यहाँ हम आरएनए के DNAzyme-निर्भर दरार के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह आरएनए 2 ‘ओ-मेथिलेशन के तेजी से और साइट पर निर्भर विश्लेषण सक्षम बनाता है। इस दृष्टिकोण snoRNA गतिविधि के प्रारंभिक या प्रमुख आकलन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
गाइड बॉक्स C/D छोटे न्यूक्लिओलर आरएनए (snoRNAs) रिबोसोमल और छोटे परमाणु आरएनए के 2′-O-मिथाइलेशन उत्प्रेरित। हालांकि, उच्च यूकैरियोट में snoRNA की एक बड़ी संख्या promiscuously अन्य आरएनए प्रजातियों और 2 ‘ओ-मेथिलेट कई लक्ष्यों को पहचान सकते हैं. यहाँ, हम साइट के तेजी से और गैर महंगा विश्लेषण के लिए कदम दर कदम गाइड प्रदान करते हैं विशिष्ट 2’-O-methylation एक अच्छी तरह से स्थापित विधि का उपयोग कर कम डीएनए oligonucleotides DNAzymes बुलाया रोजगार. इन डीएनए टुकड़ों में उत्प्रेरक अनुक्रम होते हैं जो विशिष्ट आम सहमति स्थितियों पर आरएनए को छोड़ देते हैं, साथ ही परिवर्तनीय होमोलोजी आर्म्स जो डीएनएजीएम को अपने आरएनए लक्ष्यों के लिए निर्देशित करते हैं। DNAzyme गतिविधि आरएनए में दरार साइट के निकट न्यूक्लिओटाइड के 2-‘O-मेथिलेशन द्वारा बाधित है। इस प्रकार, DNAzymes, केवल cleaved अनुक्रम की आम सहमति से सीमित, snoRNA-मध्यस्थ आरएनए 2′-O-मेथिलेशन के त्वरित विश्लेषण के लिए एकदम सही उपकरण हैं. हम snoRNA snR13- और snR47 निर्देशित 2’-O-methylation के 25S ribosomal आरएनए Saccharomyces cerevisiae में तकनीक की सादगी का प्रदर्शन करने के लिए और DNAzyme-निर्भर परख के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए विश्लेषण किया.
आरएनए संशोधन जीन अभिव्यक्ति के विनियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। आरएनए 2′-ओ-मेथिलेशन और स्यूडोयूरिडिलेशन, जो बॉक्स सी/डी और बॉक्स एच/एसीए छोटे न्यूक्लिओलर आरएनए (स्नोआरएन) द्वारा क्रमशः निर्देशित किया जाता है, आरएनए को निम्नीकरण से बचाता है और उनके उच्च-क्रम संरचनाओं को स्थिर करताहै 1,2,3 . स्नोरना लक्ष्यों की पहचान मुख्य रूप से रिबोसोमल आरएनए (आरआरएनए) और छोटे परमाणु आरएनए (एसआरएनए) में की गई है। हालांकि, उच्च यूकैरियोट में, कोई असाइन किए गए कार्यों के साथ snoRNA के संभावित सैकड़ों रहे हैं और उनमें से कुछ कई RNAs1,4,5,6,7पहचान सकते हैं . इसलिए, तरीकों जो पहचान और snoRNA निर्देशित संशोधनों के विश्लेषण के लिए अनुमति सेलुलर प्रक्रियाओं को नियंत्रित तंत्र को उजागर करने में महत्वपूर्ण उपकरण हैं.
एक बॉक्स C/D snoRNA निर्देशित putative 2′-O-मेथिलेशन साइट bioinformatically पहचान की जा सकती है और कई तकनीकों द्वारा प्रयोगात्मक पुष्टि की, RNase एच निर्देशित दरार, या साइट विशेष और जीनोम व्यापक तरीकों सहित, जो रिवर्स प्रतिलेखन को रोजगार कम न्यूक्लिओटाइड (डीएनटीपी) संकेंद्रण में8,9,10,11. इन तकनीकों को बहुत संवेदनशील हैं, लेकिन यह भी कठिन और महंगा है, इसलिए, प्रारंभिक या त्वरित परीक्षण के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है. 2′-ओ-मेथिलेशन साइटों की पहचान करने के लिए सबसे सरल और कम लागत वाले तरीकों में से एक DNAzyme-निर्भर आरएनए क्लीवेज12है। DNAzymes छोटे, एकल फैला हुआ है और उत्प्रेरक सक्रिय डीएनए अणुओं विशिष्ट पदों पर आरएनए के endonucleolytic दरार करने में सक्षम हैं. इनमें एक संरक्षित और उत्प्रेरक रूप से सक्रिय कोर अनुक्रम और 5′ और 3′ बाध्यकारी आर्म ्स शामिल हैं जो वाणस-क्रिक बेस द्वारा आरएनए लक्ष्य (चित्र 1)के लिए हाइब्रिड बनाने के लिए डिज़ाइन किए गए चर अनुक्रमों से बने हैं। इस प्रकार, 5′ और 3′ हथियार विशिष्ट आरएनए साइट के लिए उत्प्रेरक अनुक्रम उद्धार. DNAzyme-निर्भर दरार दरार साइट12,13के सीधे ऊपर तैनात न्यूक्लिओटाइड के 2′-O-मिथाइलेशन द्वारा बाधित है। यह putative या ज्ञात आरएनए 2′-O-मेथिलेशन साइटों के विश्लेषण के लिए DNAzymes बहुत व्यावहारिक उपकरण बनाता है.
आरएनए संशोधनों के विश्लेषण12के लिए दो प्रकार के DNAzymes का उपयोग किया जाता है। 10-23 DNAzyme के सक्रिय अनुक्रम (चित्र 1A) 15 न्यूक्लिओटाइड (5’RGGCTAGCTACAACGA3′) जो लक्षित आरएनए प्यूरीन-पाइरीमिडीन (आरवाई) dinucleotide के आसपास एक पाश फार्म और इन दो न्यूक्लिओटाइट्स के बीच दरार उत्प्रेरित होते हैं। आरएनए प्यूरीन (आर) DNAzyme के साथ आधार-युग्मित नहीं है और DNAzyme पर 2′-O-मिथाइलेशन प्रस्तुत करता है क्लीवेज को रोकता है। 10-23 DNAzymes के बाध्यकारी हथियार आमतौर पर 10-15 न्यूक्लिओटाइड लंबे होते हैं। द्वितीय DNAzyme वर्ग, 8-17 DNAzymes (चित्र 1B) 14-न्यूक्लिओटाइड उत्प्रेरक अनुक्रम (5’TCCGAGCCGA3′) होते हैं। न्यूक्लिओटाइड्स सी2, सी3 और जी4 जोड़ी के साथ सी9 जी10 और जी11 एक छोटी स्टेम-लूप संरचना का निर्माण। 8-17 DNAzymes किसी भी guanine कि अपूर्ण रूप से DNAzyme सक्रिय अनुक्रम से पहले थाइमीन के साथ जोड़ा जाता है के आरएनए को छोड़ दें। ग्वानीन के ऊपर आरएनए न्यूक्लिओटाइड DNAzyme के साथ आधार-युग्मित नहीं है और इसके 2′-O-मिथाइलेशन दरार को ख़राब कर देता है। 8-17 DNAzymes अपने विशिष्ट अनुक्रम के लिए DNAzyme निर्देशित करने के लिए लगभग 20 न्यूक्लिओटाइड के लंबे समय तक होमोलोजी हथियारों की आवश्यकता होती है।
यहाँ, हम 10-23 और 8-17 DNAzyme-निर्भर दृष्टिकोण12,13 (चित्र 1C) का उपयोग कर Saccharomyces सेरेविएसिया ई में Rनए के 2′-O-मेथिलेशन के विश्लेषण के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल को आसानी से अन्य जीवों और आरएनए प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और साइट-विशिष्ट आरएनए 2′-ओ-मेथिलेशन के तेजी से, प्रारंभिक या प्रमुख विश्लेषण के लिए नियोजित किया जा सकता है।
DNAzyme-निर्भर पाचन साइट-विशिष्ट आरएनए 2′-ओ-मेथिलेशन12,13का विश्लेषण करने के लिए एक सरल और त्वरित विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। यदि क्लीवेज साइट के न्यूक्लिओटाइड अपस्ट्रीम को मेथिलेट नहीं किया जाता है तो डीएनएजाइजीज़ क्लीव आरएनए। RNase एच निर्देशित पाचन सहित अन्य दृष्टिकोण के विपरीत, क्षारीय गिरावट या कम न्यूक्लिओटाइड एकाग्रता में रिवर्स प्रतिलेखन मात्रात्मक पीसीआर या अनुक्रमण8,10,11 के बाद ,16, DNAzyme दृष्टिकोण एक साधारण डीएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड और बुनियादी अभिकर्मकों कि किसी भी आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशाला में मौजूद हैं की आवश्यकता है. इसके अलावा, DNAzymes एक समान तरीके से इस्तेमाल किया जा सकता है आरएनए pseudouridylation बॉक्स H/ACA snoRNA12द्वारा मध्यस्थता का विश्लेषण करने के लिए, जो उन्हें snoRNA लक्ष्यों का अध्ययन करने में बहुमुखी उपकरण बनाता है.
DNAzyme-निर्भर दृष्टिकोण केवल दरार साइट आम सहमति दृश्यों17द्वारा सीमित कर रहे हैं. 10-23 DNAzymes केवल RY dinucleotide की स्थिति आर पर 2′-O-methylation का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि 8-17 DNAzymes ग्वानी नली के ऊपर स्थित न्यूक्लिओटाइड के संशोधन को पहचान. नतीजतन, dinucleotides ग्वानीन-एडेनिन (जीए), एडेनिन-एडेनीन (एए), पाइरिमिडीन-एडेनीन (वाईए) और पाइरिमिडीन-पिरिमिडीन (वाईवाई) में पहले न्यूक्लिओटाइड के 2′-ओ-मेथिलेशन जैसे संशोधनों का विश्लेषण नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, DNAzyme पर निर्भर दरार12 की कम दक्षता पर विचार किया जाना चाहिए. यद्यपि कुछ DNAzymes cleave RNA लगभग पूरी तरह से (चित्र 3B) कई DNAzymes केवल आंशिक रूप से अपने लक्ष्य ों को पचाने (चित्र 3ख) . दक्षता दरार साइट के आसपास के अनुक्रम पर निर्भर हो सकता है. उदाहरण के लिए, एक ही न्यूक्लिओटाइड के खंडों वाले आरएनए क्षेत्र DNAzyme सक्रिय अनुक्रम की सही स्थिति को प्रभावित कर सकते हैं। इसके अलावा, आरएनए क्षेत्रों मजबूत माध्यमिक संरचना बनाने फिर से संकर ासाकीना और लक्ष्य अनुक्रम के लिए DNAzyme बाइंडिंग को दबा सकते हैं. इन मुद्दों पर काबू पाने के लिए, 10-23 DNAzyme और उसके आरएनए सब्सट्रेट के हीटिंग और ठंडा करने के चक्र18लागू किया जा सकता है।
हम DNAzyme दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया जांच करने के लिए 2′-O-methylation के RNA. कोई भी इस तकनीक का उपयोग अन्य आरएनए संशोधनों का विश्लेषण करने के लिए भी कर सकता है, जैसे N6-मेथिलडेनोसाइन19. रिबोसोमल आरएनए, इसकी बहुतायत के कारण, इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है और क्लीवेज उत्पादों को यूवी प्रकाश के तहत कल्पना की जा सकती है। तथापि, यह आरएनए पॉलिमरेज II-जनरेट किए गए कोडिंग आरएनए (एमआरएनए) और गैर-कोडिंग आरएनए (एनएनआरएनए) जैसे कम प्रचुर मात्रा में आरएनए के लिए लागू नहीं है। इन आरएनए आमतौर पर agarose या polyacrylamide जैल में आरएनए धुंधला द्वारा सीधे पता नहीं किया जा सकता है. ऐसे मामलों में, DNAzyme-निर्भर दरार उत्तरी blotting द्वारा कल्पना की जा सकती है, परोक्ष रूप से पीसीआर द्वारा पता लगाया / मात्रात्मक पीसीआर द्वारा polymerases के साथ विश्लेषण (जैसे, KlenTak डीएनए पॉलिमरेज) 2 से भेदभाव करने में सक्षम-O-मिथाइल आरएनए अमेथिलित आरएनए20,21.
The authors have nothing to disclose.
हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए माया विल्सन और Aneika Leney धन्यवाद. इस काम को वेलकम ट्रस्ट और रॉयल सोसायटी द्वारा संयुक्त रूप से वित्त पोषित एक सर हेनरी डेल फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था (200473/
Chemicals | |||
Acid phenol | SIGMA | P4682 | |
Agarose | VWR | A2114 | |
Ammonium acetate | SIGMA | A1542 | |
Chlorophorm | Fisher scientific | 10293850 | |
DNase/RNase free water | Fischer Scientific | 10526945 | |
DNAzyme | Integrated DNA Technology | Custom oligo DNA | |
EDTA | SIGMA | E9884 | |
Ethanol Absolute | Fisher scientific | 10437341 | |
Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
Formamide | sigma | F9037 | |
Galactose | SIGMA | G0750 | |
Gel Loading Dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
Glucose | SIGMA | G7021 | |
Glycogen | Thermo Fisher Scientific | R0561 | |
HEPES | SIGMA | H3375 | |
Isoamyl | SIGMA | W205702 | |
KCl | SIGMA | P9333 | |
MgCl2 | SIGMA | M8266 | |
MnCl2 | SIGMA | 244589 | |
MOPS | SIGMA | M1254 | |
NaCl | SIGMA | S7653 | |
Oxoid Peptone Bacteriological | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
Oxoid Yeast Extract Powder | Thermo Fisher Scientific | LP0021 | |
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | EO0382 | |
SDS | SIGMA | 74255 | |
Sodium acetate trihydrate | SIGMA | S8625 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
Tris base | SIGMA | TRIS-RO | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
1.5 mL microtubes | Sarstedt | ||
152VR5C01M -80°C freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
250 mL Erlenmeyer flasks | Cole-Parmer | ||
50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
Combicup VX200 vortex | Appleton Woods | ||
DS-11 microspectrophotometer | Denovix | ||
Electrophoresis chamber (20 cm tray) | SIGMA | ||
FiveEasy F20 pH meter | Appleton Woods | ||
Gel documentation system | Syngene | ||
Heraeus Fresco 21 micro centrifuge | Fisher Scientific | ||
Megafuge 8R centrifuge with rotator suitable for 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | ||
Mini Fuge Plus mini centrifuge | Starlab | ||
Mixer HC thermal block | Starlab | ||
OLS26 Shaking Water Bath | Grant | ||
PowerPac power supplier | BioRad |