Her presenterer vi en protokoll for DNAzyme-avhengig kløft av RNA. Dette muliggjør rask og nettsteds avhengig analyse av RNA 2 ‘-O-metylering. Denne tilnærmingen kan brukes for den foreløpige eller større vurderingen av snoRNA aktivitet.
Guide boks C/D liten nucleolar RNAs (snoRNAs) katalysere 2 ‘-O-metylering av ribosomal og små kjernefysiske RNA. Et stort antall snoRNA i høyere Landplantenes kan imidlertid promiscuously gjenkjenne andre RNA-arter og 2 ‘-O-methylate flere mål. Her gir vi steg-for-steg guide for rask og ikke-kostbar analyse av de områdespesifikke 2 ‘-O-metylering ved hjelp av en veletablert metode ansette kort DNA oligonukleotider kalt DNAzymes. Disse DNA-fragmentene inneholder katalysator som Cleave RNA på bestemte konsensus posisjoner, samt variable homologi armer regissere DNAzyme til sine RNA mål. DNAzyme aktivitet er hemmet av 2-‘ O-metylering av nukleotid ved siden av kløften i RNA. Således, DNAzymes, begrenset bare av konsensus av kløyvde sekvensen, er perfekte verktøy for rask analyse av snoRNA-mediert RNA 2 ‘-O-metylering. Vi analyserte snoRNA snR13-og snR47 2 ‘-O-metylering av 25S ribosomal RNA i Saccharomyces cerevisiae for å demonstrere enkelheten i teknikken og for å gi en detaljert protokoll for DNAzyme-avhengige analysen.
RNA modifikasjoner spiller en viktig rolle i regulering av genuttrykk. RNA 2 ‘-O-metylering og pseudouridylation, som styres av boks C/D og boks H/ACA Small nucleolar RNAs (snoRNAs) henholdsvis, beskytter RNA fra fornedrelse og stabiliserer deres høyere-Order strukturer1,2,3 . SnoRNA mål har blitt identifisert hovedsakelig i ribosomal RNAs (rRNA) og små kjernefysiske RNAs (snRNAs). Imidlertid, inne høyere Landplantenes, der er muligheter flere hundre av snoRNA med nei bestemt funksjonene og noen av seg kanskje anerkjenne mangfoldig RNAs1,4,5,6,7. Derfor metoder som tillater identifisering og analyse av snoRNA-guidede modifikasjoner er viktige verktøy i å avdekke mekanismer som regulerer cellulære prosesser.
En boks C/D snoRNA-guidet antatte 2 ‘-O-metylering området kan identifiseres bioinformatically og bekreftet eksperimentelt av mange teknikker, inkludert RNase H-regissert kløft, eller område-spesifikke og Genova-brede metoder, som benytter omvendt transkripsjon i lav nukleotider (dNTPs) konsentrasjon tilnærming8,9,10,11. Disse teknikkene er svært følsomme, men også arbeidskrevende og kostbart, derfor kan ikke være egnet for den innledende eller rask testing. En av de enkleste og rimelige metoder for å identifisere 2 ‘-O-metylering nettsteder er DNAzyme-avhengig RNA kløft12. DNAzymes er korte, enkelt-strandet og katalytisk aktive DNA molekyler i stand til endonucleolytic kløft av RNA på bestemte posisjoner. De består av en bevart og katalytisk aktiv kjerne sekvens og 5 ‘ og 3 ‘ bindende armer bestående av variable sekvenser utformet for å hybridize av Watson-Crick base-sammenkobling med RNA målet (figur 1). Således leverer de 5 ‘ og 3 ‘ armene katalysatoren til den spesifikke RNA-siden. DNAzyme-avhengig kløft er hemmet av 2 ‘-O-metylering av nukleotid plassert direkte oppstrøms av kløften området12,13. Dette gjør DNAzymes svært praktiske verktøy for analyse av antatte eller kjente RNA 2 ‘-O-metylering nettsteder.
To typer DNAzymes brukes til RNA modifikasjoner analyser12. Den aktive sekvensen av 10-23 DNAzyme (figur 1a) består av 15 nukleotider (5 ‘ RGGCTAGCTACAACGA3 ‘) som danner en løkke rundt den målrettede RNA purine-PYRIMIDIN (ry) dinucleotide og katalysere kløften mellom disse to nukleotider. RNA-purine (R) er ikke koblet sammen med DNAzyme, og de 2 ‘-O-metylering presenterer på DNAzyme hemmer kløften. Den bindende armene på 10-23 DNAzymes er vanligvis 10-15 nukleotider lang. Den andre DNAzyme klassen, 8-17 DNAzymes (figur 1B) inneholder 14-nukleotid katalysator (5 ‘ TCCGAGCCGGACGA3 ‘). Nukleotider C2, c3 og g4 par med C9 G10 og g11 danner en kort stilk-løkke struktur. 8-17 DNAzymes Cleave RNA oppstrøms for alle Guanin som er ufullkomment sammenkoblet med den første thymine fra DNAzyme aktive sekvens. RNA-nukleotid oppstrøms for Guanin er ikke base-sammenkoblet med DNAzyme, og dens 2-O-metylering svekker kløften. 8-17 DNAzymes krever lengre homologi armer på rundt 20 nukleotider for å dirigere DNAzyme til sin spesifikke sekvens.
Her gir vi en trinnvis protokoll for analysen av 2 ‘-O-metylering av rRNA i Saccharomyces cerevisiae ved hjelp av 10-23 og 8-17 DNAzyme-avhengige tilnærminger12,13 (figur 1C). Denne protokollen kan enkelt tilpasses for andre organismer og RNA arter og ansatt for rask, foreløpig eller større analyser av nettstedet-spesifikke RNA 2 ‘-O-metylering.
DNAzyme-avhengig fordøyelse kan brukes som en enkel og rask metode for å analysere nettstedets spesifikke RNA 2 ‘-O-metylering12,13. DNAzymes holde RNA hvis nukleotid oppstrøms av kløften er ikke denaturert. I motsetning til andre tilnærminger, inkludert RNase H-regissert fordøyelse, alkalisk degradering eller omvendt transkripsjon i lav nukleotider konsentrasjon etterfulgt av kvantitative PCR eller sekvensering8,10,11 ,16, DNAzyme tilnærming krever en enkel DNA oligonukleotid og grunnleggende reagenser som er til stede i noen molekylærbiologi laboratorium. Videre kan DNAzymes brukes på en lignende måte å analysere RNA pseudouridylation mediert av boksen H/ACA snoRNA12, noe som gjør dem allsidige verktøy i å studere snoRNA mål.
DNAzyme-avhengige tilnærminger er begrenset bare av en kløft sted konsensus sekvenser17. 10-23 DNAzymes kan brukes til å analysere 2 ‘-O-metylering bare i posisjon R i RY-dinucleotide, mens 8-17 DNAzymes gjenkjenner endringen av nukleotid som ligger oppstrøms for Guanin. Som et resultat kan ikke endringer som 2 ‘-O-metylering i den første nukleotid i dinucleotides Guanin-adenine (GA), adenine-adenine (AA), pyrimidin-adenine (YA) og pyrimidin-pyrimidin (YY) analyseres. Videre bør den lave effektiviteten av DNAzyme-avhengige kløft12 vurderes. Selv om noen DNAzymes Cleave RNA nesten helt (figur 3b), mange DNAzymes bare delvis fordøye sine mål (figur 3b). Effektiviteten kan avhenge av sekvensen rundt kløften området. RNA-regioner med strekninger av samme nukleotid kan for eksempel påvirke riktig plassering av DNAzyme aktive sekvens. Videre kan RNA-regioner som danner sterk sekundær struktur, hybridize på nytt og undertrykke DNAzyme-binding til mål sekvensen. For å overkomme disse problemene, kan sykluser av oppvarming og kjøling av 10-23-DNAzyme og RNA-underlaget anvendes18.
Vi brukte DNAzyme tilnærming for å undersøke 2 ‘-O-metylering av rRNA. Man kan også bruke denne teknikken til å analysere andre RNA-modifikasjoner, for eksempel N6-methyladenosine19. Ribosomal RNA, på grunn av sin overflod, kan analyseres av elektroforese, og det kan være et eksempel på kløften under UV-lyset. Dette gjelder imidlertid ikke for mindre rikelig RNAs som RNA polymerase II-generert koding RNAs (mRNA) og ikke-koding RNAs (ncRNA). Disse RNAs kan vanligvis ikke oppdages direkte ved RNA farging i agarose eller polyakrylamid gels. I slike tilfeller kan DNAzyme-avhengige kløft være et eksempel på Nord-blotting, som indirekte oppdages av PCR/kvantitativ PCR eller analyseres av kvantitativ PCR med polymerases (for eksempel KlenTaq DNA polymerase) som kan diskriminerende 2 ‘-O-denaturert RNA fra metylerte RNA20,21.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Maya Wilson og Aneika Leney for kritisk lesning av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av en Sir Henry Dale Fellowship i fellesskap finansiert av Wellcome Trust og Royal Society (200473/Z/16/Z).
Chemicals | |||
Acid phenol | SIGMA | P4682 | |
Agarose | VWR | A2114 | |
Ammonium acetate | SIGMA | A1542 | |
Chlorophorm | Fisher scientific | 10293850 | |
DNase/RNase free water | Fischer Scientific | 10526945 | |
DNAzyme | Integrated DNA Technology | Custom oligo DNA | |
EDTA | SIGMA | E9884 | |
Ethanol Absolute | Fisher scientific | 10437341 | |
Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
Formamide | sigma | F9037 | |
Galactose | SIGMA | G0750 | |
Gel Loading Dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
Glucose | SIGMA | G7021 | |
Glycogen | Thermo Fisher Scientific | R0561 | |
HEPES | SIGMA | H3375 | |
Isoamyl | SIGMA | W205702 | |
KCl | SIGMA | P9333 | |
MgCl2 | SIGMA | M8266 | |
MnCl2 | SIGMA | 244589 | |
MOPS | SIGMA | M1254 | |
NaCl | SIGMA | S7653 | |
Oxoid Peptone Bacteriological | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
Oxoid Yeast Extract Powder | Thermo Fisher Scientific | LP0021 | |
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | EO0382 | |
SDS | SIGMA | 74255 | |
Sodium acetate trihydrate | SIGMA | S8625 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
Tris base | SIGMA | TRIS-RO | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
1.5 mL microtubes | Sarstedt | ||
152VR5C01M -80°C freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
250 mL Erlenmeyer flasks | Cole-Parmer | ||
50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
Combicup VX200 vortex | Appleton Woods | ||
DS-11 microspectrophotometer | Denovix | ||
Electrophoresis chamber (20 cm tray) | SIGMA | ||
FiveEasy F20 pH meter | Appleton Woods | ||
Gel documentation system | Syngene | ||
Heraeus Fresco 21 micro centrifuge | Fisher Scientific | ||
Megafuge 8R centrifuge with rotator suitable for 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | ||
Mini Fuge Plus mini centrifuge | Starlab | ||
Mixer HC thermal block | Starlab | ||
OLS26 Shaking Water Bath | Grant | ||
PowerPac power supplier | BioRad |