गैलेरिया मेलोनेला हाल ही में माइकोबैक्टीरियम तपेदिक परिसर के लिए एक पुनरुत्पाद्य, सस्ते, और नैतिक रूप से स्वीकार्य संक्रमण मॉडल के रूप में स्थापित किया गया था। यहाँ हम वर्णन और bioluminescent माइकोबैक्टीरियम बीवीजी बीसीजी लक्स के साथ जी melonella के सफल संक्रमण स्थापित करने के लिए उठाए गए कदमों का वर्णन और प्रदर्शन.
क्षय रोग संक्रामक रोग मृत्यु का प्रमुख वैश्विक कारण है और दुनिया की लगभग एक चौथाई आबादी माइकोबैक्टीरियम तपेदिकसे संक्रमित माना जाता है. अनुसंधान के दशकों के बावजूद, एक रोगजनक जीव के रूप में एम तपेदिक की सफलता के पीछे कई तंत्र की जांच की जानी शेष है, और वृद्धि से निपटने के लिए सुरक्षित, अधिक प्रभावी एंटीमाइकोबैक्टीरियल दवाओं के विकास की तत्काल आवश्यकता है और दवा प्रतिरोधी तपेदिक का प्रसार। हालांकि, तपेदिक अनुसंधान की प्रगति पारंपरिक स्तनधारी संक्रमण मॉडल है कि महंगे हैं, समय लेने वाली है, और नैतिक रूप से चुनौतीपूर्ण द्वारा bottlenecked है. इससे पहले हमने एम तपेदिक परिसर के सदस्यों के लिए एक उपन्यास, पुन: उत्पादनीय, कम लागत, उच्च-थ्रूपुट और नैतिक रूप से स्वीकार्य संक्रमण संक्रमण मॉडल के रूप में कीट गैलेरिया मेलोनेला (महान मोम कीट) के लार्वा की स्थापना की। यहाँ हम रखरखाव, तैयारी, और bioluminescent माइकोबैक्टीरियम bovis बीसीजी लक्स के साथ जी melonella के संक्रमण का वर्णन. इस संक्रमण मॉडल का उपयोग करना, माइकोबैक्टीरियल खुराक निर्भर उग्रता मनाया जा सकता है, और bioluminscence माप का उपयोग कर vivo माइकोबैक्टीरियल बोझ में की एक तेजी से readout आसानी से प्राप्त करने और reproduible है. हालांकि सीमाएं मौजूद हैं, जैसे ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए पूरी तरह से एनोटेट जीनोम की कमी, आनुवंशिक रूप से समान कीड़ों के खिलाफ तार्किक विश्लेषण किया जा सकता है। तपेदिक के लिए एक कम लागत, तेजी से, और नैतिक रूप से स्वीकार्य मॉडल के रूप में, जी मेलोनेला दवा प्रभावकारिता और विषाक्तता का निर्धारण करने के लिए एक पूर्व स्क्रीन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और पारंपरिक स्तनधारी के उपयोग से पहले तुलनात्मक माइकोबैक्टींगिक उग्रता निर्धारित करने के लिए मॉडल. जीमेलोनेला-माइकोबैक्टीरिया मॉडल के उपयोग से तपेदिक अनुसंधान में वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले पशुओं की पर्याप्त संख्या में कमी आएगी।
क्षय रोग (टीबी) वैश्विक जन स्वास्थ्य के लिए एक बड़ा खतरा है जिसमें प्रति वर्ष 9 मिलियन नए मामले और 15 मिलियन मौतें1. इसके अतिरिक्त, यह अनुमान लगाया गया है कि विश्व की एक चौथाई जनसंख्या रोग के कारक एजेंट, माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (एमटीबी) से संक्रमितहै। संक्रमित आबादी के बीच, 5 डिग्री 10% अपने जीवनकाल में सक्रिय टीबी रोग का विकास होगा। इसके अलावा, बहु-औषध प्रतिरोधी (एमडीआर) और बड़े पैमाने पर दवा (एक्सडीआर) प्रतिरोधी Mtb के उद्भव और प्रसार रोग नियंत्रण के लिए एक गंभीर खतरा बन गया है, 123 देशों के साथ कम से कम एक XDR मामले1रिपोर्टिंग . टीबी के उपचार के लिए कम से कम चार एंटी-माइकोबैक्टीरियल दवाओं के कॉकटेल की आवश्यकता होती है, जिनमें से आइसोनियाज़्ड और रिफाम्पिकिन को कम से कम छह महीने की अवधि के लिए निर्धारित किया जाता है; उपचार अक्सर जटिल दुष्प्रभाव और toxicities के साथ जुड़ा हुआ है. टीबी के खिलाफ केवल लाइसेंस प्राप्त टीके से संरक्षण, माइकोबैक्टीरियम बोविस बैसिलस कलमेट-गुएरिन (बीसीजी), चर2है। टीबी के रोगजनन की एक अधूरी समझ नई चिकित्सीय और टीकाकरण रणनीतियों के विकास में काफी बाधा डालती है।
दशकों के लिए पशु संक्रमण मॉडल टीबी अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण किया गया है बुनियादी रोगजनन और संक्रमण के लिए मेजबान प्रतिक्रिया को समझने के लिए, और उपन्यास विरोधी mycobactrial एजेंटों का मूल्यांकन करने के लिए, प्रतिरक्षा चिकित्सा और नए टीका उम्मीदवारों3, 4. हालांकि, टीबी के पशु संक्रमण मॉडल का उपयोग कर अनुसंधान बेहद मुश्किल है क्योंकि रोगजनन और टीबी संक्रमण की प्रगति जटिल है, और कोई भी पशु मॉडल नहीं है जो पूरे स्पेक्ट्रम और रोग की महत्वपूर्ण विशेषताओं की नकल करता है5 ,6. इसके अलावा, पशु प्रयोगों महंगे हैं, समय लेने के लिए शुरू करने और पूर्ण नैतिक औचित्य की आवश्यकता है. फिर भी, टीबी के पशु संक्रमण मॉडल गैर मानव primates में वर्णित किया गया है (उदा., मैकैक), गिनी सूअर, खरगोश, पशु, सूअर, चूहों और ज़ेब्राफ़िश, प्रत्येक अपनी सीमाओं के साथ3,4. Murine मॉडल लागत, inbred लाइनों की उपलब्धता, संक्रमण की reproducibility और प्रतिरक्षा अभिकर्मकों की बहुतायत के कारण सबसे अधिक इस्तेमाल किया मॉडल है। हालांकि, वे आम तौर पर गुप्त तपेदिक संक्रमण (एलटीबीआई)6की विशेषता है कि hypoxia के क्षेत्रों के साथ जुड़े granuomaas फार्म नहीं है. गिनी सूअरों अत्यधिक Mtb संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, विकृति और जल्दी दानेदार गठन मनुष्यों में उन लोगों के समान के साथ, और व्यापक रूप से टीका परीक्षण में उपयोग किया जाता है; फिर भी इम्यूनोलॉजिकल अभिकर्मकों की कमी संक्रमण मॉडल7के रूप में उनके उपयोग में बाधा डालती है . ज़ेबराफ़िश उनके छोटे आकार, तेजी से प्रजनन और उन्नत आनुवंशिक उपकरणों के कारण प्रारंभिक चरण पूर्व नैदानिक अध्ययन में बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त हैं, लेकिन शारीरिक और शारीरिक रूप से मनुष्यों के लिए अलग हैं और केवल करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं माइकोबैक्टीरियम मारिनम संक्रमण3| पशु मॉडल सबसे बारीकी से मानव Mtb संक्रमण के समान गैर मानव primates हैं (जैसे, मैके), लेकिन वे महंगे हैं और महत्वपूर्ण नैतिक और व्यावहारिक विचार है जो काफी उनके उपयोग को सीमित करता है8.
अधिक मोम कीट या मधुकोश कीट, गैलेरिया मेलोनेला का कीट लार्वा , विभिन्न प्रकार के जीवाणु और कवक रोगजनकोंकेलिए संक्रमण मॉडल के रूप में तेजी से लोकप्रिय हो गया है , और उपन्यास एंटीमाइक्रोबियल दवा उम्मीदवारों के लिए एक स्क्रीन के रूप में 10. जी मेलोनेला अपने परिष्कृत सहज प्रतिरक्षा प्रणाली (सेल्यूलर और हास्य सुरक्षा के साथ) के कारण एक सफल अकशेरुकी मॉडल है जो कशेरुकियों 11 के लिए संरचनात्मक और कार्यात्मक समानता के एक उच्च डिग्री के शेयरों . इसमें हेमोसाइट्स द्वारा रोगजनकों के फैगोसाइटोसिस जैसे प्रतिरक्षा तंत्र शामिल हैं (कार्यात्मक रूप से स्तनधारी मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल के समान)12,13, एंटी-माइक्रोबायल पेप्टाइड्स (एएमपी) का उत्पादन और परिसंचरण और जी मेलोनेला11के हेमोलिम्फ (स्तनीय रक्त के अनुरूप) के भीतर पूरक प्रोटीन की तरह । अन्य लाभ9,14,15 जी मेलोनेला लार्वा के एक मॉडल के रूप में शामिल 1) उनके बड़े आकार (20 डिग्री 30 मिमी) जो आसान हेरफेर और संक्रमण के लिए अनुमति देता है, साथ ही ऊतक के संग्रह और विश्लेषण के लिए हेमोलिम्फ, 2) 37 डिग्री सेल्सियस पर आसान रखरखाव, मानव रोगजनकों का अध्ययन करने के लिए संगत, 3) संज्ञाहरण की आवश्यकता के बिना इंजेक्शन द्वारा सटीक संक्रमण, 4) एंटीमाइक्रोबियल एजेंटों की प्रभावकारिता मूल्यांकन के लिए कम दवा का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है, 5) की कमी स्तनधारियों के उपयोग की तुलना में नैतिक बाधाओं, 6) बड़े समूह के आकार पशु अधिक reproducibility की अनुमति मॉडल की तुलना में इस्तेमाल किया जा सकता है, और 7) संक्रमण प्रयोगों के लिए कम समय की आवश्यकता है.
हाल ही में एक अध्ययन में, हमने दिखा दिया है कि जी melonella bioluminescent एम bovis BCG लक्स,टीका तनाव और सदस्य के एक आनुवंशिक रूप से संशोधित संस्करण द्वारा संक्रमण के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास संक्रमण मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है Mtb परिसर (MTBC)16की. जबकि जी मेलोनेला पहले गैर-ट्यूबरकुलस माइकोबैक्टीरिया (एनटीएम) के लिए एक संक्रमण मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है, मुख्य रूप से एम मैरिनम और माइकोबैक्टीरियम फोड़ा17,18, एमटीबीसी का उपयोग कर अध्ययन करने के लिए सीमित कर रहे हैं कि ली एट अल16. Bioluminescent गैर-रोगजनक माइकोबैक्टीरियल उपभेदों, जो रोकथाम के स्तर पर इस्तेमाल किया जा सकता है (सीएल) 2 Mtb के लिए एक किराए के रूप में, रोगजनक माइकोबैक्टीरिया पर सुरक्षा और व्यावहारिकता के फायदे प्रदान करते हैं. बीसीजी लक्सके साथ संक्रमण के बाद, लार्वा जल्दी ग्रैन्युलोमा जैसी संरचनाओं का विकास शुरू करते हैं, जो टीबी संक्रमण16की स्थापना में जन्मजात प्रतिरक्षा की भूमिका के बारे में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। इसके अलावा, इस सरल अकशेरुकी संक्रमण मॉडल में टीबी रोगजनन के एक तेजी से, कम लागत, और विश्वसनीय मूल्यांकन प्रदान करने की क्षमता है जिसमें नियंत्रित चुनौती को शामिल किया गया है और प्रजनन क्षमता के लिए कई प्रतिकृतियां हैं। इसके अलावा, मॉडल के लिए जल्दी विकास में उपन्यास विरोधी टीबी दवा और टीका उम्मीदवारों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है, प्रयोग में पशुओं की कुल संख्या को कम करने. मेजबान और रोगजनक संरचना में परिवर्तन को मापने की क्षमता, ट्रांसप्टोम और प्रोटीओम दवा लक्ष्य निर्धारित करने और उपन्यास दवाओं और चिकित्सीय टीकों की कार्रवाई के तंत्र का आकलन करने के लिए, भी फायदेमंद हैं।
यहाँ हम एक bioluminescent एम bovis BCG लक्स inoculum और जी मेलॉनेला लार्वा mycobactrial संक्रमण के लिए तैयार करने के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन है, साथ ही दोनों लार्वा और माइकोबैक्टीरियल के निर्धारण संक्रमण के जवाब में अस्तित्व.
एक संक्रमण मॉडल के रूप में जी मेलोनेला का उपयोग उग्रता, मेजबान-रोगजनक बातचीत के अध्ययन के लिए कई जीवाणु और कवक रोगजनकों के लिए और उपन्यास चिकित्सा के लिए एक स्क्रीन के रूप में स्थापित किया गया है<sup class…
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना को पीआरएल और वाईएल (बीबी/पी001262/1) को प्रदान किए गए जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (बीबीएसआरसी) से अनुदान द्वारा सहायता प्रदान की गई थी, और पीआरएल को दिए गए अनुसंधान में पशुओं के प्रतिस्थापन, परिशोधन और कमी के लिए राष्ट्रीय केंद्र, SMN, BDR, और YL (NC/
1.5ml reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
20, 200 and 1000 µl pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
25 ml pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
3 compartment Petri dish (94/15mm) | Greiner | 637102 | |
Centrifuge | Any supplier | n/a | |
Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml) | Corning | CLS40183 | |
Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
Lysing matrix (S, 2.0ml) | MP Biomedicals | 116925500 | |
Micro syringe (25 µl, 25 ga) | SGE | 3000 | |
Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
Petri dish (94/15mm) | Greiner | 633181 | |
Filter paper (94mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |