Här presenterar vi ett protokoll för DNAzyme-beroende klyvning av RNA. Detta möjliggör snabb och plats beroende analys av RNA 2 ‘-O-metylering. Denna metod kan användas för den preliminära eller större bedömningen av snoRNA aktivitet.
Guide Box C/D liten nukleolära rnas (snornas) katalysera 2 ‘-O-metylering av ribosomal och små nukleära RNA. Emellertid, ett stort antal snoRNA i högre Eukaryoter kan promiscuously erkänna andra RNA arter och 2 ‘-O-metylera flera mål. Här, vi ger steg-för-steg guide för snabb och icke-dyr analys av platsspecifika 2 ‘-O-metylering med hjälp av en väl etablerad metod att anställa korta DNA oligonukleotides kallas DNAzymes. Dessa DNA-fragment innehåller katalytiska sekvenser som klyver RNA vid specifika kon sen SUS positioner, samt variabla homologiska armar som riktar DNAzyme till dess RNA-mål. DNAzyme aktivitet hämmas av 2-‘ O-metylering av nukleotid intill klyvning plats i RNA. Sålunda, dnazymes, begränsas endast av konsensus i klyvs sekvens, är perfekta verktyg för snabb analys av snorna-medierad RNA 2 ‘-O-metylering. Vi analyserade snoRNA snR13-och snR47-guidad 2 ‘-O-metylering av 25S ribosomalt RNA i Saccharomyces cerevisiae att demonstrera enkelheten i tekniken och att ge ett detaljerat protokoll för DNAzyme-beroende analysen.
RNA-ändringar leker viktiga roller i regleringen av genuttryck. RNA 2 ‘-O-metylering och pseudouridylation, som styrs av Box C/D och Box H/ACA små nukleolära rnas (snorna) respektive, skydda RNA från nedbrytning och stabilisera deras högre ordningens strukturer1,2,3 . SnoRNA mål har identifierats främst i ribosomal RNAs (rRNA) och små nukleära RNAs (snRNAs). Men i högre Eukaryoter, det finns potentiellt hundratals snorna utan tilldelade funktioner och några av dem kan känna igen flera rnas1,4,5,6,7. Därför är metoder som möjliggör identifiering och analys av snoRNA-guidade modifieringar viktiga verktyg i att avslöja mekanismer som reglerar cellulära processer.
En ruta C/D snorna-guidad förmodade 2 ‘-O-metylering plats kan identifieras bioinformatiskt och bekräftas experimentellt av många tekniker, inklusive RNase H-riktad klyvning, eller platsspecifika och genomhela metoder, som sysselsätter omvänd Transkription i låga nukleotider (dNTPs) koncentrations metod8,9,10,11. Dessa tekniker är mycket känsliga men också mödosamma och dyra, därför, kanske inte lämpar sig för den inledande eller snabb testning. En av de enklaste och lågkostnads metoder för att identifiera 2 ‘-O-metylering platser är DNAzyme-beroende RNA klyvning12. DNAzymes är korta, enkelsträngade och katalytiskt aktiva DNA-molekyler som kan endonukleolytiska klyvning av RNA vid specifika positioner. De består av en bevarad och katalytiskt aktiv kärnsekvens och 5 ‘ och 3 ‘ bindnings armar som består av variabla sekvenser konstruerade för att hybridisera av Watson-Crick Base-para ihop till RNA-målet (figur 1). Sålunda, 5 “och 3” armar leverera katalytisk sekvens till den specifika RNA platsen. Dnazyme-beroende klyvning hämmas av 2 ‘-O-metylering av nukleotiden placerad direkt uppströms klyvning plats12,13. Detta gör dnazymes mycket praktiska verktyg för analys av förmodade eller kända RNA 2 ‘-O-metylering platser.
Två typer av DNAzymes används för RNA-modifieringar analyser12. Den aktiva sekvensen av 10-23 DNAzyme (figur 1a) består av 15 nukleotider (5 ‘ RGGCTAGCTACAACGA3 ‘) som bildar en slinga runt den riktade RNA purin-pyrimidin (ry) dinucleo tid och katalysera klyvning mellan dessa två nukleotider. RNA purin (R) är inte Base-parade med DNAzyme och 2 ‘-O-metylering presenterar på DNAzyme hämmar klyvning. Det bindande beväpnar av 10-23 dnazymes är vanligt 10-15 nukleotider Long. Den andra DNAzyme-klassen, 8-17 DNAzymes (figur 1b) innehåller 14-nukleotidkatalytisk sekvens (5 ‘ TCCGAGCCGGACGA3 ‘). Nukleotider C2, c3 och g4 par med c9 G10 och g11 bildar en kort stam-loop struktur. 8-17 DNAzymes klyva RNA uppströms någon guanin som är ofullständigt ihopkopplad med den första tymin från DNAzyme aktiv sekvens. RNA-nukleotiden uppströms guanin är inte Base-parade med DNAzyme och dess 2 ‘-O-metylering försämrar klyvning. 8-17 DNAzymes kräver längre homologi armar av cirka 20 nukleotider att rikta DNAzyme till dess specifika sekvens.
Här ger vi ett steg-för-steg-protokoll för analys av 2 ‘-O-metylering av rRNA i Saccharomyces cerevisiae med 10-23 och 8-17 dnazyme-beroende metoder12,13 (figur 1c). Detta protokoll kan lätt anpassas för andra organismer och RNA-arter och används för snabba, preliminära eller större analyser av platsspecifik RNA 2-O-metylering.
Dnazyme-beroende matsmältning kan användas som en enkel och snabb metod för att analysera platsspecifika RNA 2 ‘-O-metylering12,13. DNAzymes klyva RNA om nukleotiden uppströms den klyvning platsen inte är metylerat. I motsats till andra metoder, inklusive RNase H-riktad matsmältning, alkalisk nedbrytning eller omvänd Transkription i låga nukleotider koncentration följt av kvantitativ PCR eller sekvensering8,10,11 ,16, dnazyme tillvägagångssätt kräver en enkel DNA oligonukleotid och grundläggande reagens som finns i någon molekylär biologi laboratorium. Dessutom kan DNAzymes användas på ett liknande sätt att analysera RNA pseudouridylation medierad av Box H/ACA snoRNA12, vilket gör dem mångsidiga verktyg för att studera snorna mål.
DNAzyme-beroende metoder begränsas bara av klyvning plats konsensus sekvenser17. 10-23 DNAzymes kan användas för att analysera 2 ‘-O-metylering endast vid position R av RY dinucleotide, medan 8-17 DNAzymes erkänna modifiering av nukleotid ligger uppströms guanin. Som ett resultat, modifieringar som 2 ‘-O-metylering av den första nukleotid i dinucleotides guanin-Adenine (GA), adenin-adenin (AA), pyrimidin-adenin (YA) och pyrimidin-pyrimidin (YY) kan inte analyseras. Dessutom bör den låga effektiviteten av DNAzyme-beroende klyvning12 övervägas. Även om vissa DNAzymes klyva RNA nästan helt (figur 3b), många dnazymes bara delvis smälta sina mål (figur 3b). Effektiviteten kan bero på sekvensen som omger klyvning platsen. Till exempel, RNA-regioner med sträckor av samma nukleotid kan påverka korrekt positionering av DNAzyme aktiv sekvens. Dessutom kan RNA-regioner som bildar stark sekundär struktur åter hybridisera och undertrycka DNAzyme bindning till målsekvensen. För att övervinna dessa frågor, cykler av uppvärmning och kylning av 10-23 DNAzyme och dess RNA-substrat kan tillämpas18.
Vi använde DNAzyme metod för att undersöka 2 ‘-O-metylering av rRNA. Man kan också använda denna teknik för att analysera andra RNA-modifieringar, såsom N6-methyladenosine19. Ribosomal RNA, på grund av dess överflöd, kan analyseras genom elektrofores och klyvning produkter kan visualiseras under UV-ljus. Detta gäller dock inte för mindre riklig RNAs som RNA-polymeras II-genererade kodning RNAs (mRNA) och icke-kodning RNAs (ncRNA). Dessa RNAs kan vanligtvis inte detekteras direkt genom RNA-färgning i Agor eller polyakrylamidgeler. I sådana fall kan DNAzyme-beroende klyvning visualiseras av nordliga blotting, indirekt detekteras av PCR/kvantitativ PCR eller analyseras med kvantitativ PCR med polymeraser (t. ex., KlenTaq DNA-polymeras) som kan diskriminera 2 ′-O-metylerat RNA från ometylerat RNA20,21.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Maya Wilson och Aneika Leney för den kritiska läsningen av manuskriptet. Detta arbete stöddes av en Sir Henry Dale Fellowship finansieras gemensamt av Wellcome Trust och Royal Society (200473/Z/16/Z).
Chemicals | |||
Acid phenol | SIGMA | P4682 | |
Agarose | VWR | A2114 | |
Ammonium acetate | SIGMA | A1542 | |
Chlorophorm | Fisher scientific | 10293850 | |
DNase/RNase free water | Fischer Scientific | 10526945 | |
DNAzyme | Integrated DNA Technology | Custom oligo DNA | |
EDTA | SIGMA | E9884 | |
Ethanol Absolute | Fisher scientific | 10437341 | |
Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
Formamide | sigma | F9037 | |
Galactose | SIGMA | G0750 | |
Gel Loading Dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
Glucose | SIGMA | G7021 | |
Glycogen | Thermo Fisher Scientific | R0561 | |
HEPES | SIGMA | H3375 | |
Isoamyl | SIGMA | W205702 | |
KCl | SIGMA | P9333 | |
MgCl2 | SIGMA | M8266 | |
MnCl2 | SIGMA | 244589 | |
MOPS | SIGMA | M1254 | |
NaCl | SIGMA | S7653 | |
Oxoid Peptone Bacteriological | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
Oxoid Yeast Extract Powder | Thermo Fisher Scientific | LP0021 | |
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | EO0382 | |
SDS | SIGMA | 74255 | |
Sodium acetate trihydrate | SIGMA | S8625 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
Tris base | SIGMA | TRIS-RO | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
1.5 mL microtubes | Sarstedt | ||
152VR5C01M -80°C freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
250 mL Erlenmeyer flasks | Cole-Parmer | ||
50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
Combicup VX200 vortex | Appleton Woods | ||
DS-11 microspectrophotometer | Denovix | ||
Electrophoresis chamber (20 cm tray) | SIGMA | ||
FiveEasy F20 pH meter | Appleton Woods | ||
Gel documentation system | Syngene | ||
Heraeus Fresco 21 micro centrifuge | Fisher Scientific | ||
Megafuge 8R centrifuge with rotator suitable for 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | ||
Mini Fuge Plus mini centrifuge | Starlab | ||
Mixer HC thermal block | Starlab | ||
OLS26 Shaking Water Bath | Grant | ||
PowerPac power supplier | BioRad |