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Immunology and Infection

Uso de la Invertebrada Galleria mellonella como Modelo de Infección para Estudiar el Complejo Mycobacterium tuberculosis

doi: 10.3791/59703 Published: June 30, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Galleria mellonella se estableció recientemente como un modelo de infección reproducible, barato y éticamente aceptable para el complejo Mycobacterium tuberculosis. Aquí describimos y demostramos los pasos dados para establecer una infección exitosa de G. mellonella con Bioluminiscente Mycobacterium bovis BCG lux.

Abstract

La tuberculosis es la principal causa mundial de mortalidad por enfermedades infecciosas y se cree que aproximadamente una cuarta parte de la población mundial está infectada con Mycobacteriumtuberculosis. A pesar de décadas de investigación, muchos de los mecanismos detrás del éxito de M. tuberculosis como organismo patógeno aún están por investigar, y el desarrollo de medicamentos antimicobacterianos más seguros y eficaces son urgentemente necesarios para hacer frente al aumento y propagación de la tuberculosis farmacorresistente. Sin embargo, la progresión de la investigación de la tuberculosis se debe al cuello de botella de los modelos tradicionales de infección de mamíferos que son costosos, lentos y éticamente desafiantes. Anteriormente establecimos las larvas del insecto Galleria mellonella (mayor polilla de cera) como un modelo de infección novedoso, reproducible, de bajo costo, de alto rendimiento y éticamente aceptable para los miembros del complejo M. tuberculosis. Aquí describimos el mantenimiento, preparación e infección de G. mellonella con Bioluminiscentmycobacterium bovis BCG lux. Usando este modelo de infección, se puede observar virulencia dependiente de la dosis micobacteriana, y una lectura rápida de la carga micobacteriana in vivo utilizando mediciones de bioluminiscencia es fácilmente alcanzable y reproducible. Aunque existen limitaciones, como la falta de un genoma totalmente anotado para el análisis transcriptomático, se puede realizar análisis ontológicos contra insectos genéticamente similares. Como modelo de bajo costo, rápido y éticamente aceptable para la tuberculosis, G. mellonella se puede utilizar como pre-pantalla para determinar la eficacia y toxicidad de los medicamentos, y para determinar la virulencia micobacteriana comparativa antes del uso de mamíferos convencionales Modelos. El uso del modelo G. mellonella-mycobacterias conducirá a una reducción del número sustancial de animales utilizados actualmente en la investigación de la tuberculosis.

Introduction

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La tuberculosis (TB) es una amenaza importante para la salud pública mundial, con 9 millones de nuevos casos al año y 1,5 millones de muertes1. Además, se estima que una cuarta parte de la población mundial está infectada con el agente causante de la enfermedad, Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Entre la población infectada, entre el 5 y el 10 % desarrollará la enfermedad de tuberculosis activa a lo largo de su vida. Además, la aparición y propagación de Mtb resistente a múltiples fármacos (MDR) y ampliamente farmacológicos (XDR)representa una grave amenaza para el control de enfermedades, y 123 países informan al menos de un caso XDR 1. El tratamiento de la tuberculosis requiere un cóctel de al menos cuatro medicamentos antimicobacterianos, de los cuales se prescriben isoniazida y rifampicina por una duración mínima de seis meses; a menudo se asocia con efectos secundarios complejos y toxicidades. La protección contra la única vacuna autorizada contra la tuberculosis, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), es la variable 2. Una comprensión incompleta de la patogénesis de la tuberculosis dificulta significativamente el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas y de vacunación.

Durante décadas, los modelos de infección animal han sido vitales para que la investigación de la tuberculosis comprenda la patogénesis básica y la respuesta del huésped a la infección, y para evaluar nuevos agentes antimicobacterianos, inmunoterapéuticos y nuevos candidatos a vacunas3, 4. Sin embargo, la investigación utilizando modelos de infección animal de tuberculosis es notoriamente difícil ya que la patogénesis y la progresión de la infección por tuberculosis son complejas, y no hay un solo modelo animal que imite todo el espectro y las características importantes de la enfermedad5 ,6. Además, los experimentos con animales son costosos, consumen mucho tiempo para llevar a cabo y requieren una justificación ética completa. No obstante, se han descrito modelos de infección animal de tuberculosis en primates no humanos (por ejemplo, macacos), conejillos de indias, conejos, bovinos, cerdos, ratones y peces cebra, y cada uno tiene sus limitaciones3,4. El modelo murino es el modelo más utilizado debido al costo, disponibilidad de líneas endogámicas, reproducibilidad de la infección y abundancia de reactivos inmunológicos. Sin embargo, por lo general no forman granulomas asociados con áreas de hipoxia que son características de la infección por tuberculosis latente (LTBI)6. Los cerdos de Guinea son altamente susceptibles a la infección por Mtb, con patología y formación temprana de granuloma similares a los de los seres humanos, y se utilizan ampliamente en las pruebas de vacunas; sin embargo, la falta de reactivos inmunológicos dificulta su uso como infección modelo7. Los peces cebra son adecuados para el cribado a gran escala en estudios preclínicos en etapas tempranas debido a su pequeño tamaño, reproducción rápida y herramientas genéticas avanzadas, pero son anatómica y fisiológicamente diferentes a los seres humanos y sólo son susceptibles a Infección por Mycobacterium marinum 3. Los modelos animales que se asemejan más a la infección humana por Mtb son primates no humanos (por ejemplo, el macaco), pero son caros y tienen consideraciones éticas y prácticas significativas que limitan considerablemente su uso8.

La larva de insectos de la polilla de cera mayor o polilla de panal,Galleria mellonella, se han vuelto cada vez más populares como modelo de infección para una variedad de patógenos bacterianos y fúngicos9,y como una pantalla para nuevos candidatos a fármacos antimicrobianos 10. G. mellonella es un modelo invertebrado exitoso debido a su sofisticado sistema inmunológico innato (compuesto por defensas celulares y humorales) que comparte un alto grado de similitud estructural y funcional con el de los vertebrados11 . Esto incluye mecanismos inmunes como la fagocitosis de patógenos por hemocitos (funcionalmente similar a los macrófagos y neutrófilos de mamíferos)12,13, la producción y circulación de péptidos antimicrobianos (AMP) y proteínas similares a complementos dentro de la hemolinfa (análogos a la sangre de mamíferos) de G. mellonella11. Otras ventajas9,14,15 de G. mellonella larvas como modelo incluyen 1) su gran tamaño (20-30 mm) que permite una fácil manipulación e infección, así como la recolección de tejido y hemolinfa para análisis, 2) fácil mantenimiento a 37 oC, compatible para el estudio de patógenos humanos, 3) infección precisa por inyección sin necesidad de anestesia, 4) la eficacia de los agentes antimicrobianos puede evaluarse utilizando menos fármacos para evaluación, 5) falta de las limitaciones éticas en comparación con el uso de mamíferos, 6) tamaños de grupo grande se pueden utilizar en comparación con los modelos animales que permiten una mayor reproducibilidad, y 7) tiempos más cortos para experimentos de infección se requieren.

En un estudio reciente, demostramos que G. mellonella puede ser utilizado como un modelo de infección novedoso para estudiar la patogénesis de la infección por Bioluminiscente M. bovis BCG lux, una versión modificada genéticamente de la cepa vacunal y miembro del complejo Mtb (MTBC)16. Mientras que G. mellonella se ha utilizado previamente como un modelo de infección para micobacterias no tuberculosas (NTM), principalmente M. marinum y Mycobacterium absceso17,18, los estudios con MTBC se limitan a 16. Las cepas micobacterianas bioluminiscentes no patógenas, que se pueden utilizar a nivel de contención (CL) 2 como sustituto de Mtb, ofrecen las ventajas de seguridad y practicidad sobre las micobacterias patógenas. Después de la infección por BCG lux, las larvas comienzan a desarrollar estructuras tempranas similares al granuloma, lo que podría proporcionar información valiosa sobre el papel de la inmunidad innata en el establecimiento de la infección por tuberculosis16. Además, este sencillo modelo de infección por invertebrados tiene el potencial de proporcionar una evaluación rápida, de bajo costo y confiable de la patogénesis de la tuberculosis que incorpora desafío controlado y múltiples réplicas de reproducibilidad. Además, el modelo tiene el potencial de ser utilizado para examinar nuevos candidatos a fármacos antituberculosos y vacunas en desarrollo temprano, reduciendo el número total de animales en experimentación. La capacidad de medir los cambios en la estructura del huésped y del patógeno, el transcriptoma y el proteoma para determinar las dianas farmacológicas y evaluar los mecanismos de acción de nuevos fármacos y vacunas terapéuticas también son ventajosas.

Aquí describimos los protocolos experimentales para la preparación de un bioluminiscente M. bovis BCG lux inoculum y larvas de G. mellonella para la infección micobacteriana, así como la determinación de larvas y micobacterias supervivencia en respuesta a la infección.

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Protocol

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NOTA: Todo el trabajo descrito a continuación debe llevarse a cabo en un laboratorio CL2 dentro de un gabinete de seguridad microbiológico (MSC) de clase 2 siguiendo las pautas locales de salud y seguridad.

1. Preparación de M. bovis BCG lux para la infección

  1. Descongelar un glicerol congelado de 1,2 ml (15%) Stock de M. bovis BCG lux, la cepa vacunal Montreal transformada con el plásmido lanzadera pSMT1 que lleva los genes luxAB de Vibrio harveyi codificando la enzima luciferasa19.
  2. Inocula15 mL de caldo Middlebrook 7H9 que contiene 0,2% de glicerol, 10% de albúmina, dextrosa, enriquecimiento catalasa (ADC) y 50 g/ml de higromicina con una alícuota de 1,2 ml de BCG lux, en un matraz Erlenmeyer de 250 ml.
  3. Colocar el matraz en un recipiente de bioseguridad sellado e incubar a 37oC en una incubadora de agitador orbital a 220 rpm durante 72 h (o hasta que el cultivo alcance la fase intermedia de crecimiento).
  4. Compruebe el crecimiento del cultivo de BCG lux preparando diluciones de 1:10 del cultivo en tubos luminómetros utilizando solución salina tamponada de fosfato (PBS, pH 7,4, tampón de fosfato de 0,01 M, cloruro de potasio de 0,0027 M y cloruro de sodio de 0,137 M) en duplicado. Vórtice, y cargue los tubos del luminómetro en el luminómetro y mida la bioluminiscencia (unidad de luz relativa [RLU]/mL) utilizando n-decyl aldehído como sustrato (1% v/v en etanol absoluto)20.
    NOTA: La proporción de unidades formadoras de RLU/colonia (CFU) se determinó previamente en 3:1 cuando BCG lux se cultivaba in vitro en caldo Middlebrook 7H920.
  5. Centrifugar el cultivo a 2.175 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente para peletizar las células y desechar el sobrenadante en un desinfectante adecuado con actividad micobactericida conocida. Deseche todos los residuos de cultivo con desinfectantes apropiados para las micobacterias siguiendo las directrices locales.
  6. Lave el pellet celular dos veces en PBS que contenga 0.05% polisorbato 80 (PBS-T) para evitar el aglutinamiento bacteriano.
  7. Después del lavado final, decantar el sobrenadante de residuos, resuspender el pellet de células micobacterianas en PBS-T y diluir la suspensión micobacteriana a la densidad celular deseada mediante mediciones de RLU.
  8. Preparar diez diluciones seriales del inóculo en placas de 24 pocillos con PBS-T. Placa de salida de 10 l sobre placas de agar Middlebrook 7H11 (0,5% glicerol, higromicina de 50 g/ml, ácido oleico 10%, albúmina, dextrosa, catalasa [OADC]) por duplicado para enumerar los recuentos de UFC de inóculo.

2. Preparación de larvas de G. mellonella

  1. Comprar las larvas de última estrella de fuentes apropiadas y mantener las larvas en la oscuridad a 18 oC a la llegada y utilizar dentro de 1 semana de la compra. Alternativamente, las larvas pueden ser auto-criadas siguiendo el protocolo de Jojoo et al.21. Para las larvas compradas, deseche las larvas muertas, descoloridas o pupating antes de su almacenamiento.
    NOTA: Las larvas pupadas son morfológicamente distinguibles a las últimas larvas instar.
  2. Identificar y seleccionar larvas sanas para la experimentación, basadas en un color crema uniforme con poca o ninguna decoloración (melanización), tamaño (2 x 3 cm de longitud), peso (aproximadamente 250 mg), mostrando un alto nivel de motilidad, y poseyendo la capacidad de derecha ellos mismos cuando se dio la vuelta.
  3. Cuente cuidadosamente las larvas sanas (mínimas de 20 a 30 por grupo) en una placa Petri (94/15 mm) forrada con una capa de papel filtrante (94/15 mm) utilizando pinzas de extremo romo para minimizar la contaminación y almacenar a temperatura ambiente en la oscuridad hasta su uso.

3. Infectar G. mellonella con BCG lux

  1. Minimice el desorden dentro del MSC para reducir el riesgo de contaminación y lesiones en el pinchazo de la aguja.
  2. Prepare la plataforma de inyección pegando un papel de filtro circular (94 mm) a una superficie plana elevada. Las superficies blandas o duras se pueden utilizar y depende totalmente de las preferencias del usuario, por ejemplo, tapas de cajas de pipetas o una esponja de nylon.
  3. Esterilice una microjeringa de 25 l (25 G) aspirando 3 volúmenes de etanol al 70% y enjuague con 3 volúmenes de PBS-T estéril.
  4. Aspirar 10 l de BCG lux inoculum (preparado en la sección 1) o PBS-T en la microjeringa esterilizada de 25 ml. Utilice una jeringa separada para el control negativo PBS-T.
    NOTA: Resuspenda el inóculo BCG lux después de 10 inyecciones para garantizar una suspensión celular uniforme.
  5. Use pinzas para recoger una larva y colocarla en la plataforma de inyección.
  6. En la plataforma, voltea la larva hacia su espalda e inmoviliza asegurando la cabeza y la cola con las pinzas. Localice la última proleg izquierda contando hacia abajo desde la cabeza de la larva e inserte cuidadosamente la punta de la aguja (5 x 6 mm) en un ángulo de 10 a 20o con respecto al plano horizontal.
    NOTA: Las pinzas cortas y estrechas permiten una fácil inmovilización con un mínimo estrés larvaria. Prestar atención a no penetrar en exceso que puede perforar el intestino y causar melanización específica o muerte no BCG lux.
  7. Contar las larvas infectadas en una placa Petri forrada con una capa de papel de filtro, una sola placa Petri de 90 mm puede acomodar hasta 30 larvas.
  8. Almacene el plato Petri que contiene las larvas en una caja oscura ventilada o no selladadentro de una incubadora a 37 oC con un 5% de CO 2.

4. Monitoreo de la supervivencia de G. mellonella después de la infección

  1. Con el paso del tiempo, monitorear la supervivencia de las larvas cada 24 h. Las larvas se consideran muertas cuando no se mueven en respuesta al tacto.

5. Medición de la carga In Vivo de BCG lux en G. mellonella

  1. En cada momento, seleccione al azar cinco larvas infectadas previamente preparadas en la sección 3 y esterilizar suavemente las superficies larvales usando hisopos de algodón empapados en 70% etanol.
    NOTA: Este paso es importante cuando se enchapa el homogeneizado larvario para la enumeración de UFC micobacteriana, ya que las larvas no esterilizadas pueden conducir a la contaminación.
  2. Coloque las larvas individualmente en tubos de matriz de lisión de 2 ml que contengan 800 ml de PBS estéril.
  3. Homogeneizar las larvas utilizando un homogeneizador durante 60 s a 6,0 m/s.
  4. Centrifugar los tubos de lisiado a 3.500 x g durante 5 s para eliminar el homogeneizado de las tapas, y decantar cuidadosamente el homogeneizado en tubos luminómetros estériles individualmente.
    NOTA: Para la enumeración de la CFU (paso 5.7), asegúrese de reservar 100 ml de homogeneato en un tubo de reacción estéril de 1,5 ml.
  5. Recupere cualquier homogeneizado restante lavando los tubos de matriz de lising con 1 ml de PBS-T y pipeta en los tubos luminómetros correspondientes.
  6. Vortex los tubos del luminómetro y medir la bioluminiscencia de los homogeneizados descritos anteriormente en el paso 1.4.
  7. Preparar diluciones seriales diez veces del homogeneato en placas de cultivo de 24 pocillos utilizando PBS-T. Placa de salida de 10 l de la dilución en placas de agar Middlebrook 7H11 que contienen 0,5% de glicerol, 50 g/ml de higromicina, 10% de OADC y 20 g/ml de piperacilina, para determinar la relación RLU/CFU de BCG lux después de la infección in vivo.
    NOTA: Piperacilina elimina la microbiota nativa G. mellonella con una inhibición mínima del crecimiento de BCG lux16.

6. Análisis estadístico

  1. Trazar la curva de supervivencia Kaplan-Meier utilizando los datos recopilados y llevar a cabo la prueba Mantel-Cox (Log-rank) para determinar la importancia del resultado, donde *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 y ****p < 0.0001.

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Representative Results

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Aquí presentamos datos representativos que se pueden obtener utilizando el modelo de infección G. mellonella — BCG lux y destacamos los beneficios de G. mellonella como modelo de infección para los miembros del MTBC (Figura1). Los procedimientos experimentales con puntos técnicos clave se describen en la Figura2.

Figure 1
Figura 1: Los beneficios de G. mellonella como modelo de infección. Esta figura ha sido adaptada de Kavanagh y Sheehan22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Esquema de los procedimientos experimentales. (A) Mantenimiento y preparación de G. mellonella para la infección por M. bovis BCG lux. (B) Preparación del cultivo del lux de BCG y del inóculo para la infección. (C) Infección de G. mellonella con BCG lux. (D) Medición de la virulencia y carga in vivo de BCG lux en larvas de G. mellonella. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se observó virulencia dependiente de la dosis de BCG lux en larvas de G. mellonella durante un período de incubación de 96 h (Figura 3), y se determinó que la dosis letal necesaria para la mortalidad larvaria del 50% (LD50) era de 1 x 107 UFC. La distribución de supervivencia que refleja la virulencia de las dosis de lux de BCG probadas fue significativamente diferente (p < 0.0001). Los grupos de control inyectados con una dosis de 10 l de PBS-T o aquellos simplemente pinchados simulando lesiones por aguja, no afectaron la salud de la larva o conduzcan a un aumento de la mortalidad según lo determinado por los controles observacionales de la motilidad y la melanización en diferentes momentos.

Figure 3
Figura 3: Curva de supervivencia Kaplan-Meir de G. mellonella en respuesta a la inocula variable de M. bovis BCG lux. Las larvas sanas (n 10 por grupo), se infectaron con diferentes dosis de BCG lux. Las larvas fueron incubadas a 37oC y monitoreadas para sobrevivir cada 24 h durante un máximo de 96 h. El grupo no infectado fue inyectado con PBS, y un grupo pinchado (inserción de aguja solamente) demostró el efecto de la lesión de la aguja en la salud larval. Se muestran los medios de dos experimentos independientes, con un intervalo de confianza del 95%, representados como líneas punteadas en el color correspondiente al inóculo. Esta figura ha sido adaptada de Li et al.16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Todas las larvas infectadas con BCG lux mostraron cambios fisiológicos a lo largo del tiempo y, para las larvas infectadas con una dosis de 2 x 107 UFC de BCG lux,se observó la melanización de la línea dorsal larval a partir de 48 h después de la infección (pi), y la sistemática de la infección dorsal de 48 h (pi), y la sistemática la melanización se observó a partir de 96 h pi (Figura4). Además, la motilidad de las larvas se redujo con la gravedad de la melanización y la capacidad de las larvas para pupar se perdió tras la infección en comparación con los controles no infectados.

Figure 4
Figura 4: Melanización de G. mellonella en respuesta a la infección por M. bovis BCG lux. Las larvas sanas a 0 h se infectaron con una dosis de 2 x 107 Ufc de BCG lux. A 48 h y 96 h pi, se observó la melanización a lo largo de la línea dorsal larval y la melanización sistemática, respectivamente.

La supervivencia de BCG lux dentro de las larvas de G. mellonella se determinó durante 2 semanas mediante la medición de la bioluminiscencia de los homogeneatos larvarios. La infección con una dosis de 1 x 107 CFU de BCG lux dio lugar a una disminución inicial de la bioluminiscencia de BCG lux de 0 a 72 h pi. Sin embargo, de 72 a 144 h pi, la bioluminiscencia de BCG lux meseta, indicando el establecimiento de una infección persistente (Figura5).

Figure 5
Figura 5: Carga in vivo de M. bovis BCG lux en G. mellonella cuantificada mediante bioluminiscencia (unidad de luz relativa, RLU/ml) durante un curso de dos semanas. Las larvas sanas (n.o 30) se infectaron con 1 x 107 cFU dosis de BCG lux. La carga in vivo se cuantificó homogeneizando cinco larvas en cada punto de tiempo (0, 24, 48, 72, 96, 168, 336 h), y midiendo la bioluminiscencia del homogeneizado. Se muestran los medios de tres experimentos independientes y las barras de error representan la desviación estándar de la media. Esta cifra ha sido reimpresa de Li et al.16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Dado que la cuantificación rápida y reproducible del crecimiento micobacteriano in vivo en estos estudios se determinó mediante la medición de la bioluminiscencia, la proporción de RLU y UFC también debe determinarse in vivo. En nuestro sistema de infección particular, la relación in vivo de RLU y CFU osciló entre 2:1-5:1, con un promedio de 4:1 durante el curso de tiempo de 168 horas (Figura6).

Figure 6
Figura 6: Determinación de la relación in vivo RLU/CFU de M. bovis BCG lux en G. mellonella. Las larvas sanas (n.o 30) se infectaron con 1 x 107 cFU dosis de BCG lux. En cada momento (0, 24, 96 y 168 h), se homogeneizaron cuatro larvas infectadas/controladas (PBS-T) y se midieron los homogenatos para bioluminiscencia y se nivelaron en el agar 7H11 para enumerar los recuentos de UFC. Se muestran los medios de dos experimentos independientes y las barras de error representan la desviación estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Se ha establecido el uso de G. mellonella como modelo de infección para una serie de patógenos bacterianos y fúngicos para el estudio de la virulencia, la interacción huésped-patógeno, y como una pantalla para las nuevas terapias10,22. La siguiente discusión se basa en el procedimiento experimental para el uso de G. mellonella como modelo de infección para el MTBC.

La salud de las larvas ingenuas antes de la experimentación puede tener un impacto considerable en el resultado del experimento. Por lo tanto, es vital que las larvas descoloridas y/o lesionadas se eliminen a su llegada y no se utilicen para ninguna experimentación. Si un gran número de larvas se encuentran muertas dentro del mismo recipiente a su llegada, es aconsejable desechar el lote, ya que las infecciones preexistentes pueden ser la causa de la muerte. Cuando sea posible, realice experimentos utilizando las larvas tan cerca del día de compra/llegada. Antes de su uso asegúrese de almacenar las larvas a 18 oC para evitar la pupación y maximizar el número de larvas disponibles para la experimentación. Las larvas sanas se pueden utilizar hasta 7 días después de la entrega/compra. Después de la infección, asegúrese de eliminar las larvas muertas de la placa De Petri, ya que, por razones aún desconocidas, la presencia de larvas muertas parece aumentar la tasa de mortalidad en la población de la muestra. Para los usuarios de larvas auto-criadas, es importante ser conscientes de la variabilidad biológica en comparación con las larvas compradas, ya que la varianza en la dieta y las condiciones de crecimiento puede tener un impacto en la inmunidad larvaria21,23. Las variabilidades interexperimentales pueden limitarse manteniendo la fuente, si se compra, o las condiciones de alimentación y crecimiento de las larvas criadas consistentes entre la experimentación. En todos los experimentos, la inclusión de controles negativos "en blanco" y "pinchados" es esencial; el control en blanco es un indicador de contaminación o toxicidad de la matriz de suspensión (PBS-T o caldo de medios), y el control pinchado imita el efecto de la lesión de la aguja en la salud larval. Además, estos controles normalizan cualquier variación biológica entre lotes de larvas, asegurando la reproducibilidad y precisión entre experimentos.

Para la inyección de larvas de G. mellonella, se recomienda el uso de una aguja de 25 G ya que las agujas de calibre más grande pueden causar sangrado excesivo y agujas de calibre más afilado pueden perforar fácilmente el intestino de las larvas, lo que conduce a la mortalidad larvaria y falso positivo Resultados. Los métodos convencionales de inyección de agujas suelen inmovilizar las larvas a mano, lo que aumenta el riesgo de lesiones en la aguja. Mediante el uso de pinzas para inmovilizar las larvas, el riesgo de lesión del pinchazo de aguja se reduce significativamente ya que la mano no está cerca de la aguja en ningún momento durante la infección. Alternativamente, las larvas podrían ser inmovilizadas por enfriamiento. Sin embargo, se ha documentado un shock en frío a 12 oC durante 15 minutos antes de la infección para mejorar la respuesta inmunitaria innata a la infección. Por lo tanto, el análisis de los resultados obtenidos a través de refrigeración debe considerar cuidadosamente su impacto24. Usando nuestra técnica, el rendimiento medio de la inyección (2-3 larvas por minuto) se puede lograr con la práctica del usuario; esto es comparable a la velocidad de la inyección convencional de nuestra experiencia (3 x 4 larvas por minuto). Además, nuestro método se puede adaptar para una inyección de mayor rendimiento mediante la utilización de una plataforma de inyección accionada por pedal compuesta por una bomba de perfusión con una jeringa desechable conectada a una cánula de mariposa de 25 G.

La preparación de BCG lux inoculum se basa en la rápida estimación de la CFU utilizando RLU del cultivo micobacteriano20. En nuestra experiencia con el cultivo del caldo, la relación entre RLU y CFU es de 3:120,contrastando con el crecimiento de BCG lux en G. mellonella donde la relación RLU a CFU es de 5:120. La agregación celular micobacteriana o el "aglutinado" comúnmente observado en cultivos densos puede tener un impacto en las mediciones de RLU, ya que el aglutinamiento puede dar lugar a mediciones de bioluminiscencia poco fiables. Como tal, no se recomienda el uso de cultivo micobacteriano agrupado para la preparación de inóculo. Sin embargo, la adición de polisorbato 80 a los medios de crecimiento minimiza el aglutinamiento celular sin alterar el crecimiento de BCG lux. 16 Cualquier aglutinado de células menores se puede resolver lavando el cultivo con PBS-T y es vital para preparar un inóculo preciso utilizando RLU como lectura. Además, el lavado PBS-T es vital para eliminar cualquier factor de virulencia extracelular secretado durante el crecimiento. También se debe tener en cuenta la cepa micobacteriana y el número de paso, ya que esto puede afectar la gravedad de la agregación micobacteriana25. En todos los casos, el inóculo debe ser enumerado por la CFU en las placas de agar 7H11 para asegurarse de que la UFC correcta se preparó mediante la medición de la bioluminiscencia. Además, la relación RLU/CFU in vivo debe determinarse con nuevos reporteros bioluminiscentes o acciones, ya que la relación probablemente variará.

G. mellonella tiene varias ventajas sobre los modelos convencionales de infección por tuberculosis, incluyendo costos de adquisición y mantenimiento más baratos, facilidad de infección y rendimiento de investigación, especialmente en combinación con cepas bioluminiscentes16. La falta de limitaciones éticas permite un mayor tamaño de la muestra (mínimo de 20 a 30 larvas por grupo) en comparación con los modelos de mamíferos, dando mayor confianza y fiabilidad en los resultados obtenidos26,27. Sin embargo, hay una serie de limitaciones en el uso de G. mellonella como un modelo de infección. Como invertebrados, carecen naturalmente de inmunidad adaptativa por lo que no son adecuados para la antigenicidad o estudios inmunológicos10. Las respuestas inmunitarias innatas celulares de G. mellonella se componen de varios tipos de hemococitos, y se ha informado que los plasmacitos y los granulocitos funcionan de manera similar a los fagocitos de mamíferos (neutrófilos y macrófagos)12. Sin embargo, el papel y los mecanismos de estos tipos de células siguen estando caracterizados, y aún no se han llevado a cabo estudios comparativos directos entre fagocitos de mamíferos e insectos. Además, la falta de un genoma anotado de G. mellonella dificulta el análisis de la respuesta del huésped a la infección, y esto depende actualmente del análisis de ontología genética frente a bibliotecas transcriptomicas de otros invertebrados, como Drosophila melanogaster y Bombyx mori28.

Como modelo de infección de tuberculosis, G. mellonella tiene un futuro prometedor con su capacidad para desarrollar estructuras similares al granuloma en respuesta a la infección bcG lux 16,que son señas de identidad fisiopatológicas vitales de la infección por tuberculosis y son una clave en el desarrollo de LTBI. El trabajo futuro tendrá como objetivo caracterizar este modelo con un interés particular en la formación de estructuras similares al granuloma utilizando aislados de Mtb de referencia, clínicos y mutantes en condiciones CL3. Además, anticipamos que también puede ser útil para el cribado de nuevos agentes antimicobacterianos, ya que se utilizó un modelo similar de G. mellonella para las MNA18,pero esto está por determinar. La adopción de este modelo tiene la capacidad de reducir significativamente el número de animales utilizados en la comunidad de investigación de la tuberculosis, al mismo tiempo que acelera la producción de investigación in vivo contra la tuberculosis en condiciones éticamente más aceptables.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este proyecto fue apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación en Biotecnología y Ciencias Biológicas (BBSRC), otorgados a PRL e YL (BB/P001262/1), y el Centro Nacional para la Sustitución, Refinamiento y Reducción de Animales en Investigación (NC3Rs) otorgados a PRL, SMN, BDR e YL (NC/R001596/1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL reaction tube (Eppendorf) Eppendorf 22431021
20, 200 and 1,000 µL pipette and filtered tips Any supplier n/a
24 well culture plate Greiner 662160
25 mL pipettes and pipette boy Any supplier n/a
3 compartment Petri dish (94/15 mm) Greiner 637102
Centrifuge Any supplier n/a
Class II saftey cabinet Any supplier n/a
Erlenmeyer flask with vented cap (250 mL) Corning CLS40183
Ethanol (>99.7%) VWR 208221.321
Galleria mellonella (250 per pk) Livefood Direct UK W250
Glycerol Sigma-Aldrich G5150
Homogeniser (FastPrep-24 5G ) MP Biomedicals 116005500
Hygromycin B Corning 30-240CR
Luminometer (Autolumat LB 953) Berthold 34622
Luminometer tubes Corning 352054
Lysing matrix (S, 2.0 mL) MP Biomedicals 116925500
Micro syringe (25 µL, 25 G) SGE 3000
Microcentrifuge Any supplier n/a
Middlebrook 7H11 agar BD Bioscience 283810
Middlebrook 7H9 broth BD Bioscience 271310
Middlebrook ADC enrichment BD Bioscience 212352
Middlebrook OADC enrichment BD Bioscience 212240
Mycobacterium bovis BCG lux Various n/a
n-decyl aldehyde Sigma-Aldrich D7384-100G
Orbital shaking incubator Any supplier n/a
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Polysorbate 80 (Tween-80) Sigma-Aldrich P8074-500ml
Small box Any supplier n/a dark vented or non-sealed box recommended
Tweezer Any supplier n/a Short and narrow tipped/Blunt long tweezers
Winterm (V1.08) Berthold n/a Program LB953.TTB
Petri dish (94/15 mm) Greiner 633181
Filter paper (94 mm) Any supplier n/a Cut to fit

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References

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Uso de la Invertebrada <em>Galleria mellonella</em> como Modelo de Infección para Estudiar el Complejo <em>Mycobacterium tuberculosis</em>
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Asai, M., Li, Y., Khara, J. S., Gladstone, C. A., Robertson, B. D., Langford, P. R., Newton, S. M. Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex. J. Vis. Exp. (148), e59703, doi:10.3791/59703 (2019).More

Asai, M., Li, Y., Khara, J. S., Gladstone, C. A., Robertson, B. D., Langford, P. R., Newton, S. M. Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex. J. Vis. Exp. (148), e59703, doi:10.3791/59703 (2019).

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