Her præsenterer vi en protokol for DNAzyme-afhængig kavalergang af RNA. Dette muliggør hurtig og websteds afhængig analyse af RNA 2 ‘-O-methylering. Denne fremgangsmåde kan anvendes til foreløbig eller større vurdering af snoRNA aktivitet.
Guide boks C/D små nucleolar RNAs (snoRNAs) katalyserer 2 ‘-O-methylering af ribosomale og små nukleare RNA. Men et stort antal snoRNA i højere eukaryoter kan promiøst anerkende andre RNA-arter og 2 ‘-O-methylat flere mål. Her giver vi trin-for-trin guide til den hurtige og ikke-dyre analyse af den stedspecifikke 2 ‘-O-methylering ved hjælp af en veletableret metode, der anvender korte DNA-oligonukleotider kaldet DNAzymes. Disse DNA-fragmenter indeholder katalytiske sekvenser, som kløver RNA ved specifikke konsensus positioner, samt variable homologi Arms, der dirigerer dnazyme til sine RNA-mål. DNAzyme aktivitet hæmmes af 2-‘ O-methylering af nukleotid støder op til spaltnings stedet i RNA. Således er DNAzymes, kun begrænset af konsensus af spaltet sekvens, perfekte værktøjer til hurtig analyse af snoRNA-medieret RNA 2 ‘-O-methylering. Vi analyserede snoRNA snR13-og snR47-guidet 2 ‘-O-methylering af 25S ribosomale RNA i Saccharomyces cerevisiae for at demonstrere enkelheden af teknikken og for at give en detaljeret protokol til DNAzyme-afhængig analyse.
RNA-modifikationer spiller en vigtig rolle i reguleringen af genekspression. RNA 2 ‘-O-methylering og pseudouridylation, som styres af box C/D og box H/ACA små nucleolar RNAs (snornas) henholdsvis beskytter RNA mod nedbrydning og stabiliserer deres højere ordre strukturer1,2,3 . SnoRNA mål er primært blevet identificeret i ribosomale RNAs (rRNA) og små nukleare RNAs (snRNAs). Men i højere eukaryoter, der er potentielt hundredvis af snorna med ingen tildelte funktioner og nogle af dem kan genkende flere RNAs1,4,5,6,7. Derfor er metoder, der giver mulighed for identifikation og analyse af snoRNA-guidede modifikationer, vigtige værktøjer til at afdække mekanismer for cellulære processer.
En boks C/D snoRNA-guidet, anstødelige 2 ‘-O-methylering site kan identificeres bioinformatisk og bekræftet eksperimentelt af mange teknikker, herunder RNase H-instrueret spaltning, eller site-specifikke og genomdækkende metoder, som beskæftiger reverse transskription i lavnukleotider (dntps) koncentrations metode8,9,10,11. Disse teknikker er meget følsomme, men også omstændelig og dyre, derfor, kan ikke være egnet til den indledende eller hurtig test. En af de enkleste og billige metoder til at identificere 2 ‘-O-methylering sites er DNAzyme-afhængige RNA kavalergang12. DNAzymes er korte, enkelt strengede og katalytisk aktive DNA-molekyler, der kan endonukleolytisk spaltning af RNA på bestemte positioner. De består af en bevaret og katalytisk aktiv kerne sekvens og 5 ‘ og 3 ‘ bindings arme bestående af variable sekvenser, der er designet til at hybridisere af Watson-Crick base-parring til RNA-målet (figur 1). Således giver 5 ‘ og 3 ‘ armene den katalytiske sekvens til det specifikke RNA-sted. Dnazyme-afhængig spaltning hæmmes af 2 ‘-O-methylering af nucleotid placeret direkte opstrøms for kavaler pladsen12,13. Dette gør DNAzymes meget praktiske værktøjer til analyse af formodede eller kendte RNA 2 ‘-O-methylering sites.
Der anvendes to typer DNAzymes til analyse af RNA-modifikationer12. Den aktive sekvens af 10-23 DNAzyme (figur 1a) består af 15 nukleotider (5 ‘ RGGCTAGCTACAACGA3 ‘), som danner en løkke omkring den målrettede RNA purin-pyrimidin (ry) dinucleosid og katalyserer spalningen mellem disse to nukleotider. RNA purin (R) er ikke base-parret med DNAzyme og 2 ‘-O-methylering præsenterer på DNAzyme hæmmer kavalergang. Bind armene på 10-23 DNAzymes er normalt 10-15 nucleotider lang. Den anden DNAzyme klasse, 8-17 DNAzymes (figur 1b) indeholder 14-nukleotid katalytisk sekvens (5 ‘ TCCGAGCCGGACGA3 ‘). Nucleotides C2, c3 og g4 par med C9 G10 og g11 danner en kort stamme-loop struktur. 8-17 dnazymes kløver RNA opstrøms for enhver guanin, der er perfekt parret med den første cytosin fra dnazyme Active sekvensen. RNA-nukleotid opstrøms for guanin er ikke base-parret med DNAzyme og dets 2 ‘-O-methylering forringer spalningen. 8-17 DNAzymes kræver længere homologi arme på omkring 20 nukleotider for at dirigere DNAzyme til dens specifikke sekvens.
Her giver vi en trin-for-trin protokol til analyse af 2 ‘-O-methylering af rRNA i Saccharomyces cerevisiae ved hjælp af 10-23 og 8-17 dnazyme-afhængige tilgange12,13 (figur 1c). Denne protokol kan let tilpasses til andre organismer og RNA-arter og anvendes til hurtige, foreløbige eller større analyser af den stedspecifikke RNA 2 ‘-O-methylering.
Dnazyme-afhængig fordøjelse kan bruges som en enkel og hurtig metode til at analysere site-specifikke RNA 2 ‘-O-methylering12,13. DNAzymes kløver RNA, hvis nukleotid opstrøms for kavaler pladsen ikke er methyleret. I modsætning til andre tilgange, herunder RNase H-dirigeret fordøjelse, alkalisk nedbrydning eller omvendt transskription i lav nukleotider koncentration efterfulgt af kvantitativ PCR eller sekventering8,10,11 ,16, dnazyme tilgang kræver en simpel DNA oligonukleotid og grundlæggende reagenser, der er til stede i enhver molekylær biologi laboratorium. Desuden kan DNAzymes anvendes på en lignende måde til at analysere RNA pseudouridylation medieret af box H/ACA snoRNA12, hvilket gør dem alsidige værktøjer til at studere snorna mål.
DNAzyme-afhængige tilgange er kun begrænset af kavalergang konsensus sekvenser17. 10-23 DNAzymes kan anvendes til at analysere 2 ‘-O-methylering kun på position R af RY dinucleotid, mens 8-17 DNAzymes genkende modifikationen af nukleotid placeret opstrøms for guanin. Som følge heraf kan ændringer som 2 ‘-O-methylering af det første nukleotid i dinucleotides guanine-adenin (GA), adenin-adenin (AA), pyrimidin-adenin (YA) og pyrimidin-pyrimidin (YY) ikke analyseres. Desuden bør den lave effektivitet af DNAzyme-afhængig spaltning12 overvejes. Selv om nogle DNAzymes Cleave RNA næsten helt (figur 3b), mange dnazymes kun delvist fordøje deres mål (figur 3b). Effektiviteten kan afhænge af sekvensen omkring kavaler pladsen. F. eks. kan RNA-regioner med strækninger af samme nukleotid påvirke den korrekte placering af den aktive DNAzyme-sekvens. Desuden kan RNA-regioner, der danner en stærk sekundær struktur, re-hybridisere og undertrykke DNAzyme binding til målsekvensen. For at overvinde disse problemer, cyklusser af opvarmning og afkøling af 10-23 DNAzyme og dets RNA substrat kan anvendes18.
Vi brugte DNAzyme-tilgangen til at undersøge 2 ‘-O-methylering af rRNA. Man kan også bruge denne teknik til at analysere andre RNA modifikationer, såsom N6-methyladenosine19. Ribosomal RNA, på grund af sin overflod, kan analyseres ved elektroforese og spaltningen produkter kan visualiseres under UV-lys. Dette gælder dog ikke for mindre rigelige RNAs som RNA polymerase II-genereret kodning RNAs (mRNA) og ikke-kodning RNAs (ncRNA). Disse RNAs kan normalt ikke påvises direkte ved RNA-farvning i agrose eller polyacrylamid geler. I sådanne tilfælde kan DNAzyme-afhængig spaltning visualiseres ved nordlige blotning, indirekte påvist ved PCR/kvantitativ PCR eller analyseret ved kvantitativ PCR med polymeraser (f. eks. KlenTaq DNA-Polymerase), der er i stand til at diskriminere 2 ′-O-methyleret RNA fra ikke-methyleret RNA20,21.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Maya Wilson og Aneika Leney for den kritiske læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af en Sir Henry dale Fellowship i fællesskab finansieret af Wellcome Trust og Royal Society (200473/Z/16/Z).
Chemicals | |||
Acid phenol | SIGMA | P4682 | |
Agarose | VWR | A2114 | |
Ammonium acetate | SIGMA | A1542 | |
Chlorophorm | Fisher scientific | 10293850 | |
DNase/RNase free water | Fischer Scientific | 10526945 | |
DNAzyme | Integrated DNA Technology | Custom oligo DNA | |
EDTA | SIGMA | E9884 | |
Ethanol Absolute | Fisher scientific | 10437341 | |
Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
Formamide | sigma | F9037 | |
Galactose | SIGMA | G0750 | |
Gel Loading Dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
Glucose | SIGMA | G7021 | |
Glycogen | Thermo Fisher Scientific | R0561 | |
HEPES | SIGMA | H3375 | |
Isoamyl | SIGMA | W205702 | |
KCl | SIGMA | P9333 | |
MgCl2 | SIGMA | M8266 | |
MnCl2 | SIGMA | 244589 | |
MOPS | SIGMA | M1254 | |
NaCl | SIGMA | S7653 | |
Oxoid Peptone Bacteriological | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
Oxoid Yeast Extract Powder | Thermo Fisher Scientific | LP0021 | |
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | EO0382 | |
SDS | SIGMA | 74255 | |
Sodium acetate trihydrate | SIGMA | S8625 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
Tris base | SIGMA | TRIS-RO | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
1.5 mL microtubes | Sarstedt | ||
152VR5C01M -80°C freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
250 mL Erlenmeyer flasks | Cole-Parmer | ||
50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
Combicup VX200 vortex | Appleton Woods | ||
DS-11 microspectrophotometer | Denovix | ||
Electrophoresis chamber (20 cm tray) | SIGMA | ||
FiveEasy F20 pH meter | Appleton Woods | ||
Gel documentation system | Syngene | ||
Heraeus Fresco 21 micro centrifuge | Fisher Scientific | ||
Megafuge 8R centrifuge with rotator suitable for 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | ||
Mini Fuge Plus mini centrifuge | Starlab | ||
Mixer HC thermal block | Starlab | ||
OLS26 Shaking Water Bath | Grant | ||
PowerPac power supplier | BioRad |