Galleria mellonella ble nylig etablert som en reproduserbar, billig og etisk akseptabel infeksjon modell for Mycobacterium tuberkulose kompleks. Her beskriver vi og demonstrerer trinnene tatt for å etablere en vellykket infeksjon av G. mellonella med Puerto Mosquito Mycobacterium bovis BCG Lux.
Tuberkulose er den ledende globale årsaken til smittsomme sykdommer dødelighet og omtrent en fjerdedel av verdens befolkning antas å være smittet med Mycobacterium tuberkulose. Til tross for ti år med forskning, mange av mekanismene bak suksessen til M. tuberkulose som en patogene organisme gjenstår å bli undersøkt, og utvikling av sikrere, mer effektive antimykobakteriell narkotika er presserende behov for å takle økningen og spredning av legemiddelresistent tuberkulose. Imidlertid er progresjon av tuberkulose forskning flaskehalser av tradisjonelle pattedyr infeksjon modeller som er dyre, tidkrevende, og etisk utfordrende. Tidligere har vi etablert larver av insekt Galleria mellonella (større voks møll) som en roman, reproduserbar, lav pris, høy gjennomstrømming og etisk akseptabel infeksjon modell for medlemmer av M. tuberkulose kompleks. Her beskriver vi vedlikehold, forberedelser og smitte av G. mellonella med Puerto Mosquito Mycobacterium bovis BCG Lux. Ved hjelp av denne infeksjonen modellen, mykobakterieinfeksjoner dose avhengige virulens kan observeres, og en rask avlesning av in vivo mykobakterieinfeksjoner byrde ved hjelp av bioluminesens målinger er lett oppnåelig og reproduserbar. Selv om det finnes begrensninger, slik som mangelen på en fullt kommentert Genova for transcriptomic analyse, kan ontologiske analyse mot genetisk lignende insekter utføres. Som en lav kostnad, rask og etisk akseptabel modell for tuberkulose, kan G. mellonella brukes som en pre-Screen for å bestemme legemiddel effekt og toksisitet, og for å bestemme sammenlignende mykobakterieinfeksjoner virulens før bruk av konvensjonell pattedyr Modeller. Bruken av G. mellonella-mykobakterier modellen vil føre til en reduksjon i betydelig antall dyr som i dag brukes i tuberkulose forskning.
Tuberkulose (TB) er en stor trussel mot global folkehelse med 9 000 000 nye tilfeller per år og 1 500 000 dødsfall1. I tillegg er det anslått at en fjerdedel av verdens befolkning er smittet med utløsende Agent for sykdommen, Mycobacterium tuberkulose (MTB). Blant den infiserte populasjonen vil 5 − 10% utvikle aktiv TB sykdom over levetiden. Videre, fremveksten og spredningen av multi-Drug resistente (MDR) og omfattende-narkotika (XDR) motstandsdyktig MTB utgjør en alvorlig trussel mot sykdom kontroll, med 123 land rapporterer minst ett XDR tilfelle1. Behandling av TB krever en cocktail av minst fire anti-mykobakterieinfeksjoner narkotika, hvorav isoniazid og Rifampicin er foreskrevet for en minimumsvarighet på seks måneder; behandling er ofte forbundet med komplekse bivirkninger og toksisitet. Beskyttelse fra den eneste lisensierte vaksinen mot TB, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-GUÉRIN (BCG), er variabel2. En ufullstendig forståelse av patogenesen av TUBERKULOSE signifikant hemmer utviklingen av nye terapeutiske og vaksinasjon strategier.
I flere ti år har dyr infeksjon modeller vært avgjørende for TB forskning for å forstå de grunnleggende patogenesen og vert respons på infeksjon, og å evaluere romanen anti-mykobakterieinfeksjoner agenter, Immuno-legemiddel og nye vaksine kandidater3, 4. imidlertid, forskning benytter dyr infeksjon modeller av TB er bekjent vanskelig idet patogenesen og progresjon av TB infeksjon er innviklet, og det er nei enkelt dyr modell det etterligner det i sin helhet gjenferd og betydelig vise egenskaper av sykdommen5 ,6. Videre dyr eksperimenter er dyrt, tidkrevende å gjennomføre og krever full etisk begrunnelse. Likevel, dyr infeksjon modeller av TB har blitt beskrevet i ikke-menneskelige primater (f. eks, aper), marsvin, kaniner, storfe, griser, mus og sebrafisk, med hver har sine begrensninger3,4. Den murine modellen er den mest brukte modellen på grunn av kostnader, tilgjengelighet av innavlet linjer, reproduserbarhet av infeksjon og overflod av immunologiske reagenser. Men de vanligvis ikke danner granulomer knyttet til områder av hypoksi som er karakteristisk for latent tuberkulose infeksjon (LTBI)6. Guinea Pigs er høylig mottagelig å MTB infeksjon, med patologi og tidlig granulom formasjon analog med dem inne human, og er vidt anvendt inne vaccine tester; men mangelen på immunologiske reagenser hemmer deres bruk som en infeksjon modell7. Sebrafisk er egnet for storstilt screening i tidlig stadium prekliniske studier på grunn av sin lille størrelse, rask reproduksjon og avanserte genetiske verktøy, men er anatomisk og fysiologisk annerledes enn mennesker og er bare utsatt for Mycobacterium marinum infeksjon3. Dyret modeller mest ligner menneskelig MTB infeksjon er ikke-menneskelige primater (f. eks, macaque), men de er dyre og har betydelige etiske og praktiske hensyn som betydelig begrenser deres bruk8.
Insekt Larven av større voks møll eller honeycomb møll, Galleria mellonella, har blitt stadig mer populært som en infeksjon modell for en rekke bakterielle og fungal patogener9, og som en skjerm for romanen antimikrobielle narkotika kandidater 10. G. mellonella er en vellykket virvelløse modell på grunn av sin sofistikerte medfødte immunsystem (bestående av mobilnettet og humoral forsvar) som deler en høy grad av strukturelle og funksjonelle likhet med virveldyr11 . Dette inkluderer immun mekanismer som fagocytose av patogener ved hemocytes (funksjonelt ligner på pattedyr macrophage og nøytrofile)12,13, produksjon og sirkulasjon av anti-mikrobielle peptider (forsterkere) og komplement-lignende proteiner i hemolymph (analogt til pattedyr blod) av G. mellonella11. Andre fordeler9,14,15 av G. mellonella larver som modell inkluderer 1) deres store størrelse (20 − 30 mm) som gjør det mulig for enkel manipulasjon og infeksjon, samt innsamling av vev og hemolymph for analyser, 2) enkelt vedlikehold ved 37 ° c, kompatibel for å studere menneskelige patogener, 3) presis infeksjon ved injeksjon uten behov for anestesi, 4) effekt av antimikrobielle midler kan vurderes ved hjelp av mindre legemiddel for evaluering, 5) mangel på etiske begrensninger i forhold til bruk av pattedyr, 6) store gruppe størrelser kan brukes i forhold til dyremodeller som gir større reproduserbarhet, og 7) kortere tid for infeksjon eksperimenter er nødvendig.
I en fersk studie viste vi at G. mellonella kan brukes som en roman infeksjon modell for å studere patogenesen av smitte ved Puerto Mosquito M. bovis BCG Lux, en genmodifisert versjon av vaksinen stamme og medlem av MTB -komplekset (MTBC)16. Mens G. mellonella tidligere har blitt brukt som en infeksjon modell for ikke-tuberkuløs mykobakterier (NTM), hovedsakelig M. marinum og Mycobacterium abscessus17,18, studier med MTBC er begrenset til av Li et al.16. Puerto Mosquito ikke-patogene mykobakterieinfeksjoner stammer, som kan brukes på forvaring nivå (CL) 2 som et surrogat for MTB, tilbyr fordelene av sikkerhet og praktisk over patogene mykobakterier. Etter infeksjon med BCG Lux, larver begynner å utvikle tidlige granulom strukturer, som kan gi verdifull innsikt i rollen som medfødt immunitet i ETABLERINGEN av TB infeksjon16. I tillegg har denne enkle virvelløse infeksjon modellen potensial til å gi en rask, rimelig og pålitelig evaluering av TB patogenesen innlemme kontrollert utfordring og flere replikerer for reproduserbarhet. Videre har modellen potensial til å bli brukt til skjermen romanen anti-TB narkotika og vaksine kandidater i tidlig utvikling, redusere det totale antall dyr i eksperimentering. Muligheten til å måle endringer i verts-og patogen struktur, transcriptome og proteom å bestemme narkotika mål og vurdere virkningsmekanismer av romanen narkotika og terapeutiske vaksiner, er også en fordel.
Her beskriver vi de eksperimentelle protokollene for utarbeidelse av en Puerto Mosquito M. bovis BCG Lux inokulum og G. mellonella larver for mykobakterieinfeksjoner infeksjon, samt fastsettelse av både larvestadiet og mykobakterieinfeksjoner overlevelse som reaksjon på infeksjon.
Bruk av G. mellonella som en infeksjon modell har blitt etablert for en rekke bakterielle og fungal patogener for studiet av virulens, Host-patogen samhandling, og som en skjerm for romanen legemiddel selskap10,22. Følgende diskusjon er basert på den eksperimentelle prosedyren for bruk av G. mellonella som en infeksjons modell for MTBC.
Helsen til naive larver før eksperimentering kan ha en betydelig innvi…
The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet ble støttet av tilskudd fra bioteknologi og biologisk vitenskap Research Council (BBSRC), tildelt PRL og YL (BB/P001262/1), og National Center for utskifting, raffinement og reduksjon av dyr i forskning (NC3Rs) tildelt PRL, SMN, BDR og YL (NC/R001596/1).
1.5ml reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
20, 200 and 1000 µl pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
25 ml pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
3 compartment Petri dish (94/15mm) | Greiner | 637102 | |
Centrifuge | Any supplier | n/a | |
Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml) | Corning | CLS40183 | |
Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
Lysing matrix (S, 2.0ml) | MP Biomedicals | 116925500 | |
Micro syringe (25 µl, 25 ga) | SGE | 3000 | |
Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
Petri dish (94/15mm) | Greiner | 633181 | |
Filter paper (94mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |