Bruk av virvelløse Galleria mellonella som en infeksjon modell for å studere Mycobacterium tuberkulose kompleks

Summary

Galleria mellonella ble nylig etablert som en reproduserbar, billig og etisk akseptabel infeksjon modell for Mycobacterium tuberkulose kompleks. Her beskriver vi og demonstrerer trinnene tatt for å etablere en vellykket infeksjon av G. mellonella med Puerto Mosquito Mycobacterium bovis BCG Lux.

Abstract

Tuberkulose er den ledende globale årsaken til smittsomme sykdommer dødelighet og omtrent en fjerdedel av verdens befolkning antas å være smittet med Mycobacterium tuberkulose. Til tross for ti år med forskning, mange av mekanismene bak suksessen til M. tuberkulose som en patogene organisme gjenstår å bli undersøkt, og utvikling av sikrere, mer effektive antimykobakteriell narkotika er presserende behov for å takle økningen og spredning av legemiddelresistent tuberkulose. Imidlertid er progresjon av tuberkulose forskning flaskehalser av tradisjonelle pattedyr infeksjon modeller som er dyre, tidkrevende, og etisk utfordrende. Tidligere har vi etablert larver av insekt Galleria mellonella (større voks møll) som en roman, reproduserbar, lav pris, høy gjennomstrømming og etisk akseptabel infeksjon modell for medlemmer av M. tuberkulose kompleks. Her beskriver vi vedlikehold, forberedelser og smitte av G. mellonella med Puerto Mosquito Mycobacterium bovis BCG Lux. Ved hjelp av denne infeksjonen modellen, mykobakterieinfeksjoner dose avhengige virulens kan observeres, og en rask avlesning av in vivo mykobakterieinfeksjoner byrde ved hjelp av bioluminesens målinger er lett oppnåelig og reproduserbar. Selv om det finnes begrensninger, slik som mangelen på en fullt kommentert Genova for transcriptomic analyse, kan ontologiske analyse mot genetisk lignende insekter utføres. Som en lav kostnad, rask og etisk akseptabel modell for tuberkulose, kan G. mellonella brukes som en pre-Screen for å bestemme legemiddel effekt og toksisitet, og for å bestemme sammenlignende mykobakterieinfeksjoner virulens før bruk av konvensjonell pattedyr Modeller. Bruken av G. mellonella-mykobakterier modellen vil føre til en reduksjon i betydelig antall dyr som i dag brukes i tuberkulose forskning.

Introduction

Tuberkulose (TB) er en stor trussel mot global folkehelse med 9 000 000 nye tilfeller per år og 1 500 000 dødsfall¹. I tillegg er det anslått at en fjerdedel av verdens befolkning er smittet med utløsende Agent for sykdommen, Mycobacterium tuberkulose (MTB). Blant den infiserte populasjonen vil 5 − 10% utvikle aktiv TB sykdom over levetiden. Videre, fremveksten og spredningen av multi-Drug resistente (MDR) og omfattende-narkotika (XDR) motstandsdyktig MTB utgjør en alvorlig trussel mot sykdom kontroll, med 123 land rapporterer minst ett XDR tilfelle¹. Behandling av TB krever en cocktail av minst fire anti-mykobakterieinfeksjoner narkotika, hvorav isoniazid og Rifampicin er foreskrevet for en minimumsvarighet på seks måneder; behandling er ofte forbundet med komplekse bivirkninger og toksisitet. Beskyttelse fra den eneste lisensierte vaksinen mot TB, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-GUÉRIN (BCG), er variabel². En ufullstendig forståelse av patogenesen av TUBERKULOSE signifikant hemmer utviklingen av nye terapeutiske og vaksinasjon strategier.

I flere ti år har dyr infeksjon modeller vært avgjørende for TB forskning for å forstå de grunnleggende patogenesen og vert respons på infeksjon, og å evaluere romanen anti-mykobakterieinfeksjoner agenter, Immuno-legemiddel og nye vaksine kandidater^{3, 4}. imidlertid, forskning benytter dyr infeksjon modeller av TB er bekjent vanskelig idet patogenesen og progresjon av TB infeksjon er innviklet, og det er nei enkelt dyr modell det etterligner det i sin helhet gjenferd og betydelig vise egenskaper av sykdommen^{5 ,6}. Videre dyr eksperimenter er dyrt, tidkrevende å gjennomføre og krever full etisk begrunnelse. Likevel, dyr infeksjon modeller av TB har blitt beskrevet i ikke-menneskelige primater (f. eks, aper), marsvin, kaniner, storfe, griser, mus og sebrafisk, med hver har sine begrensninger^3,4. Den murine modellen er den mest brukte modellen på grunn av kostnader, tilgjengelighet av innavlet linjer, reproduserbarhet av infeksjon og overflod av immunologiske reagenser. Men de vanligvis ikke danner granulomer knyttet til områder av hypoksi som er karakteristisk for latent tuberkulose infeksjon (LTBI)⁶. Guinea Pigs er høylig mottagelig å MTB infeksjon, med patologi og tidlig granulom formasjon analog med dem inne human, og er vidt anvendt inne vaccine tester; men mangelen på immunologiske reagenser hemmer deres bruk som en infeksjon modell⁷. Sebrafisk er egnet for storstilt screening i tidlig stadium prekliniske studier på grunn av sin lille størrelse, rask reproduksjon og avanserte genetiske verktøy, men er anatomisk og fysiologisk annerledes enn mennesker og er bare utsatt for Mycobacterium marinum infeksjon³. Dyret modeller mest ligner menneskelig MTB infeksjon er ikke-menneskelige primater (f. eks, macaque), men de er dyre og har betydelige etiske og praktiske hensyn som betydelig begrenser deres bruk⁸.

Insekt Larven av større voks møll eller honeycomb møll, Galleria mellonella, har blitt stadig mer populært som en infeksjon modell for en rekke bakterielle og fungal patogener⁹, og som en skjerm for romanen antimikrobielle narkotika kandidater ¹⁰. G. mellonella er en vellykket virvelløse modell på grunn av sin sofistikerte medfødte immunsystem (bestående av mobilnettet og humoral forsvar) som deler en høy grad av strukturelle og funksjonelle likhet med virveldyr¹¹ . Dette inkluderer immun mekanismer som fagocytose av patogener ved hemocytes (funksjonelt ligner på pattedyr macrophage og nøytrofile)^12,13, produksjon og sirkulasjon av anti-mikrobielle peptider (forsterkere) og komplement-lignende proteiner i hemolymph (analogt til pattedyr blod) av G. mellonella¹¹. Andre fordeler^9,14,15 av G. mellonella larver som modell inkluderer 1) deres store størrelse (20 − 30 mm) som gjør det mulig for enkel manipulasjon og infeksjon, samt innsamling av vev og hemolymph for analyser, 2) enkelt vedlikehold ved 37 ° c, kompatibel for å studere menneskelige patogener, 3) presis infeksjon ved injeksjon uten behov for anestesi, 4) effekt av antimikrobielle midler kan vurderes ved hjelp av mindre legemiddel for evaluering, 5) mangel på etiske begrensninger i forhold til bruk av pattedyr, 6) store gruppe størrelser kan brukes i forhold til dyremodeller som gir større reproduserbarhet, og 7) kortere tid for infeksjon eksperimenter er nødvendig.

I en fersk studie viste vi at G. mellonella kan brukes som en roman infeksjon modell for å studere patogenesen av smitte ved Puerto Mosquito M. bovis BCG Lux, en genmodifisert versjon av vaksinen stamme og medlem av MTB -komplekset (MTBC)¹⁶. Mens G. mellonella tidligere har blitt brukt som en infeksjon modell for ikke-tuberkuløs mykobakterier (NTM), hovedsakelig M. marinum og Mycobacterium abscessus^17,18, studier med MTBC er begrenset til av Li et al.¹⁶. Puerto Mosquito ikke-patogene mykobakterieinfeksjoner stammer, som kan brukes på forvaring nivå (CL) 2 som et surrogat for MTB, tilbyr fordelene av sikkerhet og praktisk over patogene mykobakterier. Etter infeksjon med BCG Lux, larver begynner å utvikle tidlige granulom strukturer, som kan gi verdifull innsikt i rollen som medfødt immunitet i ETABLERINGEN av TB infeksjon¹⁶. I tillegg har denne enkle virvelløse infeksjon modellen potensial til å gi en rask, rimelig og pålitelig evaluering av TB patogenesen innlemme kontrollert utfordring og flere replikerer for reproduserbarhet. Videre har modellen potensial til å bli brukt til skjermen romanen anti-TB narkotika og vaksine kandidater i tidlig utvikling, redusere det totale antall dyr i eksperimentering. Muligheten til å måle endringer i verts-og patogen struktur, transcriptome og proteom å bestemme narkotika mål og vurdere virkningsmekanismer av romanen narkotika og terapeutiske vaksiner, er også en fordel.

Her beskriver vi de eksperimentelle protokollene for utarbeidelse av en Puerto Mosquito M. bovis BCG Lux inokulum og G. mellonella larver for mykobakterieinfeksjoner infeksjon, samt fastsettelse av både larvestadiet og mykobakterieinfeksjoner overlevelse som reaksjon på infeksjon.

Protocol

Merk: alt arbeid som er beskrevet nedenfor skal utføres i et CL2-laboratorium i et klasse 2 mikrobiologisk sikkerhetskabinett (MSC) etter lokale retningslinjer for helse og sikkerhet. 1. utarbeidelse av M. bovis BCG Lux for infeksjon Tine en frossen 1,2 mL glyserol (15%) lager av M. bovis BCG Lux, Montreal vaksine stamme forvandlet med shuttle plasmider pSMT1 bærer luxAB gener fra Vibrio harveyi koding av luciferase enzymet<sup …

Representative Results

Her presenterer vi representative data som kan fås ved hjelp av g. mellonella -BCG Lux infeksjon modell og fremheve fordelene ved g. mellonella som en infeksjon modell for medlemmer av MTBC (figur 1). Eksperimentelle prosedyrer med viktige tekniske punkter er skissert i figur 2. <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59703…

Discussion

Bruk av G. mellonella som en infeksjon modell har blitt etablert for en rekke bakterielle og fungal patogener for studiet av virulens, Host-patogen samhandling, og som en skjerm for romanen legemiddel selskap^10,22. Følgende diskusjon er basert på den eksperimentelle prosedyren for bruk av G. mellonella som en infeksjons modell for MTBC.

Helsen til naive larver før eksperimentering kan ha en betydelig innvi…

Materials

1.5ml reaction tube (Eppendorf)	Eppendorf	22431021
20, 200 and 1000 µl pipette and filtered tips	Any supplier	n/a
24 well culture plate	Greiner	662160
25 ml pipettes and pipette boy	Any supplier	n/a
3 compartment Petri dish (94/15mm)	Greiner	637102
Centrifuge	Any supplier	n/a
Class II saftey cabinet	Any supplier	n/a
Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml)	Corning	CLS40183
Ethanol (>99.7%)	VWR	208221.321
Galleria mellonella (250 per pk)	Livefood Direct UK	W250
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5150
Homogeniser (FastPrep-24 5G )	MP Biomedicals	116005500
Hygromycin B	Corning	30-240CR
Luminometer (Autolumat LB 953)	Berthold	34622
Luminometer tubes	Corning	352054
Lysing matrix (S, 2.0ml)	MP Biomedicals	116925500
Micro syringe (25 µl, 25 ga)	SGE	3000
Microcentrifuge	Any supplier	n/a
Middlebrook 7H11 agar	BD Bioscience	283810
Middlebrook 7H9 broth	BD Bioscience	271310
Middlebrook ADC enrichment	BD Bioscience	212352
Middlebrook OADC enrichment	BD Bioscience	212240
Mycobacterium bovis BCG lux	Various	n/a
n-decyl aldehyde	Sigma-Aldrich	D7384-100G
Orbital shaking incubator	Any supplier	n/a
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
Polysorbate 80 (Tween-80)	Sigma-Aldrich	P8074-500ml
Small box	Any supplier	n/a	dark vented or non-sealed box recommended
Tweezer	Any supplier	n/a	Short and narrow tipped/Blunt long tweezers
Winterm (V1.08)	Berthold	n/a	Program LB953.TTB
Petri dish (94/15mm)	Greiner	633181
Filter paper (94mm)	Any supplier	n/a	Cut to fit