Summary

Использование беспозвоночных Galleria mellonella в качестве модели инфекции для изучения комплекса туберкулеза микобактерий

Published: June 30, 2019
doi:

Summary

Galleria mellonella была недавно создана как воспроизводимая, дешевая и этически приемлемая модель инфекции для комплекса mycobacterium tuberculosis. Здесь мы описываем и демонстрируем шаги, предпринятые для создания успешной инфекции G. mellonella с биолюминесцентными Mycobacterium bovis BCG lux.

Abstract

Туберкулез является ведущей глобальной причиной смертности от инфекционных заболеваний, и считается, что примерно четверть населения мира инфицирована туберкулезом микобактерий. Несмотря на десятилетия исследований, многие из механизмов успеха М. туберкулеза как патогенного организма еще предстоит изучить, и разработка более безопасных, более эффективных антимикобактериальных препаратов срочно необходимы для решения проблемы роста и распространение лекарственно-устойчивого туберкулеза. Тем не менее, прогрессирование исследований туберкулеза является узким местом традиционных моделей инфекции млекопитающих, которые являются дорогостоящими, трудоемкими и этически сложными. Ранее мы создали личинки насекомого Galleria mellonella (большая восковая моль) как новую, воспроизводимую, низкую стоимость, высокопроизводительную и этически приемлемую модель инфекции для членов туберкулезного комплекса М. Здесь мы описываем техническое обслуживание, подготовку и инфекцию G. mellonella с биолюминесцентным Mycobacterium bovis BCG lux. Используя эту модель инфекции, микобактериальная доза зависимой вирулентности можно наблюдать, и быстрое считывание in vivo микобактериальной нагрузки с использованием измерений биолюминесценции легко достижимо и воспроизводимо. Хотя существуют ограничения, такие как отсутствие полностью аннотированного генома для транскриптомического анализа, онтологический анализ против генетически похожих насекомых может быть проведен. Как низкая стоимость, быстрая и этически приемлемая модель для туберкулеза, G. mellonella может быть использован в качестве предварительного скрининга для определения эффективности и токсичности препарата, а также для определения сравнительной микобактериальной вирулентности до использования обычных млекопитающих Модели. Использование модели G. mellonella-mycobacteriaприведет к сокращению значительного числа животных, используемых в настоящее время в исследованиях туберкулеза.

Introduction

Туберкулез (ТБ) представляет собой серьезную угрозу для глобального общественного здравоохранения: 9 миллионов новых случаев заболевания в год и 1,5 миллиона случаев смерти1. Кроме того, по оценкам, четверть населения мира инфицирована возбудительным агентом болезни, Микобактерия туберкулеза (Mtb). Среди инфицированного населения в течение жизни у 5–10% будет развиваться активное заболевание туберкулезом. Кроме того, появление и распространение множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и широко лекарственной (ШлУ) резистентной МТБ представляет собой серьезную угрозу для борьбы с болезнями, при этом 123 страны сообщают по крайней мере об одном случае ШЛУ1. Для лечения туберкулеза требуется коктейль из не менее четырех антимикобактериальных препаратов, из которых изониазид и рифампицин назначаются на минимальный срок в шесть месяцев; лечение часто связано со сложными побочными эффектами и токсичности. Защита от единственной лицензированной вакцины против туберкулеза, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Gu’rin (BCG), является переменной2. Неполное понимание патогенеза туберкулеза существенно затрудняет разработку новых терапевтических стратегий и стратегий вакцинации.

На протяжении десятилетий модели инфекции животных имеют жизненно важное значение для исследования туберкулеза, чтобы понять основной патогенез и принимающей ответ на инфекцию, а также оценить новые анти-микобактериальные агенты, иммуно-терапевтические и новые кандидаты вакцины3, 4.Однако исследования с использованием моделей инфекции животных тб, как известно, трудно, как патогенез и прогрессирование туберкулезной инфекции являются сложными, и нет единой модели животных, которая имитирует весь спектр и важные особенности болезни5 ,6. Кроме того, эксперименты на животных являются дорогостоящими, отнимают много времени и требуют полного этического обоснования. Тем не менее, модели инфекции животных туберкулеза были описаны у нечеловеческих приматов (например, макаки), морских свинок, кроликов, крупного рогатого скота, свиней, мышей и зебры, причем каждый из них имеет свои ограничения3,4. Модель мурина является наиболее часто используемой моделью из-за стоимости, наличия инбредных линий, воспроизводимости инфекции и обилия иммунологических реагентов. Однако, они обычно не образуют гранулемы, связанные с областями гипоксии, которые характерны для скрытой туберкулезной инфекции (LTBI)6. Гвинейские свиньи очень восприимчивы к инфекции Mtb, с патологией и ранним образованием гранулемы, аналогичным и тем, которые существуют у людей, и широко используются в тестировании вакцин; однако отсутствие иммунологических реагентов затрудняет ихиспользование в качестве инфекционной модели 7. Зебрафиш подходит для крупномасштабного скрининга на ранних стадиях доклинических исследований из-за их небольшого размера, быстрого размножения и передовых генетических инструментов, но анатомически и физиологически отличаются от человека и только восприимчивы к Микобактерия маринум инфекции3. Модели животных, наиболее похожие на человеческую инфекцию Mtb являются нечеловеческими приматами (например, макаки), но они дороги ею и имеют значительные этические и практические соображения, которые значительно ограничивают их использование8.

Личинки насекомых больше йош ной или сот моли, Galleria mellonella, становятся все более популярными в качестве модели инфекции для различных бактериальных и грибковых патогенов9, и в качестве экрана для новых кандидатов противомикробных препаратов наркотиков 10. G. mellonella является успешной моделью беспозвоночных из-за своей сложной врожденной иммунной системы (состоящей из клеточной и гуморальной защиты), которая разделяет высокую степень структурного и функционального сходства с позвоночными11 . Это включает в себя иммунные механизмы, такие как фагоцитоз патогенных микроорганизмов гемоцитами (функционально похожие на млекопитающих макрофага и нейтрофилов)12,13, производство и циркуляция антимикробных пептидов (АМП) и дополняют белки в гемолимфе (аналог крови млекопитающих) G. mellonella11. Другие преимущества9,14,15 личинок G. mellonella в качестве модели включают 1) их большой размер (20-30 мм), который позволяет легко манипуляции и инфекции, а также сбор тканей и гемолимфа для анализа, 2) легкое обслуживание при 37 градусах Цельсия, совместимое для изучения патогенных микроорганизмов человека, 3) точная инфекция путем инъекций без необходимости анестезии, 4) эффективность противомикробных препаратов может быть оценена с использованием меньше госпрепарата для оценки, 5) отсутствие этические ограничения по сравнению с использованием млекопитающих, 6) большие размеры группы могут быть использованы по сравнению с животными моделями, позволяющими большую воспроизводимость, и 7) более короткое время для экспериментов инфекции не требуется.

В недавнем исследовании, мы показали, что G. mellonella может быть использован в качестве новой модели инфекции для изучения патогенеза инфекции биолюминесцентных M. bovis BCG люкс, генетически модифицированная версия штамма вакцины и член комплекса Mtb (MTBC)16. В то время как G. mellonella ранее использовалась в качестве модели инфекции для нетуберкулезных микобактерий (NTM), в основном M. marinum и Mycobacterium abscessus17,18, исследования с использованием MTBC ограничены что Ли и др.16. Биолюминесцентные непатогенные микобактериальные штаммы, которые могут быть использованы на уровне сдерживания (CL) 2 в качестве суррогата Для Mtb, предлагают преимущества безопасности и практичности по сравнению с патогенными микобактериями. После заражения BCG lux, личинки начинают развивать ранние гранулемы-подобные структуры, которые могли бы дать ценную информацию о роли врожденного иммунитета в создании туберкулезной инфекции16. Кроме того, эта простая модель инфекции беспозвоночных может обеспечить быструю, недорогостоящую и надежную оценку патогенеза туберкулеза, включающую контролируемые вызовы и множественные репликации для воспроизводимости. Кроме того, эта модель может быть использована для скрининга новых противотуберкулезных препаратов и вакцин кандидатов в раннем развитии, что сокращает общее число животных в экспериментах. Способность измерять изменения в структуре хозяина и патогена, транскриптоме и протеоме для определения целей лекарств и оценки механизмов действия новых препаратов и терапевтических вакцин также выгодна.

Здесь мы описываем экспериментальные протоколы для подготовки биолюминесцентных M. bovis BCG lux inoculum и G. mellonella личинок для микобактериальной инфекции, а также определение как личинки, так и микобактерии выживаемости в ответ на инфекцию.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все работы, описанные ниже, должны быть выполнены в лаборатории CL2 в классе 2 микробиологической безопасности кабинета (MSC) в соответствии с местными стандартами здоровья и безопасности. 1. Подготовка M. bovis BCG lux для инфекции Разморозить заморожен?…

Representative Results

Здесь мы представляем репрезентативные данные, которые могут быть получены с помощью G. mellonella – BCG lux инфекции модели и выделить преимущества G. mellonella как инфекционная модель для членов MTBC (Рисунок 1). Экспериментальные процедуры с ключевыми…

Discussion

Использование G. mellonella в качестве модели инфекции была создана для ряда бактериальных и грибковых патогенов для изучения вирулентности, взаимодействия хозяина-патогена, а также в качестве экрана для новых терапевтических 10,22. Следующее обсуждение о…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Этот проект был поддержан грантами От Совета по исследованиям в области биотехнологии и биологических наук (BBSRC), присуждаемого PRL и YL (BB/P001262/1), и Национального центра по замене, переработке и сокращению животных в научных исследованиях (NC3Rs), присуждаемого PRL, SMN, BDR и YL (NC/R001596/1).

Materials

1.5ml reaction tube (Eppendorf) Eppendorf 22431021
20, 200 and 1000 µl pipette and filtered tips Any supplier n/a
24 well culture plate Greiner 662160
25 ml pipettes and pipette boy Any supplier n/a
3 compartment Petri dish (94/15mm) Greiner 637102
Centrifuge Any supplier n/a
Class II saftey cabinet Any supplier n/a
Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml) Corning CLS40183
Ethanol (>99.7%) VWR 208221.321
Galleria mellonella (250 per pk) Livefood Direct UK W250
Glycerol Sigma-Aldrich G5150
Homogeniser (FastPrep-24 5G ) MP Biomedicals 116005500
Hygromycin B Corning 30-240CR
Luminometer (Autolumat LB 953) Berthold 34622
Luminometer tubes Corning 352054
Lysing matrix (S, 2.0ml) MP Biomedicals 116925500
Micro syringe (25 µl, 25 ga) SGE 3000
Microcentrifuge Any supplier n/a
Middlebrook 7H11 agar BD Bioscience 283810
Middlebrook 7H9 broth BD Bioscience 271310
Middlebrook ADC enrichment BD Bioscience 212352
Middlebrook OADC enrichment BD Bioscience 212240
Mycobacterium bovis BCG lux Various n/a
n-decyl aldehyde Sigma-Aldrich D7384-100G
Orbital shaking incubator Any supplier n/a
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Polysorbate 80 (Tween-80) Sigma-Aldrich P8074-500ml
Small box Any supplier n/a dark vented or non-sealed box recommended
Tweezer Any supplier n/a Short and narrow tipped/Blunt long tweezers
Winterm (V1.08) Berthold n/a Program LB953.TTB
Petri dish (94/15mm) Greiner 633181
Filter paper (94mm) Any supplier n/a Cut to fit

References

  1. World Health Organization. . Global tuberculosis report 2018. , (2018).
  2. Colditz, G. A., et al. Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature. Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).
  3. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
  4. Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine. Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).
  5. Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis. Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).
  6. Williams, A., Orme, I. M. Animal models of tuberculosis: an overview. Microbiology Spectrum. 4 (4), (2016).
  7. Myllymäki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Rämet, M. Animal models in tuberculosis research – where is the beef?. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).
  8. Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis. Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).
  9. Cook, S. M., McArthur, J. D. Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens. Virulence. 4 (5), 350-353 (2013).
  10. Tsai, C. J. -. Y., Loh, J. M. S., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
  11. Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
  12. Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
  13. Arteaga Blanco, L. A., et al. Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae. Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).
  14. López Hernández, Y., Yero, D., Pinos-Rodríguez, J. M., Gibert, I. Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens. Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).
  15. Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
  16. Li, Y., et al. Galleria mellonella – a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).
  17. Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), (2018).
  18. Entwistle, F. M., Coote, P. J. Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments. Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).
  19. Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).
  20. Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux). Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
  21. Jorjão, A. L., et al. From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies. Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).
  22. Kavanagh, K., Sheehan, G. The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest. Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).
  23. Champion, O., Titball, R., Bates, S. Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens. Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).
  24. Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis. Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).
  25. Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis – BCG growth capacity and infectivity. FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).
  26. De Groote, M. A., et al. Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).
  27. Grosset, J., et al. Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).
  28. Vogel, H., Altincicek, B., Glöckner, G., Vilcinskas, A. A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella. BMC Genomics. 12, 308 (2011).

Play Video

Cite This Article
Asai, M., Li, Y., Khara, J. S., Gladstone, C. A., Robertson, B. D., Langford, P. R., Newton, S. M. Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex. J. Vis. Exp. (148), e59703, doi:10.3791/59703 (2019).

View Video