 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | ||
Mini Fuge Plus mini centrifuge | Starlab | ||
Mixer HC thermal block | Starlab | ||
OLS26 Shaking Water Bath | Grant | ||
PowerPac power supplier | BioRad |