Her beskrives en protokol til kontinuerlig blodprøvetagning under PET/CT-scanning af rotter til måling af den arterielle indgangsfunktion (AIF). Kateteriseringen, kalibrering og opsætning af systemet og dataanalyse af blodets radioaktivitet er påvist. De genererede data giver inputparametre for efterfølgende bio-Kinetic modellering.
For kvantitativ analyse og bio-kinetisk modellering af Positron emission tomografi/computertomografi (PET/CT) data, bestemmelse af den tidsmæssige blod tid-aktivitet koncentration også kendt som arteriel inputfunktion (AIF) er et centralt punkt, især til karakterisering af dyre sygdomsmodeller og indførelse af nyudviklede radiotracers. Kendskabet til radiotracer tilgængelighed i blodet hjælper med at fortolke PET/CT-afledte data for vævs aktivitet. Til dette formål er det tilrådeligt at måle AIF i forbindelse med blodprøvetagning på internettet under PET/CT-billeddannelse. I modsætning til manuelle blodprøvetagning og image-afledte tilgange, kontinuerlig online blodprøvetagning har flere fordele. Udover den minimerede blodtab, der er en forbedret opløsning og en overlegen nøjagtighed for blod aktivitet måling. Men den største ulempe ved online blodprøvetagning er den dyre og tidskrævende forberedelse til at kateterisere de femorale fartøjer af dyret. Her beskriver vi en nem og komplet arbejdsgang for kateterisering og kontinuerlig blodprøvetagning under små dyr PET/CT Imaging og sammenlignede det med manuel blodprøvetagning og en image-afledte tilgang. Ved hjælp af denne meget standardiserede arbejdsgang påvises bestemmelsen af responserne ([18F] FDG) AIF. Desuden kan denne procedure anvendes på enhver radiotracer i kombination med forskellige dyremodeller for at skabe grundlæggende viden om sporstof kinetiske og model karakteristika. Dette giver mulighed for en mere præcis evaluering af adfærden af lægemidler, både til diagnostiske og terapeutiske tilgange i den prækliniske forskning af onkologiske, neurodegenerative og Myokardie sygdomme.
Positron emission tomografi/computertomografi (PET/CT) er en nuklear billedteknologi, der muliggør visualisering af metaboliske processer i kroppen efter injektion af et radioaktivt mærket ligand, også kaldet Tracer. Der henviser til, at ligand er et molekyle, der er involveret i en metabolisk vej eller mål celleoverflade proteiner, det radioaktive mærke er en positron-emitterende radionukleid. Gamma stråler udsendes indirekte af Positron forfald og tillader påvisning af dets fordeling i organismen med ekstrorporeal PET-detektorer. På denne måde kan forskellige cellulære molekyler målrettes: neurotransmitter receptorer og transportører, metaboliske processer som glykolyse eller mitokondrie proteiner som translocator protein 18 kDa (TSPO) at detektere aktiverede glia celler.
I præklinisk forskning er PET/CT en attraktiv metode til at studere biokemiske processer på en ikke-invasiv måde in vivo, hvilket giver mulighed for longitudinale undersøgelser. PET/CT-data understøtter analyser af sygdomsmekanismer, vurdering af nye lægemidler, karakteristika og farmakokinetik samt validering af både nuværende og nye aktive til Translationel forskning.
Under PET/CT-analyser kan der defineres tre Tracer-tilstande (eksempel på modellen med 2-vævs rum): for det første strømmer sporingen i blodet efter påføring (tilstand 1; Konc.[blod]). For det andet, det kommer ind i vævet via kapillær sengen og kan der enten frit bevæge sig inden for det ekstracellulære rum eller er uspecifikt bundet til forskellige cellulære eller ekstrellulære strukturer (tilstand 2; conc.[unspec]). For det tredje kan sporstoffet være specifikt bundet (med eller uden metabolisk diffusering) til dets målmole Kyle (tilstand 3, conc.[spec]). Alle disse dynamiske processer mellemrummene er til en vis grad tovejs, og diffusions processerne beskrives efter sats konstanter (K1, K2, K3 og K4). Mens koncentrationen af Tracer i blodet (dvs., tilstand 1) kaldes “input”, er koncentrationen af uspecifikt og specifikt bundet Tracer (dvs. tilstand 2 og stat 3) kaldes “output” og kan direkte udledes af PET-billedet. Denne fysiologiske relation kan vises i 2-vævs rummets model (figur 1).
Figur 1 : Den tovævs opdelte model. De fysiologiske forhold for de tre forskellige Tracer stater og de dynamiske processer mellem dem vises. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
I det ideelle tilfælde er conc.[spec] proportional med koncentrationen af dets målmole Kyle. Men, produktionen af PET/CT måling er summen af conc.[spec] og conc.[unspec]. For at fastlægge conc.[spec] i den region af interesse, parallelt med conc.[unspec] af et referenceområde blottet for målet protein/pathway bestemmes. Ved hjælp af passende matematiske ligninger kan man nu beregne conc.[spec], oftest ved hjælp af rummet model (en bio-Kinetic modellering tilgang). I mange tilfælde findes der imidlertid ikke en sådan reference region uden for målproteinet1,2. I disse tilfælde kan conc.[Blood] anvendes til at bestemme conc.[spec]. Da conc.[blod] varierer på grund af forskellige lever-og nyre clearance, udskillelse, blodgennemstrømning, forskellige hjerne-blod barriere penetration og sygdomsrelaterede faktorer3, den nuværende guld standard er at måle conc.[ i blodet] parallelt med PET/CT-scanningen ved kontinuerlig blodprøvetagning. Dette giver den arterielle indgangsfunktion (AIF), som er defineret som conc.[Blood] over tid4. Bemærk, at udføre kontinuerlig blodprøvetagning anses teknisk meget udfordrende, især i små dyr som rotter eller mus5.
Her giver vi en nem og praktisk protokol til kontinuerligt at prøve blod fra rotter via en arteriovenøs (a-v) shunt mellem femoral vene og arterie. Koblet til et kommercielt tilgængeligt detektor pumpesystem kan vi generere en løbende AIF i realtid under Dynamic [18f] fluorodeoxyglucose ([18f] FDG)-PET/CT-scanninger i rotter og sammenlignede det med alternative tilgange. PET/CT Imaging blev udført i mandlige Sprague dawley rotter i en alder af 4 måneder med en gennemsnitlig vægt på 462 g ± 33 g (gennemsnitlig ± standardafvigelse) ved hjælp af en multimodalitet PET/CT scanner.
Da der anvendes en lang række anordninger i løbet af rækken af målinger (dosis kalibrator, online blod prøvetageren, PET/CT og Well Counter), er der behov for en kvalitetskontrolprocedure, der betegnes som kryds kalibrering, for at kontrollere den kvantitative nøjagtighed af alle systemer og for at kompensere for forskelle. Kryds kalibrering i forbindelse med online blodprøvetagning betyder, at tælle hastigheden for en given aktivitetskoncentration målt i korrigerede PET-billeder kan konverteres til den koncentration, der måles med twilite-systemet for den samme koncentration. Der er derfor fastlagt en kryds kalibreringsprocedure mellem PET/CT, blod prøvetagningssystem og brønd tæller.
Denne meget standardiserede metode giver en effektiv tilgang til kvantificering af metaboliske og cellulære processer i prækliniske smådyrs forskning og er en elegant måde at forbedre pålideligheden og reproducerbarhed af AIF. AIF kan derefter anvendes til at kvantificere den specifikt bundne Tracer i væv i prækliniske PET/CT-data ved hjælp af bio-kinetisk modellering.
De præsenterede resultater udvindes fra et større projekt om neuronal aktivitet i en transgene dyremodel af Huntingtons sygdom sammenlignet med dværg rotter. I alt 30 transgene og dværg rotter blev kateteriseret og manuel og online blodprøvetagning parallelt med [18F] FDG-PET/CT blev udført. Tre AIF’er af dværg rotter er vist her for at demonstrere rækken af mulige udfald af protokollen. Resultaterne af det komplette projekt om ændringer i neuronal aktivitet i en dyremodel af Huntingtons sygdom vil blive offentliggjort andetsteds.
Den her beskrevne metode muliggør hurtig og præcis kontinuerlig blodprøvetagning i en stor kohorte og giver en uden pauser AIF til kinetisk modellering af dynamiske PET/CT-data i små dyr. En ekstern blodcirkulation genereres for at detektere faktiske tids aktivitet i blodet af dyrene; derfor undgås et blodtab. Den kirurgiske procedure er baseret på Jespersen et al.8 og blev modificeret til at opfylde behovene for arteriel blodprøvetagning under PET/CT-målingerne. Shunt-systemet blev valideret af Weber et al.9. Med den her anvendte opsætning løber et eksternt blodvolumen på ca. 1,1 mL gennem detektor pumpesystemet. En rotte i alderen 4 måneder har et samlet blodvolumen på ca. 30 mL. Diameteren af femoral vene og arterie er ca. 0,45-0,6 mm10 og skal være lidt stivet at indsætte kateteret anvendes.
AIF’EN kan også måles via sporadisk manuel blodindsamling eller rekonstrueres fra tidlige tidspunkter af selve PET-billederne (billed afledt). Begge tilgange blev udført med her præsenterede data og sammenlignet med den kontinuerlige blodprøvetagning.
I forhold til manuel blodprøvetagning, med online blodprøvetagning en mærkbar højere tidsmæssig opløsning (her: 1800 datapunkter pr 30 min) bliver muligt. Manuelle blod trækninger (her: 5 datapunkter pr. 30 min) er begrænset til det blodvolumen, der er til stede i det lille dyr, da disse prøver ikke pumpes tilbage i dyrets cirkulation. Desuden er et maksimuminterval på 10-15 s teknisk gennemførlig, og vigtige oplysninger om kinetisk modellering glemmes. Dette kan også ses i de præsenterede data, som en forskel i den detekterede maksimale af kontinuerlig og manuel blodprøvetagning er indlysende (figur 3a, C, E). Med online blodprøvetagning den detekterede peak var højere end med den billed-afledte inputfunktion af opstigende aorta11 (figur 3B, D, F). Den Imaged-afledte inputfunktion er begrænset til den rumlige opløsning af PET-scannere, som resulterer i delvise volumen effekter12 og påvirkes af de rekonstruerede tidsrammer.
En generel fordel ved denne kontinuerlige blodprøve udtagnings procedure er, at traceren kan påføres via kateteret, som er mindre tilbøjelig til forstyrrelse end injektion via den laterale hale vene. Vær opmærksom på, at traceren skal påføres i moderat volumen for at forhindre, at sporstoffet forbliver i begyndelsen af rørsystemet. For at sikre, at der ikke er nogen aktivitet tilbage i T-stykkets Dead Volume, skylles den med hepariniseret saltvandsopløsning bagefter. Desuden tilrådes brug af en infusionspumpe, da det muliggør justering af hastigheden af Tracer injektion og kan bidrage til mere koordineret erhvervelse af den maksimale radioaktivitet peak med manuel blodprøvetagning13.
Der er et par mulige problemer, der kan opstå under protokol behandling og kan håndteres ved følgende fejlfinding. En sub-optimal placering af katetre kan føre til en ufuldstændig udførelse af protokollen, derfor sikre, at de er nøjagtigt fastgjort med den proksimale sutur, og at kateteret skubbes 2-3 cm proksimalt ind i beholderen. Derudover kan fibrin lim anvendes. Dannelsen af trombi kan også tilstoppe katetre. Dette kan håndteres ved at øge heparin koncentrationen og efterfølgende rødmen af katetre eller rørsystemet. Et sådant suboptimalt udfald som følge af tilstopning af katetre er vist i resultaterne, den maksimale peak er savnet (figur 3E). Et andet kritisk punkt vedrørende dyrebeskyttelse og trivsel er længden af den ekstrudorporeale blodgennemstrømning. Det foreslås derfor at reducere rørsystemets længde til et minimum.
Når blodprøvetagning udføres, skal der tages hensyn til tre korrektioner af den resulterende AIF. For det første, plasma korrektion. Tracers ækvibrere mellem plasma og blodlegemer, hovedsageligt erythrocytter. Afhængigt af hvor hurtigt disse diffusions processer er, er den tilgængelige Tracer hovedsageligt til stede i plasma. For nogle røbestoffer, forholdet mellem plasma til fuldblod skal overvejes, såsom flere lipofile dem. I disse tilfælde skal plasma aktiviteten bestemmes. Hvis der anvendes [18f] FDG, er det ikke nødvendigt at centrifugeres i blodet for at bestemme plasma aktiviteten, da den er meget hurtig, når den er i balance mellem plasma og røde blodlegemer, og tilgængeligheden af [18f] FDG i plasma svarer til den i hele blodet. For det andet, metabolitten korrektion. Mange røbestoffer metaboliseres i fuldblod, og nogle af disse metabolitter er stadig radioaktivt mærket14. Denne fraktion er til stede i AIF, men er ikke tilgængelig for vævs optagelse. For nogle røbestoffer skal metabolitter bestemmes i fuldblod eller plasma, og AIF’EN skal korrigeres. For det tredje, spredning korrektion. Dispersion er forårsaget af flere faktorer, herunder (a) den systematiske tidsforskel mellem sporernes ankomsttider i vævet i forhold til det perifere prøvetagningssted (forsinkelse korrektion) og (b) og udtværing af formen af AIF, som sporstof transport inden for rørsystemet påvirkes af dets første ordre forsinkelse (PT1) kinetik. Der er foreslået flere korrektioner baseret på dekoncentrering, hovedsagelig baseret på modellen fra Iida et al.15, men de fleste af dem er modtagelige for støj. En korrektionsmetode, der omgår dekoncentrering og derfor er mindre tilbøjelig til støj, er blevet foreslået af munk et al.16. De nødvendige målinger til beregning af korrektions parametrene skal udføres for hver kombination af slanger og sporstof, der anvendes. Dispersion korrektion bør ske før tidsforskydning korrektion17. Men hovedsageligt hurtige vævs perfusions processer påvirkes af dispersion, og det er også blevet påvist, at for modellering af [18F] FDG-undersøgelser er en dispersions korrektion ikke absolut nødvendig18. I de præsenterede eksempler er dispersions korrektionen af AIF derfor ikke blevet anvendt.
En korrekt kalibrering af dosis kalibratoren på stedet og den regelmæssige kvalitetskontrol er en forudsætning for den type kryds kalibreringsprocedure, der præsenteres her. Hvis den aktivitet, der administreres til dyret, måles med samme dosis kalibrator, annulleres enhver afvigelse i nøjagtighed dog, forudsat at afvigelsen er konstant, og at den komplette kryds kalibreringsprocedure er fulgt, herunder nuclid-specifikke korrektioner (f. eks. for varierende halveringstider eller forskellige forgrenings forhold). Ved hjælp af en sådan kalibreringsprocedure til harmonisering af PET/CT-systemer, der anvendes til sundhedspleje og forskning, kan der opnås en nøjagtighed på mindst 5-10%19,20.
De kalibrerede og korrigerede AIF’er, der genereres ved en vellykket gennemførelse af denne protokol, muliggør kvantificering af PET/CT-data til karakterisering af dyre sygdomsmodeller, afprøvning af nye behandlingsmuligheder, etablering af nye røbestoffer og overførsel af eksisterende røbestoffer til en anden art. Tilsyneladende, kontinuerlig blodprøvetagning i [18] FDG-PET/CT i rotter leverer de mest pålidelige oplysninger til beregning af input i Bio-Kinetic modellering. Ved at tage hensyn til det individuelle stofskifte, især lever clearance, er det muligt at vurdere de relevante patologiske eller terapeutiske virkninger mere præcist. Med denne gennemførlige protokol er en højere effektivitet af prækliniske dataanalyse af PET/CT let gennemførlig.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender taknemmeligt Susann Lehmann, Iloana Klamfuß og Petra Wolff for husdyravl og pleje og Matthias Wyss for støtte under etableringen af online blodprøvetagning system. PET/CT for små dyr blev finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (INST 2268/6-1 FUGG).
Sugery for arteriovenous shunt | |||
anesthesia station | Groppler | ||
aneurysm clips | Aesculap | FT190T | 5 mm, closing force 70 g |
bulldog clamp | Aesculap | 35 mm | |
dissectiong scissors BC165 | Aesculap | 490-866 | dull, for skin preparation |
heating mat | |||
insulin syringe | Braun | 30G | |
needle holder | medicon | 11.62.18 | micro surgical |
pliers for aneurysm clips | Aesculap | FT 470T | Yasargil |
portex fine bore polythene tubing | Smith Medical | 800/100/200 | ID 0.58 mm, OD 0.96 mm; PE50 equivalent tubing |
surgical microscope with camera | Leica | M50 + MC120 HD | |
suture filaments 6.0 | 6.0, polypropylene | ||
suture filaments 3.0 | 3.0, absorbable, braided | ||
two anatomical forceps | Hammacher Soling | HSC601-11 | micro surgery, 45° |
vascular or corneal scissors | Geuder | G19605 | micro surgery scissors |
PET/CT imaging | |||
dose calibrator ISOMED 2010 | nivia instruments GmbH | for tracer portioning | |
Inveon PET/CT | Siemens | ||
tracer (e.g. 18F-FDG) | |||
manuel bloodsampling | |||
capillary blood collection EDTA tube | KABE Labortechnik GmbH | GK 150 EDTA 200 µl | |
test tubes | SARSTEDT | 5 ml, 75 x 12 mm, PS | |
well counter CAPTUS 700t | Capintec | manuel measurement of blood activity | |
automatic blood sampling | |||
BD Venflon TM pro safety shielded IV catheter; 18 G (1.3 mm x 32 mm) | BD | 3932269 | luer connections (to fit in t-connections) |
bloodsampler twilite two | swisstrace GmbH | ||
combi stopper | Braun | 4495101 | |
heparin | 50U/ml for tube flushing before the experiment and aspiration during catheter surgery | ||
hypodermic needle | G23 x 1 1/4" / 0.6 x 30 mm | ||
microprocessor controlled tubing pump | Ismatec/Cole-Parmer | ISM596 | 12 rollers, 2 channels |
PSAMPLE modul of PMOD | PMOD | ||
reduction connectors | Ismatec/Cole-Parmer | ISM569A | from ID 2.5 mm to ID 1.5 mm |
silicone pump tubes | Ismatec/Cole-Parmer | 070535-17-ND /SC0065N | for roller pump (yellow/blue/yellow ID 1.52 mm, WT 0.84 mm, OD 3.2 mm) |
silicone pump tubes – adapter tubing | Ismatec/Cole-Parmer | SC 0107 | black/black/black ID 0.76 mm, WT 0.86 mm, OD: 2.48 mm |
t-piece or t-connections | Ismatec/Cole-Parmer | ISM 693A | ID 2.5 mm |