Summary
Galleria mellonella a été récemment établi comme un modèle d'infection reproductible, bon marché et éthiquement acceptable pour le complexe de mycobacterium tuberculosis. Ici nous décrivons et démontrons les étapes prises pour établir l'infection réussie de G. mellonella avec le Mycobacterium bioluminescent bovis BCG lux.
Abstract
La tuberculose est la principale cause mondiale de mortalité par maladie infectieuse et environ un quart de la population mondiale serait infectée par Mycobacterium tuberculosis. Malgré des décennies de recherche, de nombreux mécanismes à l'origine du succès de M. tuberculosis en tant qu'organisme pathogène restent à étudier, et le développement de médicaments antimycobactériens plus sûrs et plus efficaces est nécessaire de toute urgence pour faire face à la hausse et la propagation de la tuberculose pharmacorésistante. Cependant, la progression de la recherche sur la tuberculose est en proie à des modèles traditionnels d'infection des mammifères qui sont coûteux, longs et éthiquement difficiles. Auparavant, nous avons établi les larves de l'insecte Galleria mellonella (plus grand papillon de cire) comme un nouveau modèle d'infection reproductible, à faible coût, à haut débit et éthiquement acceptable pour les membres du complexe M. tuberculosis. Ici nous décrivons l'entretien, la préparation, et l'infection de G. mellonella avec le Mycobacterium bioluminescent bovis BCG lux. À l'aide de ce modèle d'infection, la virulence dépendante de la dose mycobactérienne peut être observée, et une lecture rapide de la charge mycobactérienne in vivo à l'aide de mesures de bioluminescence est facilement réalisable et reproductible. Bien qu'il existe des limites, comme l'absence d'un génome entièrement annoté pour l'analyse transcriptomique, une analyse ontologique contre des insectes génétiquement similaires peut être effectuée. Comme modèle à faible coût, rapide et éthiquement acceptable pour la tuberculose, G. mellonella peut être utilisé comme pré-écran pour déterminer l'efficacité et la toxicité des médicaments, et pour déterminer la virulence mycobactérienne comparative avant l'utilisation de mammifères conventionnels Modèles. L'utilisation du modèle G. mellonella-mycobacteriapermettra de réduire le nombre important d'animaux actuellement utilisés dans la recherche sur la tuberculose.
Introduction
La tuberculose est une menace majeure pour la santé publique mondiale avec 9 millions de nouveaux cas par an et 1,5 million de décès1. En outre, on estime qu'un quart de la population mondiale est infectée par l'agent causal de la maladie, Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Parmi la population infectée, 5 à 10 % développeront une tuberculose active au cours de leur vie. En outre, l'émergence et la propagation de MTB multirésistants (MDR) et résistants aux médicaments (XDR) constitue une menace sérieuse pour la lutte contre la maladie, 123 pays signalant au moins un cas de XDR1. Le traitement de la tuberculose nécessite un cocktail d'au moins quatre médicaments antimycobactériens, dont l'isoniazide et la rifampicine sont prescrites pour une durée minimale de six mois; le traitement est souvent associé aux effets secondaires et aux toxicités complexes. La protection contre le seul vaccin homologué contre la tuberculose, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), est variable2. Une compréhension incomplète de la pathogénie de la tuberculose entrave considérablement l'élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques et de vaccination.
Pendant des décennies, les modèles d'infection animale ont été essentiels pour la recherche sur la tuberculose afin de comprendre la pathogénie de base et la réponse de l'hôte à l'infection, et d'évaluer de nouveaux agents antimycobactériens, immunothérapeutiques et de nouveaux vaccins candidats3, 4. Cependant, la recherche utilisant des modèles d'infection animale de la tuberculose est notoirement difficile car la pathogénie et la progression de l'infection à tuberculose sont complexes, et il n'existe pas de modèle animal unique qui imite le spectre complet et les caractéristiques importantes de la maladie5 ,6. En outre, les expériences sur les animaux sont coûteuses, prennent beaucoup de temps à entreprendre et nécessitent une justification éthique complète. Néanmoins, des modèles d'infection animale de la tuberculose ont été décrits chez des primates non humains (p. ex. macaques), des cobayes, des lapins, des bovins, des porcs, des souris et des poissons zèbres, chacun ayant ses limites3,4. Le modèle murine est le modèle le plus couramment utilisé en raison du coût, de la disponibilité des lignées consanguines, de la reproductibilité de l'infection et de l'abondance des réactifs immunologiques. Cependant, ils ne forment généralement pas de granulomes associés à des zones d'hypoxie qui sont caractéristiques de l'infection tuberculeuse latente (LTBI)6. Les cochons d'Inde sont très sensibles à l'infection à Mtb, avec une pathologie et une formation précoce de granulomes semblables à ceux chez l'homme, et sont largement utilisés dans les tests de vaccination; pourtant, l'absence de réactifs immunologiques entrave leur utilisation comme modèle d'infection7. Les poissons zèbres conviennent au dépistage à grande échelle dans les études précliniques à un stade précoce en raison de leur petite taille, de leur reproduction rapide et de leurs outils génétiques avancés, mais ils sont anatomiquement et physiologiquement différents des humains et ne sont Mycobacterium marinum infection3. Les modèles animaux qui ressemblent le plus étroitement à l'infection humaine de Mtb sont les primates non humains (par exemple, le macaque), mais ils sont chers et ont des considérations éthiques et pratiques importantes qui limitent considérablement leur utilisation8.
La larve d'insecte de la plus grande teigne de cire ou papillon de nuit nid d'abeilles,Galleria mellonella, sont devenus de plus en plus populaires comme modèle d'infection pour une variété d'agents pathogènes bactériens et fongiques9, et comme un écran pour les nouveaux candidats aux médicaments antimicrobiens 10. G. mellonella est un modèle d'invertébré réussi en raison de son système immunitaire inné sophistiqué (composé de défenses cellulaires et humoristiques) qui partage un degré élevé de similitude structurale et fonctionnelle à celle des vertébrés11 . Cela comprend les mécanismes immunitaires tels que la phagocytose des agents pathogènes par les hémocytes (fonctionnellement similaires aux macrophages et aux neutrophiles des mammifères)12,13, la production et la circulation de peptides antimicrobiens (AMP) et protéines de type complément dans l'hémolymphe (analogue au sang de mammifères) de G. mellonella11. D'autres avantages9,14,15 de larves de G. mellonella comme modèle comprennent 1) leur grande taille (20-30 mm) qui permet une manipulation facile et l'infection, ainsi que la collecte de tissus et hémolymphe pour les analyses, 2) entretien facile à 37 oC, compatible pour l'étude des agents pathogènes humains, 3) infection précise par injection sans besoin d'anesthésie, 4) l'efficacité des agents antimicrobiens peut être évaluée en utilisant moins de médicament pour l'évaluation, 5) l'absence de contraintes éthiques par rapport à l'utilisation des mammifères, 6) grandes tailles de groupe peuvent être utilisés par rapport aux modèles animaux permettant une plus grande reproductibilité, et 7) des temps plus courts pour les expériences d'infection sont nécessaires.
Dans une étude récente, nous avons démontré que G. mellonella peut être utilisé comme un nouveau modèle d'infection pour étudier la pathogénie de l'infection par bioluminescent M. bovis BCG lux, une version génétiquement modifiée de la souche vaccinale et membre du complexe Mtb (MTBC)16. Alors que G. mellonella a déjà été utilisé comme modèle d'infection pour les mycobactéries non tuberculeuses (NTM), principalement M. marinum et Mycobacterium abcès17,18, les études utilisant MTBC sont limitées à celle de Li et coll.16. Les souches mycobactériennes bioluminescentes non pathogènes, qui peuvent être utilisées au niveau de confinement (CL) 2 comme substitut pour Mtb, offrent les avantages de la sécurité et de la praticité par rapport aux mycobactéries pathogènes. Après l'infection par le BCG lux, les larves commencent à développer des structures précoces ressemblant à des granulomes, ce qui pourrait fournir un aperçu précieux du rôle de l'immunité innée dans l'établissement de l'infection tuberculeuse16. En outre, ce modèle simple d'infection des invertébrés a le potentiel de fournir une évaluation rapide, peu coûteuse et fiable de la pathogénie de tb(e) incorporant le défi contrôlé et les répétitions multiples pour la reproductibilité. En outre, le modèle a le potentiel d'être utilisé pour dépister les nouveaux médicaments antituberculeux et les candidats vaccins dans le développement précoce, réduisant le nombre global d'animaux dans l'expérimentation. La capacité de mesurer les changements dans la structure de l'hôte et des agents pathogènes, le transcriptome et le protéome pour déterminer les cibles des médicaments et évaluer les mécanismes d'action des nouveaux médicaments et des vaccins thérapeutiques, sont également avantageuses.
Nous décrivons ici les protocoles expérimentaux pour la préparation d'un bioluminescent M. bovis BCG lux inoculum et les larves de G. mellonella pour l'infection mycobactérienne, ainsi que la détermination des larves et mycobactériennes survie en réponse à l'infection.
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Protocol
REMARQUE : Tous les travaux décrits ci-dessous doivent être effectués dans un laboratoire CL2 dans un cabinet de sécurité microbiologique de classe 2 (MSC) suivant les directives locales en matière de santé et de sécurité.
1. Préparation de M. bovis BCG lux pour l'infection
- Dégeler un glycérol congelé de 1,2 ml (15 %) stock de M. bovis BCG lux, la souche vaccinale de Montréal transformée avec le plasmide de la navette pSMT1 portant les gènes luxAB de Vibrio harveyi codant l'enzyme de la luciferase19.
- Inoculer 15 ml de bouillon Middlebrook 7H9 contenant 0,2 % de glycérol, 10 % d'albumine, dextrose, de catalase (ADC) d'enrichissement et 50 g/mL d'hygromycine avec un aliquot décongelé de 1,2 mL de BCG lux, dans un flacon Erlenmeyer étiqueté de 250 mL.
- Placer le flacon dans un contenant de biosécurité scellé et couver à 37 oC dans un incubateur de shaker orbital à 220 tr/min pendant 72 h (ou jusqu'à ce que la culture atteigne la phase de croissance à mi-log).
- Vérifiez la croissance de la culture bcG lux en préparant 1:10 dilutions de la culture dans des tubes luminomètres à l'aide de phosphate tamponné saline (PBS, pH 7,4, 0,01 M tampon de phosphate, 0,0027 M chlorure de potassium et 0,137 M de chlorure de sodium) en double. Vortex, et charger les tubes de luminomètre dans le luminomètre et mesurer la bioluminescence (unité de lumière relative [RLU]/mL) en utilisant l'aldéhyde n-decyl comme substrat (1% v/v dans l'éthanol absolu)20.
REMARQUE: Le rapport des unités de formation de RLU/colonie (CFU) a été précédemment déterminé pour être 3:1 quand le lux de BCG a été cultivé in vitro dans le bouillon 7H9 de Middlebrook20. - Centrifuger la culture à 2 175 x g pendant 10 min à température ambiante pour granuler les cellules et jeter le supernatant dans un désinfectant approprié avec l'activité mycobactéricale connue. Éliminer tous les déchets de culture avec des désinfectants appropriés pour les mycobactéries selon les directives locales.
- Laver la pastille cellulaire deux fois en PBS contenant 0,05% polysorbate 80 (PBS-T) pour prévenir l'agglutination bactérienne.
- Après le lavage final, décanter supernatant de déchets, resuspendre le granule de cellules mycobactériennes dans PBS-T et diluer la suspension mycobactérienne à la densité cellulaire désirée à l'aide de mesures RLU.
- Préparer des dilutions en série décuplées de l'inoculum dans des plaques de 24 puits à l'aide de PBS-T. Déposer 10 l sur les plaques d'agar Middlebrook 7H11 (0,5 % de glycérol, 50 g/mL d'hygromycine, 10 % d'acide oléique, d'albumine, de dextrose, de catalase [OADC]) en double pour énumérer les comptes de cFU d'inoculum.
2. Préparation des larves de G. mellonella
- Achetez les dernières larves instar de sources appropriées et maintenez les larves dans l'obscurité à 18 oC à l'arrivée et utilisez-les dans la semaine suivant l'achat. Alternativement, les larves peuvent être auto-enlevées selon le protocole de Jojoo et coll.21. Pour les larves achetées, jetez les larves mortes, décolorées ou puantes avant l'entreposage.
REMARQUE: Les larves puantes se distinguent morphologiquement des dernières larves instar. - Identifier et sélectionner des larves saines pour l'expérimentation, en fonction de la couleur crème uniforme avec peu ou pas de décoloration (mélanisation), la taille (2-3 cm de longueur), le poids (environ 250 mg), affichant un niveau élevé de motilité, et possédant la capacité de redresser eux-mêmes lorsqu'ils sont retournés.
- Compter soigneusement les larves saines (minimum de 20 à 30 par groupe) dans un plat Petri (94/15 mm) tapissé d'une couche de papier filtre (94/15 mm) à l'aide d'une pince à bout émoussé pour minimiser la contamination et ranger à température ambiante dans l'obscurité jusqu'à l'utilisation.
3. Infecter G. mellonella avec bcG lux
- Réduire au minimum l'encombrement au sein du SMC afin de réduire le risque de contamination et de blessures par tige d'aiguille.
- Préparer la plate-forme d'injection en scotchant un papier filtre circulaire (94 mm) sur une surface plane surélevée. Les surfaces molles ou dures peuvent être utilisées et dépendent entièrement de la préférence de l'utilisateur, par exemple, des couvercles de boîte de pipette ou une éponge de récurage en nylon.
- Stériliser une microseringue de 25 l (25 G) en aspirant 3 volumes d'éthanol à 70 % et rincer davantage avec 3 volumes de PBS-T stérile.
- Aspirez 10 l d'inoculum BCG lux (préparé à la section 1) ou PBS-T dans la microseringue stérilisée de 25 l.L. Utilisez une seringue séparée pour le contrôle négatif PBS-T.
REMARQUE: Resuspendre l'inoculum BCG lux après 10 injections pour assurer une suspension cellulaire uniforme. - Utilisez une pince à épiler pour ramasser une larve et placez-la sur la plate-forme d'injection.
- Sur la plate-forme, retourner la larve sur son dos et immobiliser en fixant la tête et la queue avec la pince à épiler. Localisez le dernier proleg gauche à rebours à partir de la tête de la larve et insérez soigneusement l'extrémité de l'aiguille (5 à 6 mm) à un angle de 10 à 20 degrés par rapport au plan horizontal.
REMARQUE: Les pinces courtes et étroites permettent une immobilisation facile avec un minimum de stress larvaire. Faites attention à ne pas trop pénétrer qui peut perforer l'intestin et causer non-BCG lux mélanisation spécifique ou la mort. - Comptez les larves infectées dans un plat Petri tapissé d'une couche de papier filtre, un seul plat Petri de 90 mm peut accueillir jusqu'à 30 larves.
- Conserver le plat Petri contenant les larves dans une boîte noire ventilée ou nonscellée à l'intérieur d'un incubateur à 37 oC avec 5 % de CO 2.
4. Surveillance de la survie de G. mellonella après l'infection
- Au fil du temps, surveiller la survie des larves tous les 24 h. Les larves sont considérées comme mortes lorsqu'elles ne se déplacent pas en réponse au toucher.
5. Mesurer le fardeau in vivo du bcG lux dans G. mellonella
- À chaque moment, sélectionnez au hasard cinq larves infectées préalablement préparées à la section 3 et stérilisez délicatement les surfaces larvaires à l'aide d'écouvillons de coton imbibés d'éthanol à 70 %.
REMARQUE: Cette étape est importante lorsque le placage homogénéisé larvaire pour l'énumération mycobactérienne de l'UFC, car les larves non stérilisées peuvent entraîner une contamination. - Placer les larves individuellement dans des tubes de matrice de lysing de 2 ml contenant 800 l de PBS stérile.
- Homogénéiser les larves à l'aide d'un homogénéisateur pour 60 s à 6,0 m/s.
- Centrifuger les tubes de lysing à 3500 x g pour 5 s pour enlever l'homogénéisation des couvercles, et décanter soigneusement l'homogénéiser en tubes de luminomètre stériles individuellement.
REMARQUE: Pour l'énumération de l'UFC (étape 5.7), assurez-vous de réserver 100 l d'homogénéisation dans un tube de réaction stérile de 1,5 ml. - Récupérer tout homogénéisme restant en lavant les tubes de matrice de lysing avec 1 ml de PBS-T et pipette dans les tubes de luminomètre correspondants.
- Vortex les tubes de luminomètre et mesurer la bioluminescence des homogénéates précédemment décrites à l'étape 1.4.
- Préparer des dilutions en série décuplées de l'homogénéisme dans des plaques de culture de 24 puits à l'aide de PBS-T. Déposer 10 l l de la dilution sur les plaques d'agar de Middlebrook 7H11 contenant 0,5 % de glycérol, 50 g/mL d'hygromycine, 10 % d'OADC et 20 g/mL de piperacillin, afin de déterminer le ratio RLU/CFU de BCG lux après une infection in vivo.
REMARQUE: Piperacillin élimine le microbiote g. mellonella indigène avec l'inhibition minimale de croissance de BCG lux16.
6. Analyse statistique
- Tracer la courbe de survie Kaplan-Meier à l'aide des données recueillies et effectuer le test Mantel-Cox (Log-rank) pour déterminer l'importance du résultat, où le résultat est le «p 'lt; 0,05, 'p 'lt; 0.01, 'p 'lt; 'lt, et 'p 'lt; 0.0001.
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Representative Results
Nous présentons ici des données représentatives qui peuvent être obtenues à l'aide du modèle d'infection à lux de G. mellonella — BCG et soulignons les avantages de G. mellonella en tant que modèle d'infection pour les membres du MTBC (Figure 1). Les procédures expérimentales avec des points techniques clés sont décrites à la figure 2.
Figure 1 : Les avantages de G. mellonella en tant que modèle d'infection. Ce chiffre a été adapté de Kavanagh et Sheehan22. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Aperçu des procédures expérimentales. (A) Entretien et préparation de G. mellonella pour l'infection par M. bovis BCG lux. (B) Préparation de la culture bcG lux et de l'inoculum pour l'infection. (C) Infection de G. mellonella avec BCG lux. (D) Mesure de la virulence et de la charge in vivo du BCG lux chez les larves de G. mellonella. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
La virulence dépendante de la dose de lux de BCG a été observée chez les larves de G. mellonella sur une période d'incubation de 96 h (figure3),et la dose létale requise pour la mortalité larvaire de 50 % (LD50)a été déterminée comme étant de 1 x 107 UFC. La distribution de survie reflétant la virulence des doses de lux de BCG examinées était sensiblement différente (p lt ; 0.0001). Les groupes témoins injectés avec une dose de PBS-T de 10 L ou ceux qui ont simplement piqué simulant des blessures à l'aiguille, n'ont pas affecté la santé des larvaires ou n'ont pas entraîné une augmentation de la mortalité déterminée par des vérifications observationnelles de la motilité et de la milification à différents moments.
Figure 3 : Courbe de survie Kaplan-Meir de G. mellonella en réponse à des inocula variables de M. bovis BCG lux. Les larves en bonne santé (n - 10 par groupe), ont été infectées par des doses variables de LUXBCG . Les larves ont été incubées à 37 oC et surveillées pour leur survie toutes les 24 h jusqu'à 96 h. Le groupe non infecté a été injecté avec PBS, et un groupe piqué (insertion de l'aiguille seulement) a démontré l'effet des dommages d'aiguille sur la santé larvaire. Les moyens de deux expériences indépendantes sont montrés, avec un intervalle de confiance de 95%, représentés comme des lignes pointillées dans la couleur correspondante à l'inoculum. Ce chiffre a été adapté de Li et coll.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Toutes les larves infectées par le BCG lux ont montré des changements physiologiques au fil du temps et, pour les larves infectées par une dose de 2 x 107 CFU de BCG lux, la mélanisation de la lignée dorsal larvaire a été observée à partir de 48 h après l'infection (pi), et la mélanisation systématique de la lignée dorsal larvaire a été observée à partir de 48 h après l'infection (pi), et la mélanisation systématique de la lignée dorsal larvaire a été observée à partir de 48 h après l'infection (pi), et la mélanisation systématique de la lignée dorsal larvaire a été observée à partir de 48 h après l'infection (pi), et la mélanisation systématique de la lignée d la mélanisation a été observée à partir de 96 h pi (Figure 4). En outre, la motilité des larves a diminué avec la sévérité de la mélanisation et la capacité des larves à la pupe a été perdue lors de l'infection par rapport aux témoins non infectés.
Figure 4 : Mélanisation de G. mellonella en réponse à une infection par M. bovis BCG lux. Les larves saines à 0 h ont été infectées par une dose de 2 x 107 CFU de BCG lux. À 48 h et 96 h pi, la milisation le long de la ligne dorsal larvaire et la milisation systématique, respectivement, ont été observées.
La survie du BCG lux dans les larves de G. mellonella a été déterminée sur 2 semaines par la mesure de bioluminescence des homogénéates larvaires. L'infection avec une dose de 1 x 107 CFU de BCG lux a eu comme conséquence une baisse initiale de la bioluminescence de lux de BCG de 0-72 h pi. Cependant, de 72 à 144 h pi, la bioluminescence du BCG lux a plafonné, ce qui indique l'établissement d'une infection persistante (figure 5).
Figure 5 : Charge in vivo de M. bovis BCG lux dans G. mellonella quantifié e à l'aide de la bioluminescence (unité de lumière relative, RLU/mL) sur un cours de deux semaines. Les larves en bonne santé (n et 30) ont été infectées par 1 x 107 dose de BCFU lux. La charge in vivo a été quantifiée en homogénéisant cinq larves à chaque moment (0, 24, 48, 72, 96, 168, 336 h), et en mesurant la bioluminescence de l'homogénéisme. Les moyens de trois expériences indépendantes sont montrés, et les barres d'erreur représentent l'écart standard de la moyenne. Ce chiffre a été réimprimé à partir de Li et al.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Comme la quantification rapide et reproductible de la croissance mycobactérienne in vivo dans ces études a été déterminée par la mesure de la bioluminescence, le rapport de RLU et de CFU devrait également être déterminé in vivo. Dans notre système d'infection particulier, le rapport in vivo de RLU et de CFU variait de 2:1-5:1, avec une moyenne de 4:1 sur le parcours de 168 heures (figure6).
Figure 6 : Détermination du rapport in vivo RLU/CFU de M. bovis BCG lux in G. mellonella. Les larves en bonne santé (n et 30) ont été infectées par 1 x 107 dose de BCFU lux. À chaque moment (0, 24, 96 et 168 h), quatre larves infectées/témoins (PBS-T) ont été homogénéisées, et les homogénéités ont été mesurées pour la bioluminescence et plaquées sur une gélose 7H11 pour énumérer les dénombrements de l'UFC. Les moyens de deux expériences indépendantes sont montrés et les barres d'erreur représentent l'écart standard de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
L'utilisation de G. mellonella comme modèle d'infection a été établie pour un certain nombre d'agents pathogènes bactériens et fongiques pour l'étude de la virulence, l'interaction hôte-pathogène, et comme un écran pour les nouvelles thérapeutiques10,22. La discussion suivante est basée sur la procédure expérimentale pour l'utilisation de G. mellonella comme modèle d'infection pour le MTBC.
La santé des larves naïves avant l'expérimentation peut avoir un impact considérable sur les résultats de l'expérience. Par conséquent, il est essentiel que les larves décolorées et/ou blessées soient enlevées à leur arrivée et ne soient utilisées pour aucune expérimentation. Si un grand nombre de larves sont retrouvées mortes dans le même contenant à l'arrivée, il est conseillé de jeter le lot car les infections préexistantes peuvent être la cause du décès. Dans la mesure du possible, effectuez des expériences à l'aide des larves aussi près du jour de l'achat ou de l'arrivée. Avant l'utilisation, assurez-vous de stocker les larves à 18 oC afin de prévenir la pupaison et de maximiser le nombre de larves disponibles pour l'expérimentation. Les larves saines peuvent être utilisées jusqu'à 7 jours après la livraison ou l'achat. Après l'infection, assurez-vous d'enlever les larves mortes du plat Petri car, pour des raisons encore inconnues, la présence de larves mortes semble augmenter le taux de mortalité dans la population de l'échantillon. Pour les utilisateurs de larves auto-rémunères, il est important d'être conscient de la variabilité biologique par rapport aux larves achetées, car la variance dans l'alimentation et les conditions de croissance peut avoir un impact sur l'immunité larvaire21,23. Les variations interexpérimentales peuvent être limitées en gardant la source, si elle est achetée, ou les conditions d'alimentation et de croissance des larves d'élevage compatibles entre l'expérimentation. Dans toutes les expériences, l'inclusion de contrôles négatifs « vides » et « piqués » est essentielle; le contrôle vierge est un indicateur de contamination ou de toxicité de la matrice de suspension (PBS-T ou bouillon de milieu), et le contrôle piqué imite l'effet de la blessure d'aiguille sur la santé larvaire. En outre, ces contrôles normalisent toute variation biologique entre les lots de larves, assurant la reproductibilité et la précision entre les expériences.
Pour l'injection de larves de G. mellonella, l'utilisation d'une aiguille de 25 G est recommandée car des aiguilles de jauge plus grandes peuvent causer des saignements excessifs et des aiguilles plus petites peuvent facilement perforer l'intestin des larves, ce qui entraîne une mortalité larvaire et un faux positif. Résultats. Les méthodes conventionnelles d'injection d'aiguilles immobilisent généralement les larves à la main, ce qui augmente le risque de blessures par aiguille. En utilisant des pinces pour immobiliser les larves, le risque de blessure par bâton d'aiguille est considérablement réduit car la main n'est pas à proximité de l'aiguille à tout moment pendant l'infection. Alternativement, les larves pourraient être immobilisées par refroidissement. Cependant, un choc à froid de 12 oC pendant 15 minutes avant l'infection a été documenté pour améliorer la réponse immunitaire innée à l'infection. Par conséquent, l'analyse des résultats obtenus par refroidissement devrait examiner attentivement son impact24. Grâce à notre technique, un débit moyen d'injection (2/3 larves par minute) peut être atteint avec la pratique de l'utilisateur; ceci est comparable à la vitesse d'injection conventionnelle de notre expérience (3/4 larves par min). En outre, notre méthode peut être adaptée pour l'injection de débit plus élevé en utilisant une plate-forme d'injection à pédales composée d'une pompe à perfusion avec une seringue jetable reliée à une canule papillon de 25 G.
La préparation de BCG lux inoculum est basée sur l'estimation rapide de CFU en utilisant RLU de la culture mycobactérienne20. Dans notre expérience avec la culture de bouillon, le rapport de RLU à CFU est 3:120, contrastant avec le luxe bcG de plus en plus dans G. mellonella où le rapport RLU à CFU est de 5:120. L'agrégation de cellules mycobactériennes ou « agrégation » couramment observée dans les cultures denses peut avoir un impact sur les mesures RLU, car l'agglutinage peut entraîner des mesures de bioluminescence peu fiables. En tant que tel, l'utilisation de la culture mycobactérienne agglomérée pour la préparation de l'inoculum n'est pas recommandée. Cependant, l'ajout de polysorbate 80 au support de croissance minimise l'agglutination cellulaire sans altérer la croissance du BCG lux. 16 Tout amas de cellules mineures peut être résolu en lavant la culture avec PBS-T et est essentiel pour préparer un inoculum précis en utilisant RLU comme lecture. En outre, le lavage PBS-T est essentiel pour éliminer tout facteur de virulence extracellulaire sécrété pendant la croissance. La contrainte mycobactérienne et le numéro de passage doivent également être pris en considération, car cela peut avoir un impact sur la gravité de l'agrégation mycobactérienne25. Dans tous les cas, l'inoculum doit être énuméré par CFU sur les plaques d'agar 7H11 pour s'assurer que le CFU correct a été préparé par la mesure de bioluminescence. En outre, le rapport RLU/CFU in vivo devrait être déterminé avec de nouveaux reporters bioluminescents ou des stocks, car le ratio variera probablement.
G. mellonella détient plusieurs avantages par rapport aux modèles conventionnels d'infection par la tuberculose, y compris des coûts d'acquisition et d'entretien moins élevés, la facilité d'infection et le débit de recherche, en particulier en combinaison avec les souches bioluminescentes16. L'absence de contraintes éthiques permet une plus grande taille de l'échantillon (minimum de 20 à 30 larves par groupe) par rapport aux modèles de mammifères, ce qui donne plus de confiance et de fiabilité dans les résultats obtenus26,27. Cependant, il y a un certain nombre de limitations dans l'utilisation de G. mellonella comme modèle d'infection. En tant qu'invertébrés, ils manquent naturellement d'immunité adaptative les rendant impropres aux études antigéniques ou immunologiques10. Les réponses immunitaires innées cellulaires de G. mellonella sont composées d'un certain nombre de types d'hémocytes, et les plasmatocytes et les granulocytes ont été rapportés pour fonctionner de façon semblable aux phagocytes mammifères (neutrophiles et macrophages)12. Cependant, le rôle et les mécanismes de ces types de cellules restent sous-caractérisés, et des études comparatives directes entre les phagocytes de mammifères et d'insectes n'ont pas encore été effectuées. En outre, l'absence d'un génome annoté de G. mellonella entrave l'analyse de la réponse de l'hôte à l'infection, et cela dépend actuellement de l'analyse génique ontologie contre les bibliothèques transcriptomiques d'autres invertébrés, tels que Drosophila melanogaster et Bombyx mori28.
En tant que modèle d'infection tuberculeuse, G. mellonella a un avenir prometteur avec sa capacité à développer des structures de type granulome en réponse à l'infection bcG lux 16, qui sont des caractéristiques pathophysiologiques vitales de l'infection tuberculeuse et sont une clé dans le développement de LTBI. Les travaux futurs viseront à caractériser ce modèle avec un intérêt particulier dans la formation de structures de type granulome à l'aide d'isolats Mtb de référence, cliniques et mutants dans des conditions CL3. En outre, nous prévoyons qu'il peut également être utile pour le dépistage des nouveaux agents antimycobactériens, comme un modèle similaire G. mellonella a été utilisé pour les MNT18, mais cela reste à déterminer. L'adoption de ce modèle a la capacité de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés au sein de la communauté de recherche sur la tuberculose, tout en accélérant simultanément la production de recherche in vivo sur la tuberculose dans des conditions éthiquement plus acceptables.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce projet a été soutenu par des subventions du Biotechnology and Biological Science Research Council (BBSRC), accordées à PRL et YL (BB/P001262/1), et du National Center for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs) décernée à PRL, SMN, BDR et YL (NC/R001596/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
| 20, 200 and 1,000 µL pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
| 24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
| 25 mL pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
| 3 compartment Petri dish (94/15 mm) | Greiner | 637102 | |
| Centrifuge | Any supplier | n/a | |
| Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
| Erlenmeyer flask with vented cap (250 mL) | Corning | CLS40183 | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
| Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
| Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
| Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
| Lysing matrix (S, 2.0 mL) | MP Biomedicals | 116925500 | |
| Micro syringe (25 µL, 25 G) | SGE | 3000 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
| Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
| Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
| n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
| Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
| Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
| Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
| Petri dish (94/15 mm) | Greiner | 633181 | |
| Filter paper (94 mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |
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