Här beskrivs ett protokoll för kontinuerlig blodprovstagning under PET/CT-avbildning av råttor för att mäta den arteriella inmatningsfunktionen (AIF). Kateterisering, kalibrering och inställning av systemet och dataanalys av blod radioaktivitet påvisas. De genererade data ger indataparametrar för efterföljande bio kinetisk modellering.
För kvantitativ analys och bio kinetisk modellering av positron emissions tomografi/datortomografi (PET/CT) data, bestämning av temporal blod tid-aktivitetskoncentration även känd som arteriell input funktion (AIF) är en viktig punkt, särskilt för karakterisering av djur sjukdomsmodeller och införandet av nyutvecklade radiotracers. Kunskapen om tillgängligheten av radiotracer i blodet hjälper till att tolka PET/CT-härledda data av vävnads aktivitet. För detta ändamål är blodprovstagning online under PET/CT-avbildning tillrådligt att mäta AIF-fonden. Till skillnad från manuell blodprovstagning och bild-härledda metoder, kontinuerlig online blodprovstagning har flera fördelar. Förutom den minimerade blodförlusten, det finns en förbättrad upplösning och en överlägsen noggrannhet för blod aktivitet mätning. Men den stora nackdelen med online blodprovstagning är den kostsamma och tidskrävande förberedelse för att kateterisera femorala fartyg av djuret. Här, vi beskriver ett enkelt och komplett arbetsflöde för kateterisering och kontinuerlig blodprovstagning under små djur PET/CT Imaging och jämförde den med manuell blodprovstagning och en bild-derived metod. Genom att använda detta mycket standardiserade arbetsflöde demonstreras bestämning av fluordeoxyglukos ([18F] FDG) AIF. Vidare kan detta förfarande tillämpas på alla radiotracer i kombination med olika djurmodeller för att skapa grundläggande kunskaper om tracerkinetiska och modellegenskaper. Detta möjliggör en mer exakt utvärdering av läkemedels beteende, både för diagnostiska och terapeutiska metoder i den prekliniska forskningen av onkologiska, neurodegenerativa och myokardiella sjukdomar.
Positron emissions tomografi/datortomografi (PET/CT) är en nukleär bildteknik som möjliggör visualisering av metaboliska processer i kroppen efter injektion av en radioaktiv märkt ligand, även kallad Tracer. Medan ligand är en molekyl som är involverad i en metabolisk väg eller riktar in sig på cellytan proteiner, är den radioaktiva etiketten en positron-Emitting radionuklid. Gamma strålar är indirekt avges av positron förfall och tillåta detektion av dess fördelning i organismen med extrakorporeal PET detektorer. På detta sätt kan olika cellulära molekyler riktas: signalsubstans receptorer och transportörer, metaboliska processer som glykolys eller mitokondriella proteiner som Translocator protein 18 kDa (TSPO) att upptäcka aktiverade glia celler.
I preklinisk forskning är PET/CT en attraktiv metod för att studera biokemiska processer på ett icke-invasiv sätt in vivo, vilket möjliggör longitudinella studier. PET/CT-data stöder analyser av sjukdomsmekanismer, bedömning av nya läkemedels egenskaper och farmakokinetik samt validering av både nuvarande och nya radiotracers för translationell forskning.
Under PET/CT-analyser kan tre spårämnen definieras (exempel på 2-vävnadens fack modell): för det första flödar spårämnet i blodet efter dess applicering (tillstånd 1; conc.[blod]). Andra, det kommer in i vävnaden via kapillär sängen och kan det antingen fritt röra sig inom extracellulära rymden eller är Ospecifikt bunden till olika cellulära eller extracellulära strukturer (stat 2; conc.[unspec]). För det tredje kan spårämne vara specifikt bundet (med eller utan metabolisk svällning) till sin målmolekyl (State 3, conc.[spec]). Alla dessa dynamiska processer mellan avdelningarna är till viss del dubbelriktad och diffusions processerna beskrivs av Hastighetskonstanter (K1, K2, K3 och K4). Medan koncentrationen av spårämne i blodet (dvs tillstånd 1) kallas “input”, koncentrationen av ospecifikt och specifikt bunden Tracer (dvs tillstånd 2 och tillstånd 3) kallas “output” och kan direkt härledas från PET bilden. Denna fysiologiska relation kan visas i 2-vävnadens fack modell (figur 1).
Figur 1 : De två-vävnaderna compartmental modell. De fysiologiska förhållandena i de tre olika tracertillstånden och de dynamiska processerna mellan dem visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
I det ideala fallet, conc.[spec] är proportionell mot koncentrationen av dess målmolekyl. Resultatet av PET/CT-mätningen är dock summan av conc.[spec] och conc.[unspec]. För att fastställa conc.[spec] i regionen av intresse, parallellt conc.[unspec] av en referens region saknar målprotein/väg bestäms. Genom att använda lämpliga matematiska ekvationer kan man nu beräkna conc.[spec], oftast med hjälp av kupé modellen (en bio-Kinetic modellering strategi). Men i många fall, en sådan referens region saknar målproteinet är inte tillgänglig1,2. I dessa fall kan conc.[Blood] användas för att bestämma conc.[spec]. Eftersom conc.[blod] är varierande på grund av olika lever-och njure clearance, utsöndring, blodflödet, olika hjärna-blod barriär penetration och sjukdomsrelaterade faktorer3, den nuvarande Guldstandarden är att mäta conc.[ blodet] parallellt med PET/datortomografi genom kontinuerlig blodprovstagning. Detta ger den arteriella inmatningsfunktionen (AIF), som definieras som conc.[blod] över tid4. Notera, utför kontinuerlig blodprovstagning anses tekniskt mycket utmanande, särskilt i små djur som råttor eller möss5.
Här, vi ger ett enkelt och praktiskt protokoll för att kontinuerligt prov blod från råttor via en arteriovenös (a-v) shunt mellan lår bens ven och artär. Kopplat till en kommersiellt tillgänglig detektor-pumpsystem, kan vi generera en realtid, kontinuerlig AIF under dynamisk [18f] fluorodeoxyglukos ([18f] FDG)-PET/CT skannar hos råttor och jämförde den med alternativa metoder. PET/CT Imaging utfördes i manliga Sprague Dawley råttor vid en ålder av 4 månader med en genomsnittlig vikt på 462 g ± 33 g (medelvärde ± standardavvikelse) med hjälp av en multimodalitet PET/CT scanner.
Eftersom en mängd olika enheter används under serien av mätningar (dos kalibrator, online Blood sampler, PET/CT, och väl Counter), en kvalitetskontroll procedur som kallas kors kalibrering behövs för att kontrollera den kvantitativa noggrannheten av alla system och att kompensera för olikheter. Kors kalibrering i samband med blodprovstagning på nätet innebär att räkna hastigheten för en given aktivitetskoncentration mätt i korrigerade PET-bilder kan omvandlas till den koncentration som mäts med Twilite-systemet för samma koncentration. Därför har man fastställt ett kors Kalibreringsförfarande mellan PET/CT, blod provs system och väl räknare.
Denna mycket standardiserade metodik ger en kraftfull metod för att kvantifiera metaboliska och cellulära processer i preklinisk smådjur forskning och är ett elegant sätt att förbättra tillförlitligheten och reproducerbarheten av AIF. AIF-fonden kan sedan användas för att kvantifiera den specifikt bundna spårämne i vävnad i prekliniska PET/CT-data med hjälp av bio kinetisk modellering.
De presenterade resultaten extraheras från ett större projekt om neuronala aktivitet i en transgen djurmodell av Huntingtons sjukdom jämfört med vild typs råttor. Totalt 30 transgena och vildtyp råttor var kateteriserad och manuell och online blodprovstagning parallellt med [18F] FDG-PET/CT utfördes. Tre AIF-fonder av vildtyp råttor visas här för att demonstrera utbudet av möjliga resultat av protokollet. Resultaten av det kompletta projektet om förändringar av neuronala aktivitet i en djurmodell av Huntingtons sjukdom kommer att publiceras på annat håll.
Den här beskrivna metoden möjliggör snabb och noggrann kontinuerlig blodprovstagning i en stor kohort och ger en oavbruten AIF för kinetisk modellering av dynamiska PET/CT-data i små djur. En extern blodcirkulation genereras för att upptäcka faktisk tid aktivitet i blodet hos djuren; Därför undviks en förlust av blod. Det kirurgiska ingreppet är baserat på Jespersen et al.8 och ändrades för att tillgodose behoven av arteriella blodprovstagning under PET/CT mätningar. Shuntsystemet validerades av Weber et al.9. Med här används setup, en extern blodvolym på ca 1,1 mL går genom detektor-pumpsystem. En råtta från 4 månaders ålder har en total blodvolym på ca 30 mL. Diametern på den femorala venen och artären är cirka 0,45-0.6 mm10 och måste vara lite stärkta för att sätta in katetern används.
AIF-fonden kan också mätas via sporadisk manuell blod insamling eller rekonstrueras från tidiga tidpunkter i själva PET-bilderna (bild-derived). Båda tillvägagångssätten utfördes med här presenterade data och jämfört med den kontinuerliga blodprovstagningen.
I jämförelse med manuell blodprovstagning, med online blodprovstagning en märkbar högre temporala upplösning (här: 1800 datapunkter per 30 min) blir möjligt. Manuella blod dragningar (här: 5 datapunkter per 30 min) är begränsade till den blodvolym som finns i det lilla djuret, eftersom dessa prover inte pumpas tillbaka in i cirkulationen av djuret. Dessutom är ett maximalt intervall på 10-15 s tekniskt genomförbar och viktig information för Kinetic modellering missas. Detta kan också ses i de presenterade data, som en skillnad i den upptäckta maximalt av kontinuerlig och manuell blodprovstagning är uppenbar (figur 3a, C, E). Med blodprovstagning på nätet var den upptäckta toppen högre än med den bild härledda inmatningsfunktionen i aorta ascendens11 (figur 3B, D, F). Den avbildade inmatningsfunktionen är begränsad till den rumsliga upplösningen hos PET-skannrar, vilket resulterar i partiella volymeffekter12 och påverkas av de rekonstruerade tidsramarna.
En generell fördel med detta kontinuerliga blod provs förfarande är att spårämne kan appliceras via katetern, vilket är mindre känsligt för störningar än injektion via den laterala svans venen. Tänk på att spårämne ska appliceras i en måttlig volym för att förhindra att spårämne blir kvar i början av rörsystemet. För att säkerställa att ingen aktivitet är kvar i den döda volymen av T-bit, är det spolas med hepariniserad saltlösning efteråt. Dessutom rekommenderas användning av en infusionspump eftersom den möjliggör justering av hastigheten på spår injektionen och kan bidra till ett mer samordnat förvärv av maximal radioaktivitet med manuell blodprovstagning13.
Det finns några möjliga problem som kan uppstå under protokoll bearbetningen och kan hanteras av följande felsökning. En suboptimal position av katetrar kan leda till en ofullständig exekvering av protokollet, därför se till att de är korrekt fixerade med den proximala suturen och att katetern skjuts 2-3 cm proximalt in i kärlet. Dessutom kan fibrin lim användas. Även bildandet av Trombi kan täppa till katetrar. Detta kan hanteras genom att öka heparin koncentrationen och efterföljande spolning av katetrar eller rörsystemet. Ett sådant suboptimala utfall på grund av igensättning av katetrar visas i resultaten, den maximala toppen missas (figur 3E). En annan kritisk punkt om djurskydd och välbefinnande är längden på extrakorporeal blodflödet. Det föreslås därför att minska längden på röret systemet till ett minimum.
När blodprovstagning utförs måste tre korrigeringar av den resulterande AIF-fonden beaktas. Första, plasma korrigering. Tracers jämvikt mellan plasma och blodceller, främst erytrocyter. Beroende på hur snabbt dessa diffusionsprocesser är, är den tillgängliga spårämne huvudsakligen närvarande i plasma. För vissa spårämnen, förhållandet mellan plasma till helblod måste övervägas, såsom mer lipofila sådana. I dessa fall måste plasma aktiviteten bestämmas. Om [18f] FDG används, finns det ingen anledning att Centrifugera blodet för att bestämma plasma aktiviteten, eftersom det jämmer mycket snabbt mellan plasma och röda blodkroppar och tillgången på [18f] FDG i plasma är liknande den i hela blodet. För det andra, metabolit korrigering. Många spårämnen metaboliseras i helblod och några av dessa metaboliter är fortfarande radioaktivt märkta14. Denna fraktion förekommer i AIF-fonden men är inte tillgänglig för vävnadsupptag. För vissa spårämnen måste metaboliter bestämmas i helblod eller plasma och AIF-fonden måste korrigeras. För det tredje, dispersion korrigering. Spridningen orsakas av flera faktorer, bland annat (a) den systematiska tidsskillnaden mellan den spårbara ankomsttiden i vävnaden i förhållande till den perifera provtagningsplatsen (fördröjnings korrigering) och (b) och smeten för AIF-fondens form, eftersom spår transport inom rörsystemet påverkas av dess första order fördröjning (PT1) Kinetics. Flera korrigeringar baserade på deconvolution har föreslagits, huvudsakligen baserade på modellen av Iida et al.15, men de flesta av dem är mottagliga för buller. Munk et al.16har föreslagit en korrektions metod som kringgår avfaltning och därför är mindre utsatt för buller. De nödvändiga mätningarna för att uppskatta korrigerings parametrarna måste utföras för varje kombination av slangar och spårämne som används. Dispersion korrigering bör göras innan tidsfördröjning korrigering17. Men främst snabb vävnad perfusion processer påverkas av dispersion och det har också visats, att för modellering av [18F] FDG studier en dispersion korrigering är inte absolut nödvändigt18. I de presenterade exemplen har därför inte spridnings korrigeringen av AIF-fonden tillämpats.
En ordentlig kalibrering av dos kalibratorn på plats och dess regelbundna kvalitetskontroll är en förutsättning för den typ av tvär kalibrerings procedurer som presenteras här. Om den verksamhet som administreras till djuret mäts med samma doskalibrator kommer dock alla avvikelser i noggrannheten att annulleras, under förutsättning att avvikelsen är konstant och att det fullständiga kors kalibreringsförfarandet har följts, inklusive nuklidspecifika korrigeringar (t. ex. för varierande halveringstid eller olika förgrening ratio). Med hjälp av ett sådant Kalibreringsförfarande för harmonisering av PET/CT-system som används inom hälso-och sjukvård och forskning, kan en noggrannhet på minst 5-10% uppnås19,20.
De kalibrerade och korrigerade AIF-fonderna som genererats genom ett lyckat genomförande av detta protokoll möjliggör kvantifiering av PET/CT-data för karakterisering av djur sjukdomsmodeller, testning av nya behandlingsalternativ, etablering av nya spårämnen och överföring av befintliga spårämnen till en annan art. Till synes, kontinuerlig blodprovstagning i [18] FDG-PET/CT hos råttor ger den mest tillförlitliga informationen för beräkning av indata i bio kinetisk modellering. Genom att ta hänsyn till den individuella metabolismen, särskilt leverclearance, en mer exakt bedömning av de relevanta patologiska eller terapeutiska effekter är möjligt. Med detta genomförbara protokoll är en högre verkningsgrad för prekliniska PET/CT dataanalys lätt genomförbar.
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner tacksamt Susann Lehmann, Iloana Klamfuß och Petra Wolff för djur boende och omsorg och Matthias Wyss för stöd under inrättandet av online blod provs system. Det lilla djuret PET/CT finansierades av Deutsche Forschungsgemeinschaft (INST 2268/6-1 FUGG).
Sugery for arteriovenous shunt | |||
anesthesia station | Groppler | ||
aneurysm clips | Aesculap | FT190T | 5 mm, closing force 70 g |
bulldog clamp | Aesculap | 35 mm | |
dissectiong scissors BC165 | Aesculap | 490-866 | dull, for skin preparation |
heating mat | |||
insulin syringe | Braun | 30G | |
needle holder | medicon | 11.62.18 | micro surgical |
pliers for aneurysm clips | Aesculap | FT 470T | Yasargil |
portex fine bore polythene tubing | Smith Medical | 800/100/200 | ID 0.58 mm, OD 0.96 mm; PE50 equivalent tubing |
surgical microscope with camera | Leica | M50 + MC120 HD | |
suture filaments 6.0 | 6.0, polypropylene | ||
suture filaments 3.0 | 3.0, absorbable, braided | ||
two anatomical forceps | Hammacher Soling | HSC601-11 | micro surgery, 45° |
vascular or corneal scissors | Geuder | G19605 | micro surgery scissors |
PET/CT imaging | |||
dose calibrator ISOMED 2010 | nivia instruments GmbH | for tracer portioning | |
Inveon PET/CT | Siemens | ||
tracer (e.g. 18F-FDG) | |||
manuel bloodsampling | |||
capillary blood collection EDTA tube | KABE Labortechnik GmbH | GK 150 EDTA 200 µl | |
test tubes | SARSTEDT | 5 ml, 75 x 12 mm, PS | |
well counter CAPTUS 700t | Capintec | manuel measurement of blood activity | |
automatic blood sampling | |||
BD Venflon TM pro safety shielded IV catheter; 18 G (1.3 mm x 32 mm) | BD | 3932269 | luer connections (to fit in t-connections) |
bloodsampler twilite two | swisstrace GmbH | ||
combi stopper | Braun | 4495101 | |
heparin | 50U/ml for tube flushing before the experiment and aspiration during catheter surgery | ||
hypodermic needle | G23 x 1 1/4" / 0.6 x 30 mm | ||
microprocessor controlled tubing pump | Ismatec/Cole-Parmer | ISM596 | 12 rollers, 2 channels |
PSAMPLE modul of PMOD | PMOD | ||
reduction connectors | Ismatec/Cole-Parmer | ISM569A | from ID 2.5 mm to ID 1.5 mm |
silicone pump tubes | Ismatec/Cole-Parmer | 070535-17-ND /SC0065N | for roller pump (yellow/blue/yellow ID 1.52 mm, WT 0.84 mm, OD 3.2 mm) |
silicone pump tubes – adapter tubing | Ismatec/Cole-Parmer | SC 0107 | black/black/black ID 0.76 mm, WT 0.86 mm, OD: 2.48 mm |
t-piece or t-connections | Ismatec/Cole-Parmer | ISM 693A | ID 2.5 mm |