Summary

Uso do invertebrado Galleria mellonella como modelo de infecção para estudo do complexo Mycobacterium tuberculosis

Published: June 30, 2019
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Summary

A Galleria mellonella foi recentemente estabelecida como um modelo de infecção reprodutível, barato e eticamente aceitável para o complexo Mycobacterium tuberculosis . Aqui nós descrevemos e demonstramos as etapas tomadas para estabelecer a infecção bem sucedida de G. mellonella com o Lux bioluminescente do Mycobacterium bovis BCG .

Abstract

A tuberculose é a principal causa global de mortalidade por doenças infecciosas e cerca de um quarto da população mundial é acreditado para ser infectado com Mycobacterium tuberculosis. Apesar de décadas de pesquisa, muitos dos mecanismos por trás do sucesso da M. tuberculosis como um organismo patogénico continuam a ser investigados, e o desenvolvimento de drogas antimiccobacterianas mais seguras e eficazes são urgentemente necessários para enfrentar o aumento e disseminação da tuberculose resistente à droga. No entanto, a progressão da investigação da tuberculose é estrangulada por modelos tradicionais de infecção de mamíferos que são dispendiosos, demorados e eticamente desafiadores. Previamente nós estabelecemos as larvas do inseto Galleria mellonella (maior traça de cera) como uma novela, reprodutível, de baixo custo, de alta taxa de transferência e eticamente aceitável modelo de infecção para os membros do complexo M. tuberculosis . Aqui nós descrevemos a manutenção, a preparação, e a infecção de G. mellonella com o Lux bioluminescente do Mycobacterium bovis BCG . Usando este modelo da infecção, a virulência dependente da dose Mycobacterial pode ser observada, e um leitura rápido da carga Mycobacterial in vivo usando medidas do bioluminescência é facilmente alcançável e reprodutível. Embora existam limitações, como a falta de um genoma totalmente anotado para a análise transcriptômica, a análise ontológica contra insetos geneticamente semelhantes pode ser realizada. Como um modelo de baixo custo, rápido e eticamente aceitável para a tuberculose, G. mellonella pode ser usado como uma pré-tela para determinar a eficácia e toxicidade da droga, e para determinar a virulência micobacteriana comparativa antes do uso de mamíferos convencionais Modelos. O uso do modelo de G. mellonella-micobactérias levará a uma redução no número substancial de animais atualmente utilizados na pesquisa em tuberculose.

Introduction

A tuberculose (TB) é uma grande ameaça à saúde pública global com 9 milhões casos novos por ano e 1,5 milhões mortes1. Além disso, estima-se que um quarto da população mundial está infectado com o agente causador da doença, Mycobacterium tuberculosis (MTB). Entre a população infectada, 5 − 10% desenvolverão doença ativa da TB ao longo de sua vida. Além disso, a emergência e a propagação do MTB resistente do multi-droga (MDR) e do extensivamente-droga (XDR) representa uma ameaça séria ao controle da doença, com os 123 países que reportam pelo menos um caso XDR1. O tratamento da TB requer um coquetel de pelo menos quatro medicamentos antimicobacterianos, dos quais isoniazida e rifampicina são prescritos por uma duração mínima de seis meses; o tratamento é associado frequentemente com os efeitos secundários e as toxicidades complexos. A proteção da única vacina licenciada contra a TB, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), é variável2. Uma compreensão incompleta da patogênese da TB dificulta significativamente o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e de vacinação.

Durante décadas, os modelos de infecção animal têm sido vitais para a pesquisa de TB para compreender a patogênese básica e a resposta do hospedeiro à infecção, e para avaliar novos agentes antimicobacterianos, imuno-terapêutica e novas candidatas à vacina3, 4. no entanto, a pesquisa utilizando modelos de infecção animal da TB é notoriamente difícil, pois a patogênese e a progressão da infecção por TB são complexas, e não há um modelo animal único que imita o espectro completo e as características importantes da doença5 ,6. Além disso, experimentos com animais são caros, demorados a empreender e necessitam de plena justificação ética. No entanto, modelos de infecção animal de TB têm sido descritos em primatas não humanos (por exemplo, macaques), cobaias, coelhos, bovinos, suínos, camundongos e zebrafish, cada um com suas limitações3,4. O modelo murino é o modelo mais comumente utilizado devido ao custo, disponibilidade de linhagens, reprodutibilidade da infecção e abundância de reagentes imunológicos. Entretanto, não formam tipicamente granulomas associados a áreas de hipóxia que são características de infecção latente por tuberculose (LTBI)6. As cobaias são altamente suscetíveis à infecção de MTB , com patologia e formação adiantada do granuloma similar àquelas nos seres humanos, e são amplamente utilizadas no teste da vacina; ainda a falta de reagentes imunológicos dificulta seu uso como modelo de infecção7. Os zebrafish são apropriados para a seleção em grande escala em estudos pré-clínicos do cedo-estágio devido a seu tamanho pequeno, a reprodução rápida e as ferramentas genéticas avançadas, mas são anatomicamente e fisiologicamente diferentes aos seres humanos e são somente suscetíveis a Infecção do marinum do Mycobacterium 3. Os modelos animais mais parecido com a infecção humana MTB são primatas não-humanos (por exemplo, o macaco), mas eles são caros e têm considerações éticas e práticas significativas que limita consideravelmente o seu uso8.

A larva do inseto da traça maior da cera ou da traça do favo de mel, Galleria mellonella, tornou-se cada vez mais popular como um modelo da infecção para uma variedade de micróbios patogénicos bacterianos e fungosos9, e como uma tela para candidatos antimicrobial novos da droga 10. G. mellonella é um modelo de invertebrados de sucesso devido ao seu sofisticado sistema imunológico inato (composto por defesas celulares e humorais) que compartilha um alto grau de semelhança estrutural e funcional com o dos vertebrados11 . Isso inclui mecanismos imunes como a fagocitose de patógenos por hemócitos (funcionalmente semelhantes aos macrófagos de mamíferos e neutrófilos)12,13, a produção e circulação de peptídeos antimicrobianos (AMPS) e proteínas complemento-like dentro da hemolinfa (análoga ao sangue de mamíferos) de G. mellonella11. Outras vantagens9,14,15 de larvas de G. mellonella como um modelo incluem 1) seu tamanho grande (20 − 30 milímetros) que permite a manipulação e a infecção fáceis, assim como a coleção do tecido e hemolinfa para análises, 2) fácil manutenção a 37 ° c, compatível para estudo de patógenos humanos, 3) infecção precisa por injeção sem necessidade de anestesia, 4) a eficácia dos agentes antimicrobianos pode ser avaliada utilizando menos medicamentos para avaliação, 5) falta de restrições éticas em relação ao uso de mamíferos, 6) grandes tamanhos de grupo podem ser usados em comparação com modelos animais permitindo maior reprodutibilidade, e 7) tempos mais curtos para experimentos de infecção são necessários.

Em um estudo recente, Nós demonstramos que G. mellonella pode ser usada como um modelo novo da infecção para estudar a patogénese da infecção pelo Luxbioluminescente de M. bovis BCG, uma versão genetically modificada da tensão da vacina e do membro do complexo MTB (mtbc)16. Enquanto G. mellonella tem sido usada anteriormente como um modelo de infecção para micobactérias não tuberculosas (NTM), principalmente M. marinum e Mycobacterium abscessus17,18, estudos usando mtbc são limitados a de Li et al.16. Cepas micobacterianas não patogênicas bioluminescentes, que podem ser usadas no nível de contenção (CL) 2 como um substituto para MTB, oferecem as vantagens de segurança e praticidade sobre micobactérias patogênicas. Após a infecção pelo BCG Lux, as larvas começam a desenvolver estruturas semelhantes ao Granuloma precoce, o que poderia fornecer uma visão valiosa sobre o papel da imunidade inata no estabelecimento da infecção por TB16. Além disso, este modelo simples de infecção por invertebrados tem o potencial de fornecer uma avaliação rápida, de baixo custo e confiável da patogênese da TB incorporando desafio controlado e múltiplas repetições para reprodutibilidade. Além disso, o modelo tem o potencial para ser usado para a tela de novos candidatos a drogas e vacinas anti-TB no desenvolvimento precoce, reduzindo o número total de animais em experimentação. A capacidade de medir mudanças na estrutura hospedeira e patógeno, transcriptoma e proteoma para determinar alvos de drogas e avaliar mecanismos de ação de novas drogas e vacinas terapêuticas, também são vantajosas.

Aqui nós descrevemos os protocolos experimentais para a preparação de um inocular bioluminescente de M. bovis BCG Lux e de larvas de G. mellonella para a infecção Mycobacterial, assim como a determinação de larval e de Mycobacterial sobrevivência em resposta à infecção.

Protocol

Nota: todo o trabalho descrito abaixo deve ser realizado em um laboratório CL2 dentro de um gabinete de segurança microbiológica classe 2 (MSC) seguindo as diretrizes locais de saúde e segurança. 1. preparação de M. bovis BCG Lux para infeção Degelo um 1,2 mL de glicerol congelado (15%) estoque de M. bovis BCG Lux, a cepa vacinal de Montreal transformada com o plasmídeo de transporte PSMT1 carregando os genes luxab de Vibrio …

Representative Results

Aqui apresentamos dados representativos que podem ser obtidos usando o modelo de infecção por g. mellonella — BCG Lux e destacam os benefícios de g. mellonella como um modelo de infecção para os membros do mtbc (Figura 1). Os procedimentos experimentais com pontos técnicos principais estão descritos na Figura 2. <img alt="Figure 1" cl…

Discussion

O uso de G. mellonella como modelo de infecção foi estabelecido para um número de patógenos bacterianos e fúngicos para o estudo da virulência, interação hospedeiro-patógeno e como tela para a nova terapêutica10,22. A discussão a seguir é baseada no procedimento experimental para o uso de G. mellonella como um modelo de infecção para o mtbc.

A saúde das larvas ingênuas antes da experimentaçã…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este projeto foi apoiado por subsídios do Conselho de pesquisa em biotecnologia e ciências biológicas (BBSRC), concedido a PRL e YL (BB/P001262/1), e ao centro nacional de substituição, refinamento e redução de animais em pesquisa (NC3Rs) concedido ao PRL, SMN, BDR e YL (NC/R001596/1).

Materials

1.5ml reaction tube (Eppendorf) Eppendorf 22431021
20, 200 and 1000 µl pipette and filtered tips Any supplier n/a
24 well culture plate Greiner 662160
25 ml pipettes and pipette boy Any supplier n/a
3 compartment Petri dish (94/15mm) Greiner 637102
Centrifuge Any supplier n/a
Class II saftey cabinet Any supplier n/a
Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml) Corning CLS40183
Ethanol (>99.7%) VWR 208221.321
Galleria mellonella (250 per pk) Livefood Direct UK W250
Glycerol Sigma-Aldrich G5150
Homogeniser (FastPrep-24 5G ) MP Biomedicals 116005500
Hygromycin B Corning 30-240CR
Luminometer (Autolumat LB 953) Berthold 34622
Luminometer tubes Corning 352054
Lysing matrix (S, 2.0ml) MP Biomedicals 116925500
Micro syringe (25 µl, 25 ga) SGE 3000
Microcentrifuge Any supplier n/a
Middlebrook 7H11 agar BD Bioscience 283810
Middlebrook 7H9 broth BD Bioscience 271310
Middlebrook ADC enrichment BD Bioscience 212352
Middlebrook OADC enrichment BD Bioscience 212240
Mycobacterium bovis BCG lux Various n/a
n-decyl aldehyde Sigma-Aldrich D7384-100G
Orbital shaking incubator Any supplier n/a
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Polysorbate 80 (Tween-80) Sigma-Aldrich P8074-500ml
Small box Any supplier n/a dark vented or non-sealed box recommended
Tweezer Any supplier n/a Short and narrow tipped/Blunt long tweezers
Winterm (V1.08) Berthold n/a Program LB953.TTB
Petri dish (94/15mm) Greiner 633181
Filter paper (94mm) Any supplier n/a Cut to fit

References

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Asai, M., Li, Y., Khara, J. S., Gladstone, C. A., Robertson, B. D., Langford, P. R., Newton, S. M. Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex. J. Vis. Exp. (148), e59703, doi:10.3791/59703 (2019).

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