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Immunology and Infection

माइकोबैक्टीरियम तपेदिक परिसर का अध्ययन करने के लिए एक संक्रमण मॉडल के रूप में इनवर्टेब्रेट गैलेरिया मेलोनेला का उपयोग

doi: 10.3791/59703 Published: June 30, 2019
* These authors contributed equally

Summary

गैलेरिया मेलोनेला हाल ही में माइकोबैक्टीरियम तपेदिक परिसर के लिए एक पुनरुत्पाद्य, सस्ते, और नैतिक रूप से स्वीकार्य संक्रमण मॉडल के रूप में स्थापित किया गया था। यहाँ हम वर्णन और bioluminescent माइकोबैक्टीरियम बीवीजी बीसीजी लक्स के साथ जी melonella के सफल संक्रमण स्थापित करने के लिए उठाए गए कदमों का वर्णन और प्रदर्शन.

Abstract

क्षय रोग संक्रामक रोग मृत्यु का प्रमुख वैश्विक कारण है और दुनिया की लगभग एक चौथाई आबादी माइकोबैक्टीरियम तपेदिकसे संक्रमित माना जाता है. अनुसंधान के दशकों के बावजूद, एक रोगजनक जीव के रूप में एम तपेदिक की सफलता के पीछे कई तंत्र की जांच की जानी शेष है, और वृद्धि से निपटने के लिए सुरक्षित, अधिक प्रभावी एंटीमाइकोबैक्टीरियल दवाओं के विकास की तत्काल आवश्यकता है और दवा प्रतिरोधी तपेदिक का प्रसार। हालांकि, तपेदिक अनुसंधान की प्रगति पारंपरिक स्तनधारी संक्रमण मॉडल है कि महंगे हैं, समय लेने वाली है, और नैतिक रूप से चुनौतीपूर्ण द्वारा bottlenecked है. इससे पहले हमने एम तपेदिक परिसर के सदस्यों के लिए एक उपन्यास, पुन: उत्पादनीय, कम लागत, उच्च-थ्रूपुट और नैतिक रूप से स्वीकार्य संक्रमण संक्रमण मॉडल के रूप में कीट गैलेरिया मेलोनेला (महान मोम कीट) के लार्वा की स्थापना की। यहाँ हम रखरखाव, तैयारी, और bioluminescent माइकोबैक्टीरियम bovis बीसीजी लक्स के साथ जी melonella के संक्रमण का वर्णन. इस संक्रमण मॉडल का उपयोग करना, माइकोबैक्टीरियल खुराक निर्भर उग्रता मनाया जा सकता है, और bioluminscence माप का उपयोग कर vivo माइकोबैक्टीरियल बोझ में की एक तेजी से readout आसानी से प्राप्त करने और reproduible है. हालांकि सीमाएं मौजूद हैं, जैसे ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए पूरी तरह से एनोटेट जीनोम की कमी, आनुवंशिक रूप से समान कीड़ों के खिलाफ तार्किक विश्लेषण किया जा सकता है। तपेदिक के लिए एक कम लागत, तेजी से, और नैतिक रूप से स्वीकार्य मॉडल के रूप में, जी मेलोनेला दवा प्रभावकारिता और विषाक्तता का निर्धारण करने के लिए एक पूर्व स्क्रीन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और पारंपरिक स्तनधारी के उपयोग से पहले तुलनात्मक माइकोबैक्टींगिक उग्रता निर्धारित करने के लिए मॉडल. जीमेलोनेला-माइकोबैक्टीरिया मॉडल के उपयोग से तपेदिक अनुसंधान में वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले पशुओं की पर्याप्त संख्या में कमी आएगी।

Introduction

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क्षय रोग (टीबी) वैश्विक जन स्वास्थ्य के लिए एक बड़ा खतरा है जिसमें प्रति वर्ष 9 मिलियन नए मामले और 15 मिलियन मौतें1. इसके अतिरिक्त, यह अनुमान लगाया गया है कि विश्व की एक चौथाई जनसंख्या रोग के कारक एजेंट, माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (एमटीबी) से संक्रमितहै। संक्रमित आबादी के बीच, 5 डिग्री 10% अपने जीवनकाल में सक्रिय टीबी रोग का विकास होगा। इसके अलावा, बहु-औषध प्रतिरोधी (एमडीआर) और बड़े पैमाने पर दवा (एक्सडीआर) प्रतिरोधी Mtb के उद्भव और प्रसार रोग नियंत्रण के लिए एक गंभीर खतरा बन गया है, 123 देशों के साथ कम से कम एक XDR मामले1रिपोर्टिंग . टीबी के उपचार के लिए कम से कम चार एंटी-माइकोबैक्टीरियल दवाओं के कॉकटेल की आवश्यकता होती है, जिनमें से आइसोनियाज़्ड और रिफाम्पिकिन को कम से कम छह महीने की अवधि के लिए निर्धारित किया जाता है; उपचार अक्सर जटिल दुष्प्रभाव और toxicities के साथ जुड़ा हुआ है. टीबी के खिलाफ केवल लाइसेंस प्राप्त टीके से संरक्षण, माइकोबैक्टीरियम बोविस बैसिलस कलमेट-गुएरिन (बीसीजी), चर2है। टीबी के रोगजनन की एक अधूरी समझ नई चिकित्सीय और टीकाकरण रणनीतियों के विकास में काफी बाधा डालती है।

दशकों के लिए पशु संक्रमण मॉडल टीबी अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण किया गया है बुनियादी रोगजनन और संक्रमण के लिए मेजबान प्रतिक्रिया को समझने के लिए, और उपन्यास विरोधी mycobactrial एजेंटों का मूल्यांकन करने के लिए, प्रतिरक्षा चिकित्सा और नए टीका उम्मीदवारों3, 4. हालांकि, टीबी के पशु संक्रमण मॉडल का उपयोग कर अनुसंधान बेहद मुश्किल है क्योंकि रोगजनन और टीबी संक्रमण की प्रगति जटिल है, और कोई भी पशु मॉडल नहीं है जो पूरे स्पेक्ट्रम और रोग की महत्वपूर्ण विशेषताओं की नकल करता है5 ,6. इसके अलावा, पशु प्रयोगों महंगे हैं, समय लेने के लिए शुरू करने और पूर्ण नैतिक औचित्य की आवश्यकता है. फिर भी, टीबी के पशु संक्रमण मॉडल गैर मानव primates में वर्णित किया गया है (उदा., मैकैक), गिनी सूअर, खरगोश, पशु, सूअर, चूहों और ज़ेब्राफ़िश, प्रत्येक अपनी सीमाओं के साथ3,4. Murine मॉडल लागत, inbred लाइनों की उपलब्धता, संक्रमण की reproducibility और प्रतिरक्षा अभिकर्मकों की बहुतायत के कारण सबसे अधिक इस्तेमाल किया मॉडल है। हालांकि, वे आम तौर पर गुप्त तपेदिक संक्रमण (एलटीबीआई)6की विशेषता है कि hypoxia के क्षेत्रों के साथ जुड़े granuomaas फार्म नहीं है. गिनी सूअरों अत्यधिक Mtb संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, विकृति और जल्दी दानेदार गठन मनुष्यों में उन लोगों के समान के साथ, और व्यापक रूप से टीका परीक्षण में उपयोग किया जाता है; फिर भी इम्यूनोलॉजिकल अभिकर्मकों की कमी संक्रमण मॉडल7के रूप में उनके उपयोग में बाधा डालती है . ज़ेबराफ़िश उनके छोटे आकार, तेजी से प्रजनन और उन्नत आनुवंशिक उपकरणों के कारण प्रारंभिक चरण पूर्व नैदानिक अध्ययन में बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त हैं, लेकिन शारीरिक और शारीरिक रूप से मनुष्यों के लिए अलग हैं और केवल करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं माइकोबैक्टीरियम मारिनम संक्रमण3| पशु मॉडल सबसे बारीकी से मानव Mtb संक्रमण के समान गैर मानव primates हैं (जैसे, मैके), लेकिन वे महंगे हैं और महत्वपूर्ण नैतिक और व्यावहारिक विचार है जो काफी उनके उपयोग को सीमित करता है8.

अधिक मोम कीट या मधुकोश कीट, गैलेरिया मेलोनेला का कीट लार्वा , विभिन्न प्रकार के जीवाणु और कवक रोगजनकोंकेलिए संक्रमण मॉडल के रूप में तेजी से लोकप्रिय हो गया है , और उपन्यास एंटीमाइक्रोबियल दवा उम्मीदवारों के लिए एक स्क्रीन के रूप में 10. जी मेलोनेला अपने परिष्कृत सहज प्रतिरक्षा प्रणाली (सेल्यूलर और हास्य सुरक्षा के साथ) के कारण एक सफल अकशेरुकी मॉडल है जो कशेरुकियों 11 के लिए संरचनात्मक और कार्यात्मक समानता के एक उच्च डिग्री के शेयरों . इसमें हेमोसाइट्स द्वारा रोगजनकों के फैगोसाइटोसिस जैसे प्रतिरक्षा तंत्र शामिल हैं (कार्यात्मक रूप से स्तनधारी मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल के समान)12,13, एंटी-माइक्रोबायल पेप्टाइड्स (एएमपी) का उत्पादन और परिसंचरण और जी मेलोनेला11के हेमोलिम्फ (स्तनीय रक्त के अनुरूप) के भीतर पूरक प्रोटीन की तरह । अन्य लाभ9,14,15 जी मेलोनेला लार्वा के एक मॉडल के रूप में शामिल 1) उनके बड़े आकार (20 डिग्री 30 मिमी) जो आसान हेरफेर और संक्रमण के लिए अनुमति देता है, साथ ही ऊतक के संग्रह और विश्लेषण के लिए हेमोलिम्फ, 2) 37 डिग्री सेल्सियस पर आसान रखरखाव, मानव रोगजनकों का अध्ययन करने के लिए संगत, 3) संज्ञाहरण की आवश्यकता के बिना इंजेक्शन द्वारा सटीक संक्रमण, 4) एंटीमाइक्रोबियल एजेंटों की प्रभावकारिता मूल्यांकन के लिए कम दवा का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है, 5) की कमी स्तनधारियों के उपयोग की तुलना में नैतिक बाधाओं, 6) बड़े समूह के आकार पशु अधिक reproducibility की अनुमति मॉडल की तुलना में इस्तेमाल किया जा सकता है, और 7) संक्रमण प्रयोगों के लिए कम समय की आवश्यकता है.

हाल ही में एक अध्ययन में, हमने दिखा दिया है कि जी melonella bioluminescent एम bovis BCG लक्स,टीका तनाव और सदस्य के एक आनुवंशिक रूप से संशोधित संस्करण द्वारा संक्रमण के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास संक्रमण मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है Mtb परिसर (MTBC)16की. जबकि जी मेलोनेला पहले गैर-ट्यूबरकुलस माइकोबैक्टीरिया (एनटीएम) के लिए एक संक्रमण मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है, मुख्य रूप से एम मैरिनम और माइकोबैक्टीरियम फोड़ा17,18, एमटीबीसी का उपयोग कर अध्ययन करने के लिए सीमित कर रहे हैं कि ली एट अल16. Bioluminescent गैर-रोगजनक माइकोबैक्टीरियल उपभेदों, जो रोकथाम के स्तर पर इस्तेमाल किया जा सकता है (सीएल) 2 Mtb के लिए एक किराए के रूप में, रोगजनक माइकोबैक्टीरिया पर सुरक्षा और व्यावहारिकता के फायदे प्रदान करते हैं. बीसीजी लक्सके साथ संक्रमण के बाद, लार्वा जल्दी ग्रैन्युलोमा जैसी संरचनाओं का विकास शुरू करते हैं, जो टीबी संक्रमण16की स्थापना में जन्मजात प्रतिरक्षा की भूमिका के बारे में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। इसके अलावा, इस सरल अकशेरुकी संक्रमण मॉडल में टीबी रोगजनन के एक तेजी से, कम लागत, और विश्वसनीय मूल्यांकन प्रदान करने की क्षमता है जिसमें नियंत्रित चुनौती को शामिल किया गया है और प्रजनन क्षमता के लिए कई प्रतिकृतियां हैं। इसके अलावा, मॉडल के लिए जल्दी विकास में उपन्यास विरोधी टीबी दवा और टीका उम्मीदवारों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है, प्रयोग में पशुओं की कुल संख्या को कम करने. मेजबान और रोगजनक संरचना में परिवर्तन को मापने की क्षमता, ट्रांसप्टोम और प्रोटीओम दवा लक्ष्य निर्धारित करने और उपन्यास दवाओं और चिकित्सीय टीकों की कार्रवाई के तंत्र का आकलन करने के लिए, भी फायदेमंद हैं।

यहाँ हम एक bioluminescent एम bovis BCG लक्स inoculum और जी मेलॉनेला लार्वा mycobactrial संक्रमण के लिए तैयार करने के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन है, साथ ही दोनों लार्वा और माइकोबैक्टीरियल के निर्धारण संक्रमण के जवाब में अस्तित्व.

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Protocol

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नोट: नीचे वर्णित सभी कार्य स्थानीय स्वास्थ्य और सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन करते हुए एक वर्ग 2 माइक्रोबायोलोलॉजिकल सुरक्षा कैबिनेट (एमएससी) के भीतर एक CL2 प्रयोगशाला में किया जाना है।

1. संक्रमण के लिए एम बोविस बीसीजी लक्स की तैयारी

  1. एक जमे हुए 1.2 एमएल ग्लिसरोल (15%) defrost एम बोविस बीसीजी लक्सका स्टॉक , मॉन्ट्रियल टीका तनाव शटल प्लाज्मिड pSMT1 के साथ बदल Vibrio harveyi से luxAB जीन ले लुसिफेरेज एंजाइम19.
  2. मध्यब्रुक 7H9 शोरबा के 15 एमएल में 0.2% ग्लिसरॉल, 10% एल्बुमिन, डेक्सट्रोज, कैटालेस (एडीसी) संवर्धन और 50 डिग्री/
  3. एक सील जैव सुरक्षा कंटेनर में फ्लास्क रखें और 72 एच के लिए 220 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर (या जब तक संस्कृति विकास के मध्य लॉग चरण तक पहुंच जाती है)।
  4. फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस, पीएच 7.4, 0.01 एम फॉस्फेट बफर बफर, 0.0027 एम पोटेशियम क्लोराइड और 0.137 एम सोडियम क्लोराइड) डुप्लिकेट में का उपयोग कर luminometer ट्यूबों में संस्कृति के 1:10 कमजोर पड़ने की तैयारी करके बीसीजी लक्स संस्कृति के विकास की जाँच करें। भंवर, और luminometer में luminometer ट्यूबों लोड और bioluminescence को मापने (संबंधित प्रकाश इकाई [RLU]/mL) सब्सट्रेट के रूप में n-decyl ऐल्डिहाइड का उपयोग कर (1% v/v निरपेक्ष इथेनॉल में)20.
    नोट: RLU/colony बनाने इकाइयों (CFU) का अनुपात पहले 3:1 जब बीसीजी लक्स मध्यब्रुक 7H9 शोरबा20में इन विट्रो में उगाया गया था निर्धारित किया गया था.
  5. कोशिकाओं को गोली देने के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 2,175 x ग्राम पर संस्कृति को सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनेट को ज्ञात माइकोबैक्टीसिडल गतिविधि के साथ एक उपयुक्त कीटाणुनाशक में छोड़ दें। स्थानीय दिशानिर्देशों का पालन करते हुए माइकोबैक्टीरिया के लिए उपयुक्त कीटाणुनाशकों के साथ सभी संस्कृति अपशिष्ट को निपटाना।
  6. जीवाणु clumping को रोकने के लिए 0.05% polysorbate 80 (पीबीएस-टी) युक्त पीबीएस में दो बार सेल गोली धो लें।
  7. अंतिम धोने के बाद, decant अपशिष्ट supernatant, पीबीएस-टी में माइकोबैक्टीरियल सेल गोली resuspend और RLU माप का उपयोग कर वांछित सेल घनत्व के लिए माइकोबैक्टीरियल निलंबन पतला.
  8. पीबीएस-टी का उपयोग करके 24-वेल प्लेटों में इनोकुलम के दस गुना सीरियल कमजोर पड़ने की तैयारी करें। बाहर प्लेट 10 $L पर Middlebrook 7H11 agar प्लेटें (0.5% ग्लिसरॉल, 50 g/mL hygromycin, 10% oleic एसिड, एल्बुमिन, डेक्सट्रोज, कैटालेस [OADC]) innumerate inoculum CFU गणना करने के लिए डुप्लिकेट में.

2. जी मेलोनेला लार्वा की तैयारी

  1. उचित स्रोतों से अंतिम इनस्टार लार्वा खरीदें और आगमन पर 18 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में लार्वा को बनाए रखें और खरीद के 1 सप्ताह के भीतर उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, लार्वा को जोजो एट अल 21के प्रोटोकॉल के बाद स्वयं पाला जा सकता है। खरीदे गए लार्वा के लिए, भंडारण से पहले किसी भी मृत, फीका या प्यूपा लार्वा को त्याग दें।
    नोट: जनक लार्वा अंतिम इनस्टार लार्वा के लिए आकृतिक रूप से विशिष्ट होते हैं।
  2. पहचान और प्रयोग के लिए स्वस्थ लार्वा का चयन करें, कोई मलिनकिरण के लिए थोड़ा के साथ वर्दी क्रीम रंग के आधार पर (मेलनाइजेशन), आकार (2 डिग्री 3 सेमी लंबाई में), वजन (लगभग 250 मिलीग्राम), गतिशीलता के एक उच्च स्तर को प्रदर्शित करने, और सही करने की क्षमता रखने खुद को जब बदल गया.
  3. ध्यान से स्वस्थ लार्वा गिनती (प्रति समूह 20 डिग्री 30 की न्यूनतम) एक पेट्री डिश में (94/15 मिमी) फिल्टर पेपर की एक परत के साथ लाइन में खड़ा (94/15 मिमी) कुंद अंत चिमटी का उपयोग करने के लिए प्रदूषण को कम करने और उपयोग जब तक अंधेरे में कमरे के तापमान पर स्टोर.

3. BCG लक्स के साथ जी मेलोनेला संक्रमित

  1. संदूषण और सुई छड़ी चोट के जोखिम को कम करने के लिए एमएससी के भीतर अव्यवस्था को कम करें।
  2. एक फ्लैट उठाया सतह के लिए एक परिपत्र फिल्टर पेपर (94 मिमी) टेप करके इंजेक्शन मंच तैयार करें। नरम या हार्ड सतहों इस्तेमाल किया जा सकता है और उपयोगकर्ता वरीयता पर पूरी तरह से निर्भर है, उदा, पिपेट बॉक्स lids या एक नायलॉन दस्त स्पंज.
  3. एक 25 जेडएल माइक्रोसिरेंजी (25 जी) को 70% इथेनॉल की 3 मात्रा को बढ़ाकर और आगे बाँझ पीबीएस-टी के 3 संस्करणों के साथ कुल्ला करें।
  4. बीसीजी लक्स के 10 डिग्री एल (खंड 1 में तैयार) या स्टरलाइज़्ड 25 एल माइक्रोसिरेंसरिन में पीबीएस-टी। PBS-T नकारात्मक नियंत्रण के लिए एक अलग सिरिंज का उपयोग करें.
    नोट: एक समान सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए 10 इंजेक्शन के बाद बीसीजी लक्स इनोकुलम को फिर से निलंबित करें।
  5. एक लार्वा लेने के लिए और इंजेक्शन मंच पर जगह करने के लिए चम्मिता का प्रयोग करें।
  6. मंच पर, लार्वा को अपनी पीठ पर फ्लिप करें और चने के साथ सिर और पूंछ को सुरक्षित करके स्थिर हो जाते हैं। लार्वा के सिर से नीचे गिनती अंतिम बाएँ proleg का पता लगाएँ और ध्यान से क्षैतिज विमान के लिए एक 10 डिग्री 20 डिग्री कोण पर सुई (5 डिग्री 6 मिमी) की नोक डालें।
    नोट: लघु और संकीर्ण चमहार न्यूनतम लार्वा तनाव के साथ आसान स्थिरीकरण के लिए अनुमति देते हैं। अधिक प्रवेश करने के लिए ध्यान देना जो आंत पंचर और गैर-बीसीजी लक्स विशिष्ट उदासी या मौत का कारण हो सकता है।
  7. संक्रमित लार्वा को फिल्टर पेपर की एक परत के साथ लाइन में खड़ा एक पेट्री डिश में गिनें, एक भी 90 मिमी पेट्री डिश 30 लार्वा को समायोजित कर सकता है।
  8. पेट्री डिश जिसमें लार्वा को एक वेंटेड या गैर-सील किए गए अंधेरे बॉक्स में 37 डिग्री सेल्सियस पर 37 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जिसमें 5% सीओ2है।

4. संक्रमण के बाद जी मेलोनेला की उत्तरजीविता की निगरानी

  1. समय के दौरान, लार्वा के जीवित रहने की निगरानी हर 24 एच लार्वा को तब मृत माना जाता है जब वे स्पर्श के जवाब में स्थानांतरित करने में विफल रहते हैं।

5. जी मेलोनेला में बीसीजी लक्स के इन विवो बर्डन को मापने

  1. प्रत्येक समय बिंदु पर, बेतरतीब ढंग से पहले अनुभाग 3 में तैयार पांच संक्रमित लार्वा का चयन करें और कपास कली 70% इथेनॉल में भिगोे हुए swabs का उपयोग करके लार्वा सतहों को धीरे से बाँझ करें।
    नोट: यह कदम महत्वपूर्ण है जब गैर बाँझ लार्वा के रूप में माइकोबैक्टीरियल CFU गणना के लिए लार्वा homogenate चढ़ाना संदूषण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
  2. लार्वा को 2 एमएल lysing मैट्रिक्स ट्यूबों में व्यक्तिगत रूप से रखें जिसमें बाँझ पीबीएस के 800 डिग्री एल होते हैं।
  3. 6.0 m/s पर 60 s के लिए एक homogenizer का उपयोग कर लार्वा homogenize.
  4. 5 s के लिए 3,500 x g पर lysing ट्यूबों सेंट्रीफ्यूज, lids से homogenate को दूर करने के लिए, और ध्यान से बाँझ luminometer ट्यूबों में व्यक्तिगत रूप से homogenate decant.
    नोट: CFU गणन के लिए (चरण 5.7), एक बाँझ 1.5 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब में homogenate के 100 $L आरक्षित करने के लिए सुनिश्चित करें.
  5. इसी luminometer ट्यूबों में पीबीएस-टी और पिपेट के 1 एमएल के साथ lysing मैट्रिक्स ट्यूबों धोने से किसी भी शेष homogenate पुनर्प्राप्त करें।
  6. Luminometer ट्यूबों भंवर और homogenates के bioluminescence उपाय पहले चरण 1.4 में वर्णित.
  7. पीबीएस-टी का उपयोग करके 24-वेल कल्चर प्लेट्स में होमोजेनेट के दस गुना सीरियल कमजोर पड़ने की तैयारी करें। मध्यब्रूक 7H11 एगार प्लेटों पर कमजोर पड़ने के 10 डिग्री सेल्सियस बाहर प्लेट 0.5% ग्लिसरॉल, 50 ग्राम/एमएल हाइग्रोमाइसिन, 10% OADC और 20 g/mL piperacillin, बीसीयूजी के आरएल /
    नोट: पिपरासिलिन देशी जी मेलोनेला माइक्रोबायोटा को बीसीजी लक्स16के न्यूनतम विकास निषेध के साथ समाप्त करता है ।

6. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. एकत्र किए गए डेटा का उपयोग करके काप्लान-मेयर अस्तित्व वक्र प्लॉट करें और परिणाम के महत्व को निर्धारित करने के लिए मैनटेल-कोक्स (लॉग-रैंक) परीक्षण को पूरा करें, जहां * पी और एलटी; 0.05, * पी और lt; 0.01, **p और lt; 0.001, और * * * पी और 0.001।

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Representative Results

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यहाँ हम प्रतिनिधि डेटा है कि जी melonella का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता प्रस्तुत - BCG लक्स संक्रमण मॉडल और MTBC के सदस्यों के लिए एक संक्रमण मॉडल के रूप में जी melonella के लाभों पर प्रकाश डाला (चित्र 1). मुख्य तकनीकी बिंदुओं के साथ प्रायोगिक प्रक्रियाओं को चित्र 2में रेखांकित किया गया है।

Figure 1
चित्र ााा्वित 1: संक्रमण मॉडल के रूप में जी मेलोनेला के लाभ। यह आंकड़ा कवनघ और शीहान22से अनुकूलित किया गया है . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं की रूपरेखा. (क) एम बोविस बीसीजी लक्सके साथ संक्रमण के लिए जी मेलोनेला का रखरखाव और तैयारी . (ख) बीसीजी लक्स संस्कृति तैयार करना और संक्रमण के लिए इनोकुलम। () बीसीजी लक्सके साथ जी मेलोनेला का संक्रमण . (छ) जी मेलोनेला लार्वा में उग्रता का मापन और बीसीजी लक्स के विवो भार में। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

बीसीजी लक्स खुराक निर्भर उग्रता जी मेलोनेला लार्वा में एक 96 एच ऊष्मायन अवधि में मनाया गया ( चित्र3) और घातक खुराक 50% लार्वा मृत्यु दर के लिए आवश्यक (एलडी50) 1 x 107 CFU होना निर्धारित किया गया था। बीसीजी लक्स खुराक की उग्रता को दर्शाती अस्तित्व वितरण काफी अलग था (पी एंड एलटी; 0.0001)। नियंत्रण समूहों पीबीएस-टी या बस चुभने सुई चोटों के एक 10 डिग्री एल खुराक के साथ इंजेक्शन, लार्वा स्वास्थ्य को प्रभावित नहीं किया या अलग अलग समय बिंदुओं पर गतिशीलता और उदासी पर अवलोकन चेक द्वारा निर्धारित के रूप में मृत्यु दर में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व.

Figure 3
चित्र 3: म बोविस बीसीजी लक्सके अलग-अलग टीका के प्रत्युत्तर में जी मेलोनेला का कपल-मीर जीवित रहने का वक्र। स्वस्थ लार्वा (प्रति समूह 10 ) बीसीजी लक्सकी अलग-अलग खुराक से संक्रमित थे। लार्वा को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था और 96 एच तक के लिए हर 24 एच जीवित रहने के लिए निगरानी की गई थी। असंक्रमित समूह पीबीएस के साथ इंजेक्ट किया गया था, और एक चुभने वाला समूह (केवल सुई का प्रवेश) लार्वा स्वास्थ्य पर सुई की चोट के प्रभाव का प्रदर्शन करता है। दो स्वतंत्र प्रयोगों के साधन दिखाए जाते हैं, 95% विश्वास अंतराल के साथ, inoculum के लिए इसी रंग में डॉटेड लाइनों के रूप में प्रतिनिधित्व किया. यह आंकड़ा ली एट अल16से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

बीसीजी लक्स से संक्रमित सभी लार्वा ने समय के साथ शारीरिक परिवर्तन प्रदर्शित किए और बीसीजी लक्सकी 2 x 107 CFU खुराक से संक्रमित लार्वा के लिए, लार्वा पृष्ठीय रेखा का मेलीकरण 48 एच पोस्ट संक्रमण (पाई) से देखा गया, और व्यवस्थित 96 ज पाई से मेलनाइजेशन देखा गया (चित्र 4) . इसके अलावा, मेलेनाइजेशन की गंभीरता और लार्वा की प्यूपा करने की क्षमता के साथ कम लार्वा की गतिशीलता असंक्रमित नियंत्रण की तुलना में संक्रमण पर खो गई थी।

Figure 4
चित्र 4: एम बोविस बीसीजी लक्सके साथ संक्रमण के जवाब में जी मेलोनेला का मेलनाइजेशन । 0 ज में स्वस्थ लार्वा बीसीजी लक्सकी 2 x 107 CFU खुराक से संक्रमित थे . 48 ज और 96 एच पाई पर क्रमशः लार्वा पृष्ठीय रेखा और व्यवस्थित मेलेनिन के साथ मेलेनिन देखा गया।

जी मेलोनेला लार्वा के भीतर बीसीजी लक्स की उत्तरजीविता लार्वा homogenates के bioluminescence माप के माध्यम से 2 सप्ताह से अधिक निर्धारित किया गया था। बीसीजी लक्स के एक 1 x 107 CFU खुराक के साथ संक्रमण 0 डिग्री 72 एच पाई से बीसीजी लक्स bioluminscence की एक प्रारंभिक गिरावट के परिणामस्वरूप. तथापि, 72 डिग्री 144 एच पाई से बीसीजी लक्स का जैव-दीप्ति पठारी हो गया, जो सतत संक्रमण की स्थापना का संकेत देता है (चित्र 5)।

Figure 5
चित्र 5: दो सप्ताह के समय के पाठ्यक्रम में जैव-दीप्ति (संबंधित प्रकाश इकाई, आरएलयू/एमएल) का उपयोग करके एम बोविस बीसीजी लक्स के विवो भार में। स्वस्थ लार्वा (एन जेड 30) बीसीजी लक्सकी 1 x 107 CFU खुराक से संक्रमित थे। विवो बोझ में प्रत्येक समय बिंदु (0, 24, 48, 72, 96, 168, 336 एच) पर पांच लार्वा homogenizing द्वारा और homogenate के bioluminescence को मापने के द्वारा परिमाणित किया गया था. तीन स्वतंत्र प्रयोगों के साधन दिखाए जाते हैं, और त्रुटि सलाखों मतलब के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. यह आंकड़ा ली एट अल16से पुनर्मुद्रण किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

के रूप में इन अध्ययनों में vivo माइकोबैक्टीरियल विकास में की तेजी से और reproduible परिमाणीकरण bioluminescence की माप द्वारा निर्धारित किया गया था, RLU और CFU के अनुपात भी विवो में निर्धारित किया जाना चाहिए. हमारे विशेष संक्रमण प्रणाली में, RLU और CFU के vivo अनुपात में 2:1-5:1 से लेकर, 168-h समय पाठ्यक्रम पर 4:1 के एक औसत के साथ (चित्र 6).

Figure 6
चित्र 6: जी मेलोनेलामें एम बोविस बीसीजी लक्स के विवो आरएलयू/ स्वस्थ लार्वा (एन जेड 30) बीसीजी लक्सकी 1 x 107 CFU खुराक से संक्रमित थे। प्रत्येक समय बिंदु (0, 24, 96 और 168 h), चार संक्रमित/नियंत्रण (पीबीएस-टी) लार्वा homogenized थे, और homogenates bioluminscence के लिए मापा गया और 7H11 agar पर बाहर चढ़ाया CFU गिनती की गणना करने के लिए. दो स्वतंत्र प्रयोगों के साधन दिखाए जाते हैं और त्रुटि सलाखों मतलब के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

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एक संक्रमण मॉडल के रूप में जी मेलोनेला का उपयोग उग्रता, मेजबान-रोगजनक बातचीत के अध्ययन के लिए कई जीवाणु और कवक रोगजनकों के लिए और उपन्यास चिकित्सा के लिए एक स्क्रीन के रूप में स्थापित किया गया है10,22. निम्नलिखित चर्चा एमटीबीसी के लिए संक्रमण मॉडल के रूप में जी मेलोनेला के उपयोग के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया पर आधारित है.

प्रयोग से पहले भोले लार्वा के स्वास्थ्य का प्रयोग के परिणाम पर काफी प्रभाव पड़ सकता है। इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि किसी भी फीका और/या घायल लार्वा आगमन पर हटा दिया जाता है और किसी भी प्रयोग के लिए उपयोग नहीं किया जाता है। यदि आगमन पर एक ही कंटेनर के भीतर बड़ी संख्या में लार्वा मृत पाए जाते हैं, तो बैच को छोड़ने की सलाह दी जाती है क्योंकि पूर्व-मौजूदा संक्रमण मौत का कारण हो सकता है। जब संभव हो तो लार्वा का उपयोग करके खरीद/आगमन के दिन के करीब प्रयोग करें। उपयोग करने से पहले पिल्ले को रोकने के लिए और प्रयोग के लिए उपलब्ध लार्वा की संख्या को अधिकतम करने के लिए लार्वा को 18 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करना सुनिश्चित करें। स्वस्थ लार्वा वितरण/खरीद के बाद 7 दिनों तक उपयोग किए जा सकते हैं। संक्रमण के बाद, पेट्री डिश से किसी भी मृत लार्वा को हटाने के लिए सुनिश्चित करें, अभी तक अज्ञात कारणों के लिए, मृत लार्वा की उपस्थिति नमूना आबादी में मृत्यु दर में वृद्धि करने के लिए प्रकट होती है। स्व-आहारित लार्वा के उपयोगकर्ताओं के लिए, खरीदे गए लार्वा की तुलना में जैविक परिवर्तनशीलता के बारे में पता होना महत्वपूर्ण है, क्योंकि आहार और विकास की स्थितियों में भिन्नता लार्वा प्रतिरक्षा21,23पर प्रभाव डाल सकती है। अंतर-प्रयोगात्मक variabilities स्रोत रखने के द्वारा सीमित किया जा सकता है, अगर खरीदा है, या फ़ीड और प्रयोग के बीच संगत पालने लार्वा के विकास की स्थिति. सभी प्रयोगों में, 'रिक्त' और 'pricked' नकारात्मक नियंत्रण का समावेश आवश्यक है; रिक्त नियंत्रण संदूषण या निलंबन मैट्रिक्स की विषाक्तता का एक संकेत है (पीबीएस-टी या मीडिया शोरबा), और चुभने नियंत्रण लार्वा स्वास्थ्य पर सुई चोट के प्रभाव mimics. इसके अलावा, ये लार्वा के बैचों के बीच किसी भी जैविक भिन्नता को सामान्य ीकृत करते हैं, जिससे प्रयोगों के बीच पुन: उत्पादनीयता और सटीकता सुनिश्चित होती है।

जी मेलोनेला लार्वा के इंजेक्शन के लिए, 25 जी सुई के उपयोग की सिफारिश की जाती है क्योंकि बड़ा गेज सुई अत्यधिक रक्तस्राव का कारण बन सकता है और तेज छोटे गेज सुइयों से लार्वा की आंत को आसानी से पंचर किया जा सकता है, जिससे लार्वा मृत्यु दर और झूठी सकारात्मक हो सकती है परिणाम. सुई इंजेक्शन के पारंपरिक तरीकों आमतौर पर हाथ से लार्वा को स्थिर करते हैं, जिससे सुई की चोट का खतरा बढ़ जाता है। लार्वा को स्थिर करने के लिए चिमटी का उपयोग करके, सुई छड़ी चोट का खतरा काफी कम हो जाता है क्योंकि संक्रमण के दौरान किसी भी बिंदु पर सुई के करीब नहीं है। वैकल्पिक रूप से, लार्वा ठंडा करके स्थिर किया जा सकता है। हालांकि, संक्रमण से पहले 15 मिनट के लिए 12 डिग्री सेल्सियस पर ठंड सदमे संक्रमण के लिए सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बढ़ाने के लिए प्रलेखित किया गया है। अतः शीतलन के माध्यम से प्राप्त परिणामों के विश्लेषण को इसके प्रभाव24पर सावधानीपूर्वक विचार करना चाहिए। हमारी तकनीक का उपयोग करना, इंजेक्शन के मध्यम थ्रूपुट (2 प्रति मिनट 3 लार्वा) उपयोगकर्ता अभ्यास के साथ प्राप्त किया जा सकता है; यह हमारे अनुभव से पारंपरिक इंजेक्शन की गति के बराबर है (3 "4 प्रति मिनट लार्वा). इसके अलावा, हमारी विधि एक 25 जी तितली cannula से जुड़े एक डिस्पोजेबल सिरिंज के साथ एक जलसेक पंप के शामिल एक पेडल संचालित इंजेक्शन मंच का उपयोग करके उच्च थ्रूपुट इंजेक्शन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

बीसीजी लक्स इनोकुलम की तैयारी कवक जीवाणु संस्कृति20के आरएलयू का उपयोग करते हुए सीएफयू के तेजी से आकलन पर आधारित है । शोरबा संस्कृति के साथ हमारे अनुभव में, RLU से CFU का अनुपात 3:120है , बीसीजी लक्स जी मेलोनेला में बढ़ रहा है, जहां RLU से CFU अनुपात 5:120है के विपरीत . माइकोबैक्टीरियल सेल एकत्रीकरण या आमतौर पर घने संस्कृतियों में देखा 'क्लंपिंग' RLU माप पर एक प्रभाव हो सकता है, के रूप में clumping अविश्वसनीय bioluminescence माप में परिणाम कर सकते हैं. इस प्रकार, इनोकुलम तैयारी के लिए क्लंप्ड माइकोबैक्टीरियल संस्कृति के उपयोग की सिफारिश नहीं की जाती है। हालांकि, विकास मीडिया के लिए polysorbate 80 के अलावा बीसीजी लक्सके विकास में फेरबदल के बिना सेल clumping कम से कम करता है. 16 पीबीएस-टी के साथ संस्कृति को धोने से किसी भी छोटे सेल क्लंपिंग को हल किया जा सकता है और आरएलयू को रीडआउट के रूप में उपयोग करके सटीक इनोकुलम तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, पीबीएस-टी धोने विकास के दौरान स्रावित किसी भी extracellular उग्रता कारक को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है। माइकोबैक्टीरियल तनाव और मार्ग संख्या को भी ध्यान में रखा जाना चाहिए, क्योंकि इससे माइकोबैक्टीरियल एकत्रीकरण की गंभीरता25को प्रभावित किया जा सकता है। सभी मामलों में, inoculum CFU द्वारा 7H11 agar प्लेटों पर गणना करने के लिए सुनिश्चित करें कि सही CFU bioluminescence माप द्वारा तैयार किया गया था होना चाहिए. इसके अतिरिक्त, Vivo में RLU/CFU अनुपात नए bioluminescent रिपोर्टर या शेयरों के साथ निर्धारित किया जाना चाहिए, के रूप में अनुपात की संभावना भिन्न होगा.

जी melonella टीबी संक्रमण के पारंपरिक मॉडल पर कई लाभ रखती है, सस्ता अधिग्रहण और रखरखाव लागत सहित, संक्रमण और अनुसंधान थ्रूपुट में आसानी, विशेष रूप से bioluminescent उपभेदों16के साथ संयोजन में . नैतिक बाधाओं की कमी से स्तनधारी मॉडलों की तुलना में अधिक नमूना आकार (प्रति समूह 20 से 30 लार्वा ) की अनुमति होती है, जिससेप्राप्तपरिणामों में अधिक आत्मविश्वास और विश्वसनीयता प्राप्त होती है . हालांकि, एक संक्रमण मॉडल के रूप में जी मेलोनेला के उपयोग में कई सीमाएं हैं। एक अकशेरुकी के रूप में, वे स्वाभाविक रूप से अनुकूली प्रतिरक्षा की कमी है जो उन्हें एंटीजेनिकता या इम्यूनोलॉजिकल अध्ययन10के लिए अनुपयुक्त बनाता है। जी मेलोनेला की सेलुलर जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में कई हेमोसाइट प्रकार के होते हैं, और प्लाज्मासाइट्स और ग्रैनुलोसाइट्स को स्तनपायी फैगोसाइट्स (न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज)12के समान कार्य करने की सूचना मिली है। तथापि, इन कोशिका प्रकारों की भूमिका और तंत्र विशेषता के अधीन रहते हैं, और स्तनधारी और कीट phagocytes के बीच प्रत्यक्ष तुलनात्मक अध्ययन अभी तक किया जाना है. इसके अलावा, एक एनोटेट जी मेलोनेला जीनोम की कमी संक्रमण के लिए मेजबान प्रतिक्रिया के विश्लेषण में बाधा डालती है, और यह वर्तमान में अन्य अकशेरुकी के ट्रांस्पोमिक पुस्तकालयों के खिलाफ जीन आंटलजी विश्लेषण पर निर्भर है, जैसे Drosophila मेलेनोगैस्टर और बॉम्बिक्स मोरी28|

टीबी संक्रमण मॉडल के रूप में, जी मेलोनेला बीसीजी लक्स संक्रमण16के जवाब में ग्रैन्युलोमा जैसी संरचनाओं को विकसित करने की क्षमता के साथ एक आशाजनक भविष्य रखती है, जो टीबी संक्रमण के महत्वपूर्ण pathophysiological पहचान कर रहे हैं और एक महत्वपूर्ण हैं LTBI के विकास में सुविधा. भविष्य के काम के लिए संदर्भ का उपयोग granuloma की तरह संरचनाओं के गठन में एक विशेष रुचि के साथ इस मॉडल की विशेषता का लक्ष्य होगा, नैदानिक और उत्परिवर्ती Mtb CL3 शर्तों के तहत अलग. इसके अतिरिक्त, हम आशा करते हैं कि यह उपन्यास एंटी-माइकोबैक्टीरियल एजेंट स्क्रीनिंग के लिए भी उपयोगी हो सकता है, जैसा कि इसी तरह के जी मेलोनेला मॉडल का उपयोग एनटीएम18के लिए किया गया था, लेकिन यह निर्धारित किया जाना शेष है। इस मॉडल को अपनाने के लिए काफी टीबी अनुसंधान समुदाय के भीतर इस्तेमाल किया जानवरों की संख्या को कम करने की क्षमता है, जबकि एक साथ नैतिक रूप से अधिक स्वीकार्य शर्तों के तहत vivo टीबी अनुसंधान उत्पादन में तेजी.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस परियोजना को पीआरएल और वाईएल (बीबी/पी001262/1) को प्रदान किए गए जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (बीबीएसआरसी) से अनुदान द्वारा सहायता प्रदान की गई थी, और पीआरएल को दिए गए अनुसंधान में पशुओं के प्रतिस्थापन, परिशोधन और कमी के लिए राष्ट्रीय केंद्र, SMN, BDR, और YL (NC/

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL reaction tube (Eppendorf) Eppendorf 22431021
20, 200 and 1,000 µL pipette and filtered tips Any supplier n/a
24 well culture plate Greiner 662160
25 mL pipettes and pipette boy Any supplier n/a
3 compartment Petri dish (94/15 mm) Greiner 637102
Centrifuge Any supplier n/a
Class II saftey cabinet Any supplier n/a
Erlenmeyer flask with vented cap (250 mL) Corning CLS40183
Ethanol (>99.7%) VWR 208221.321
Galleria mellonella (250 per pk) Livefood Direct UK W250
Glycerol Sigma-Aldrich G5150
Homogeniser (FastPrep-24 5G ) MP Biomedicals 116005500
Hygromycin B Corning 30-240CR
Luminometer (Autolumat LB 953) Berthold 34622
Luminometer tubes Corning 352054
Lysing matrix (S, 2.0 mL) MP Biomedicals 116925500
Micro syringe (25 µL, 25 G) SGE 3000
Microcentrifuge Any supplier n/a
Middlebrook 7H11 agar BD Bioscience 283810
Middlebrook 7H9 broth BD Bioscience 271310
Middlebrook ADC enrichment BD Bioscience 212352
Middlebrook OADC enrichment BD Bioscience 212240
Mycobacterium bovis BCG lux Various n/a
n-decyl aldehyde Sigma-Aldrich D7384-100G
Orbital shaking incubator Any supplier n/a
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Polysorbate 80 (Tween-80) Sigma-Aldrich P8074-500ml
Small box Any supplier n/a dark vented or non-sealed box recommended
Tweezer Any supplier n/a Short and narrow tipped/Blunt long tweezers
Winterm (V1.08) Berthold n/a Program LB953.TTB
Petri dish (94/15 mm) Greiner 633181
Filter paper (94 mm) Any supplier n/a Cut to fit

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References

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<em>माइकोबैक्टीरियम तपेदिक</em> परिसर का अध्ययन करने के लिए एक संक्रमण मॉडल के रूप में इनवर्टेब्रेट <em>गैलेरिया मेलोनेला</em> का उपयोग
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Asai, M., Li, Y., Khara, J. S., Gladstone, C. A., Robertson, B. D., Langford, P. R., Newton, S. M. Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex. J. Vis. Exp. (148), e59703, doi:10.3791/59703 (2019).More

Asai, M., Li, Y., Khara, J. S., Gladstone, C. A., Robertson, B. D., Langford, P. R., Newton, S. M. Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex. J. Vis. Exp. (148), e59703, doi:10.3791/59703 (2019).

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