Galleria mellonella blev for nylig etableret som en reproducerbar, billig, og etisk acceptabel infektion model for Mycobacterium tuberkulose kompleks. Her beskriver og demonstrerer vi de skridt, der er taget for at etablere en vellykket infektion af G. mellonella med bioluminescent Mycobacterium bovis BCG Lux.
Tuberkulose er den førende globale årsag til dødeligheden blandt smitsomme sygdomme, og omkring en fjerdedel af verdens befolkning menes at være inficeret med Mycobacterium tuberkulose. Trods årtiers forskning er mange af mekanismerne bag succesen med M. tuberkulose som en patogen organisme endnu ikke undersøgt, og udviklingen af sikrere og mere effektive Antimykobakterielle lægemidler er tvingende nødvendige for at tackle stigningen og spredning af lægemiddel resistent tuberkulose. Udviklingen af tuberkulose forskning er imidlertid flavoret af traditionelle pattedyrs infektions modeller, som er dyre, tidskrævende og etisk udfordrende. Tidligere etablerede vi larverne af insektet Galleria mellonella (større voks møl) som en roman, reproducerbar, lav pris, høj-gennemløb og etisk acceptabel infektion model for medlemmer af M. tuberkulose kompleks. Her beskriver vi vedligeholdelse, klargøring og infektion af G. mellonella med bioluminescent Mycobacterium bovis BCG Lux. Ved hjælp af denne infektions model kan der observeres mykobakteriel dosisafhængig virulens, og en hurtig aflæsning af in vivo-mykobakteriel byrde ved hjælp af bioluminiscenmålinger er let opnåelig og reproducerbar. Selv om der findes begrænsninger, såsom manglen på et fuldt kommenteret genom til transkriptomic analyse, kan der foretages en ontologisk analyse mod genetisk lignende insekter. Som en lav pris, hurtig og etisk acceptabel model for tuberkulose, G. mellonella kan bruges som en pre-Screen til at bestemme lægemidlets virkning og toksicitet, og til at bestemme komparativ mycobakterielle virulens før brugen af konventionelle pattedyr Modeller. Anvendelsen af G. mellonella-mycobakterier-modellen vil føre til en reduktion af det betydelige antal dyr, der i øjeblikket anvendes til tuberkulose forskning.
Tuberkulose (TB) er en stor trussel mod den globale folkesundhed med 9.000.000 nye tilfælde om året og 1.500.000 dødsfald1. Desuden skønnes det, at en fjerdedel af verdens befolkning er inficeret med sygdommens sygdomsfremkaldende agens, Mycobacterium tuberkulose (MTB). Blandt den inficerede population vil 5 − 10% udvikle aktiv TB-sygdom i løbet af deres levetid. Desuden udgør fremkomsten og spredningen af multi-drug resistente (MDR) og ekstensivt-Drug (XDR) resistent MTB en alvorlig trussel mod sygdomsbekæmpelse, med 123 lande, der rapporterer mindst én XDR sag1. Behandling af TB kræver en cocktail af mindst fire anti-mykobakterielle lægemidler, hvoraf isoniazid og rifampicin ordineres i en periode på mindst seks måneder; behandling er ofte forbundet med komplekse bivirkninger og toksiciteter. Beskyttelse mod den eneste licenserede vaccine mod TB, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), er variabel2. En ufuldstændig forståelse af patogenesen af TB hæmmer i væsentlig grad udviklingen af nye terapeutiske og vaccinationsstrategier.
I årtier har dyre infektions modeller været afgørende for TB-forskning for at forstå den grundlæggende patogenese og vært respons på infektion, og for at vurdere nye anti-mykobakterielle midler, immuno-Therapeutics og nye vaccinekandidater3, 4. men, forskning ved hjælp af dyre infektion modeller af TB er notorisk svært som patogenesen og progression af TB-infektion er komplekse, og der er ingen enkelt dyr model, der efterligner det fulde spektrum og vigtige træk ved sygdommen5 ,6. Desuden er dyreforsøg dyre, tidskrævende at gennemføre og kræver fuld etisk begrundelse. Ikke desto mindre er dyre infektions modeller af TB blevet beskrevet i ikke-humane primater (f. eks. makakaber), marsvin, kaniner, kvæg, grise, mus og zebrafisk, idet hver af dem har deres begrænsninger på3,4. Den murine model er den mest almindeligt anvendte model på grund af omkostningerne, tilgængeligheden af indavlede linjer, reproducerbarhed af infektion og overflod af immunologiske reagenser. Men, de ikke typisk danner granulomer forbundet med områder af hypoxi, der er karakteristiske for latent tuberkuloseinfektion (LTBI)6. Marsvin er meget modtagelige for MTB infektion, med patologi og tidlig granuloma dannelse svarende til dem i mennesker, og er meget udbredt i vaccine test; men manglen på immunologiske reagenser hæmmer deres anvendelse som en infektion model7. Zebrafish er velegnet til storstilet screening i tidlige stadie prækliniske studier på grund af deres lille størrelse, hurtige reproduktion og avancerede genetiske værktøjer, men er anatomisk og fysiologisk forskellige for mennesker og er kun modtagelige for Mycobacterium Marinum infektion3. De dyremodeller, der mest ligner humane MTB -infektioner, er ikke-menneskelige primater (f. eks. makakkerne), men de er dyre og har væsentlige etiske og praktiske overvejelser, som begrænser deres anvendelse betydeligt8.
Den insekt larve af de større voks møl eller Honeycomb møl, Galleria mellonella, er blevet stadig mere populære som en infektion model for en bred vifte af bakterielle og svampe patogener9, og som en skærm for nye antimikrobielle stof kandidater 10. G. mellonella er en succesfuld Invertebrat model på grund af sit sofistikerede medfødte immunsystem (bestående af cellulære og humorale forsvar), der deler en høj grad af strukturel og funktionel lighed med, at hvirveldyr11 . Dette omfatter immun mekanismer såsom fagocytose af patogener af hæocytter (funktionelt svarer til pattedyrs makrofag og neutrofiler)12,13, produktion og cirkulation af antimikrobielle peptider (ampere) og komplement lignende proteiner i hæmolymph (analogt med pattedyr blod) af G. mellonella11. Andre fordele9,14,15 af G. mellonella larver som model omfatter 1) deres store størrelse (20 − 30 mm), som giver mulighed for nem manipulation og infektion, samt indsamling af væv og hæmolymph til analyser, 2) nem vedligeholdelse ved 37 °C, kompatibel til at studere humane patogener, 3) præcis infektion ved injektion uden behov for anæstesi, 4) effekten af antimikrobielle stoffer kan vurderes udnytte mindre lægemiddel til evaluering, 5) manglende etiske begrænsninger sammenlignet med brug af pattedyr, 6) store gruppestørrelser kan anvendes sammenlignet med dyremodeller, der giver større reproducerbarhed, og 7) kortere tid for infektions forsøg er påkrævet.
I en nylig undersøgelse, viste vi, at G. mellonella kan bruges som en ny infektion model for at studere patogenesen af infektion med bioluminescent M. bovis BCG Lux, en genetisk modificeret version af vaccinestammen og medlems af MTB Complex (mtbc)16. Mens G. mellonella tidligere har været anvendt som infektions model for ikke-tuberkuløse mykobakterier (NTM), hovedsagelig M. Marinum og Mycobacterium abscessus17,18, er studier med mtbc begrænset til af Li et al.16. Bioluminescerende ikke-patogene mykobakterielle stammer, som kan anvendes på indeslutningsniveau (CL) 2 som et surrogat for MTB, tilbyder fordelene ved sikkerhed og funktionalitet over patogene mykobakterier. Efter infektion med BCG Luxbegynder larverne at udvikle tidlige granuloma-lignende strukturer, som kan give værdifuld indsigt i den medfødte Immunitets rolle ved etablering af TB-infektion16. Desuden, denne enkle hvirvelløse infektion model har potentiale til at give en hurtig, billig, og pålidelig evaluering af TB patogenesen indarbejde kontrolleret udfordring og flere replikater for reproducerbarhed. Desuden har modellen potentialet til at blive brugt til at screene nye anti-TB-lægemidler og vaccinekandidater i den tidlige udvikling, hvilket reducerer det samlede antal dyr i eksperimenter. Evnen til at måle ændringer i Host og patogen struktur, transkriptomer og proteom til at bestemme narkotika mål og vurdere virkningsmekanismer af nye lægemidler og terapeutiske vacciner, er også fordelagtige.
Her beskriver vi forsøgsprotokollerne til forberedelse af en bioluminescent M. bovis BCG Lux inokulum og G. mellonella larver til mykobakteriel infektion, samt bestemmelse af både larve og mykobakterielle overlevelse som reaktion på infektion.
Brugen af G. mellonella som en infektions model er blevet fastlagt for en række bakterielle og svampe patogener til studiet af virulens, Host-pathogen interaktion, og som en skærm for ny terapeutisk medicin10,22. Følgende diskussion er baseret på den eksperimentelle procedure for anvendelse af G. mellonella som en infektion model for mtbc.
Sundhedstilstanden hos de naive larver før eksperimenteren kan ha…
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt blev støttet af tilskud fra Forskningsrådet for bioteknologi og biologisk videnskab (BBSRC), der blev tildelt PRL og YL (BB/P001262/1), og det nationale center for erstatning, forbedring og reduktion af dyr i forskning (NC3Rs), der blev tildelt PRL, SMN, BDR og YL (NC/R001596/1).
1.5ml reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
20, 200 and 1000 µl pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
25 ml pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
3 compartment Petri dish (94/15mm) | Greiner | 637102 | |
Centrifuge | Any supplier | n/a | |
Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml) | Corning | CLS40183 | |
Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
Lysing matrix (S, 2.0ml) | MP Biomedicals | 116925500 | |
Micro syringe (25 µl, 25 ga) | SGE | 3000 | |
Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
Petri dish (94/15mm) | Greiner | 633181 | |
Filter paper (94mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |