Summary
ヒドロラーゼドメイン含有タンパク質のフマリアルセトー酢酸水素の発現および精製は、例(大腸菌、FPLCにおける発現)と記載されている。精製タンパク質は、結晶化および抗体産生に使用され、酵素アッセイに使用されます。選択されたフォトメトリックアッセイは、オキサロアセテートデカルボキシラーゼおよびアシルピルベートヒドロラーゼとしてFAHD1の多機能性を表示するために提示される。
Abstract
フマリラセトー酢酸ヒドロラーゼ(FAH)ドメイン含有タンパク質(FAHD)は、真核生物におけるFAHスーパーファミリーのメンバーを同定する。このスーパーファミリーの酵素は、一般的に、主にヒドロラーゼおよびデカルボキシラーゼ機構を含む多機能性を示す。本稿では、FAHDタンパク質の発現および精製のための一連の連続的な方法を提示し、主にFAHDタンパク質1(FAHD1)のオロローグ(ヒト、マウス、線虫、植物など)を含む。カバーされた方法は、大腸菌、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、準備および分析ゲル濾過、結晶化、X線回折、およびフォトメトリックアッセイにおけるタンパク質発現である。高純度の濃縮タンパク質(>98%)結晶化または抗体産生に使用することができる。類似または低品質のタンパク質は、酵素アッセイに用いられるか、または検出システム(ウェスタンブロット、ELISA)で抗原として使用されてもよい。本研究の議論では、FAHD1の同定された酵素機構について、そのヒドロラーゼおよびデカルボキシラーゼ二機能性をより詳細に説明する。
Introduction
フマリラセトー酢酸ヒドロラーゼ(FAH)1、2の超ファミリー酵素は、高度に保存された触媒性FAHドメイン3、4、5、6を共有する酵素群を記述する。,7,8,9,10.共通の触媒中心にもかかわらず、これらの酵素は多機能であり、そのほとんどは原核生物に含まれ、複雑な炭素源から取り出した化合物を分解するために使用される3。この家族の3人のメンバーだけが今のところ真核生物で同定された:FAH2を与える名前、ならびにFAHドメイン含有タンパク質1(FAHD1)11、12、13、14 、15およびFAHドメイン含有タンパク質2(FAHD2)。FAHD1の枯渇は、損なわれたミトコンドリア呼吸13、16と関連しており、中間電位にリンクされている可逆型の細胞老化表現型14と関連している電子輸送システムの欠点。ヒトFAHD1およびそのモデルシステムにおけるそのオルソロゲ(マウス、線虫、癌細胞株、植物など)、ならびに選択された点変異変異体は、潜在的な関心の薬物標的となっている。本研究では、高純度の組換えタンパク質と、結晶構造や選択的抗体によって導かれる触媒機構に関する情報が不可欠です。
本原稿では、大腸菌におけるFAHDタンパク質発現の方法、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、捕食および分析ゲル濾過、結晶化、X線回折、およびフォトメトリックアッセイ。ここで説明する方法とプロトコルの目的は、細菌学、植物生物学、動物や人間の研究などの多様な分野で働く科学者に、FAHスーパーファミリーのメンバーを特徴付けるガイダンスを提供することです。特徴のないスーパーファミリー会員は、特定の分野で関連性を持つ必要があります。ここで説明するプロトコルは、他の原核生物または真核生物FAHスーパーファミリーメンバーを特徴付けることを目的とするプロジェクトに貴重なサポートを提供する可能性があります。
ここで説明する方法の背後にある根拠は、不十分に記述されたタンパク質(特に、未知の生理的関連性の代謝酵素)の特性において、精製組換えタンパク質から始めるアプローチが可能であるという事実である。インビトロ活性酵素製剤、高品質抗体、選択酵素に対する強力かつ特異的な薬理学的阻害剤などの貴重で高品質な研究ツールの開発。記載された方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)およびX線結晶学を必要とする。代替方法(例えば、化学誘導なしでタンパク質を発現させる、または熱処理後の遠心分離によるタンパク質精製を表示し、その後脱塩およびサイズ排除クロマトグラフィーを行う)は、他の場所で17を見出してもよい。FAHスーパーファミリー酵素2、7、9、17、18の発現と精製には幅広い方法が利用可能ですが、本研究は発現と特にFAHDタンパク質の精製。
この原稿の議論部では、FAHD1タンパク質(ヒドロラーゼ、デカルボキシラーゼ)15について同定された触媒機構について、触媒反応の化学的特徴を実証するために、より詳細に説明する。前作7、15、18(PDB:6FOG、PDB:6FOH)に基づいて得られたデータは、ケトエノールイソメラーゼとしての酵素の第3の活性を意味する。
Protocol
1. 有能な大腸菌におけるFAHDタンパク質の発現
- FAHDタンパク質発現のためのベクターによる大腸菌の変質
注: 次のセクションで説明する手順は、図 1A、Bのスケッチに要約されています。ポイント変異型変異体を含む任意の FAHD タンパク質にも同じプロトコルが適用されます。このような変異体は、野生型cDNAから部位指向変異体およびPCR技術19(両面SOE PCR20など)を介して得られ得る。
図 1: 有能な大腸菌の増幅とタンパク質発現の誘導
(A)pETベクターを有能なBL21(DE3)pLysS大腸菌に挿入し、セクション1に記載する。(B)pET形質転換大腸菌のヒートショックプロトコルとめっきは、プロトコルのステップ1に記載されている。 形質転換された細菌は、選択のための抗生物質とLB寒天プレートにめっきされています。(C)pET形質転換大腸菌の増幅は、セクション1に記載されている。コロニーはLB寒天プレートから採取され、細菌密度が0.4の経験閾値に達するまで栄養培地(LBまたはNZCYM)で増幅される。 (D)DE3-IPTG-pETシステムを介したタンパク質発現の誘導は、セクション1に記載され、図2にスケッチした。タンパク質産生は、化学IPTGの応用によって開始される。セクション1の終わりに、タンパク質を含む細菌ペレットが収穫される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。- 有能なBL21(DE3)pLysS大腸菌およびpET発現ベクターを得る(材料の表を参照)。好ましくは、以下の精製工程を簡素化するために、便宜上、N-端末Hisタグまたは関連キャプチャタグもエンコードするpETベクトルを選択する。
- 選択したFAHDタンパク質のcDNAを取得し、PET発現ベクターの活性クローニング部位に挿入し、それぞれT7プロモーターとT7ターミネータ部位の間に挿入する。
- プラスミド増幅と検証に成功した後[T7プライマーは、便宜上pETシステムで使用することができます:T7プロモーター、フォワードプライマー:TAATACGACTCACTATAGGG;T7ターミネータ、リバースプライマー:GCTAGTTATTGCTCAGCGG)]]、5-10 ngのプラスミドを100μLの有能なBL21(DE3)pLysS大腸菌を氷上に挿入する。上下に吸引しないでくださいが、内容を混ぜるためにチューブを少しタップします。
- 細菌を氷の上に30分間置き、チューブを数分ごとに軽くたたきます。
- 加熱装置または水浴を42°C(正確)に加熱します。細菌を含むチューブを装置に入れ、90s(正確)に保管してください。すぐに氷の上に置きます(図1A)。
- 氷上で5~10分後、600μLのNCZYM培地(材料表参照)を加え、チューブを細菌インキュベーターに入れます。1時間37°Cで振る方向に向かって中速でチューブを振ります。
- 10cm LB-寒天板上の細菌培養物のプレート200μL(材料の表を参照)、選択した抗生物質を含む[例えば、BL21(DE3)pLysS耐性(クロラムフェニコール)に特異的なもの、および耐性のための1つpETベクター(カナマイシンまたはアンピシリン、図1B)にエンコードされる。
- 一晩37°Cで細菌インキュベーターでLB-寒天プレート上の細菌を培養する。
- IPTG誘導によるFAHDタンパク質の発現
注: 次のセクションで説明する最初の手順は、図 1C、Dのスケッチとして要約されています。細菌DE3カセットとpETベクターシステムの組み合わせを介したT7発現システムを図2にまとめた。
図 2:DE3カセット/pETベクトルデュアルシステムについて説明しました。
(A)pETベクターのスケッチゲノムはBL21(DE3)pLysS大腸菌を形質転換した。天然の細菌ゲノムは、DE3カセット(パネルBを参照)と、常にラックリプレッサーユニットを発現するlac遺伝子を運びます。非ネイティブpETベクターは、T7ポリメラーゼプロモーターとターミネータ配列の間に挿入されたタンパク質遺伝子を運ぶ。パネルBの詳細(B)天然細菌ゲノムのDE3カセットは、大腸菌RNAポリメラーゼオペロンの観点からT7ポリメラーゼの情報をコードする。 しかし、このタンパク質は、LACリプレッサユニットがRNAポリメラーゼタンパク質の結合を妨げるため、発現されません。したがって、T7ポリメラーゼは発現され、外因性タンパク質は発現しない。(C)化学IPTG(材料表)の適用は、ラックリプレッサーユニットの構造を歪め、DE3カセットに結合するのを防ぎます。その結果、RNAポリメラーゼはカセットに結合することができ、T7ポリメラーゼが発現し、最終的には外因性タンパク質と同様に発現する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。- コロニー形成に成功した後、単一のコロニー(衛星コロニーなし)を1つ選び、NZCYMまたはLB培地の5mLに抗生物質で分散させ、前のように選択します(ステップ1.1.7)。一晩37°Cで細菌インキュベーターで培養する(図1C)。
- 細菌の増殖に成功した後、タンパク質量の需要に応じて、250 mL、500 mL、または1Lバッチの培地で細菌を増幅する。
- 体積に適して、ステップ1.1.7で行われた抗生物質を適用し、密な細菌前培養の約1%〜2%を加える(すなわち、2.5〜5.0mL〜250mLの培地等)。ステップ1.2.5(1 mL以上)で使用するサンプルを採取し、600 nmで光学密度(OD)を確認します。細菌インキュベーター中の細菌を2〜3h(図1C)で37°Cで培養する。
- 2~3時間後、フォトメトリック分析用のサンプルを描画します。600 nmのODが0.4に達した場合は、200 μMを1mM isopropyl-β-D-チオガラクピラノシド(IPTG、材料の表を参照)に適用します。
注: 実際の値は、各 FAHD タンパク質またはポイント変異変異バリアントに対して経験的であり、1 mM IPTG が適用されるべき最大値です。これはタンパク質発現を誘導する(図1D、図2C)。 - 37°Cで細菌インキュベーターでさらに3〜5時間後、タンパク質発現が枯渇する。
注: 温度制御に関するコメントについては、ディスカッション セクションを参照してください。誘導後の5時間以上の揺れはお勧めしません。ステップ 1.2.5 (1 mL 以上) で使用するサンプルを採取し、600 nm の光学密度 (OD) を確認します。- 5分間5,000 x gで遠心分離を介して細菌ペレットを収穫し、上清を捨て、より長い貯蔵のために-80 °Cでペレットを凍結し、短い貯蔵のために-20 °C(図1D)。
- "-I" (誘導前) と "+I" (誘導後) というラベルが付いた 2 つの取得済みフォトメトリック サンプルを使用して誘導を確認します。細菌ペレットの遠心分離と再懸濁後、同じ量の全タンパク質をロードしてSDS-PAGEで2つのサンプルを分析します。
注: "+I" サンプルは選択したタンパク質の分子量に関連付けられた強いバンドを表示する必要がありますが、"-I" サンプルにはこのバンドを含めるべきではありません。低誘導レベルはタンパク質の産生に共通の問題ですが、発現タンパク質のレベルは、多くの場合、次のステップで十分です。高い誘導レベルは利点ですが、必須ではありません。
2. 細菌ペレットのリシスと破片の濾過
- 選択したタンパク質がHisタグまたはタグなしのいずれであるかに応じて、Ni-NTA 実行バッファー (彼のタグ付け、材料の表を参照) または氷冷 HIC ランニング バッファー (タグなし) を選択します。
- 元の細菌懸濁液の各250 mLについて、選択したバッファーの5mLを細菌ペレットに適用します(250mLの場合は5mL、500mLの場合は10mLなど)。適用されたバッファーの5 mLあたり10 μL β-メルカプトエタノール(β-ME)を加える。10 mLのパスツールピペを使用して、ペレットを傷つけてピペッティング(ピペッティング中の気泡形成を避ける)によってペレットをサスペンションに機械的に強制します。最終的に1つの50 mLチューブにサスペンションのすべてを転送します。
- 好ましくは超音波(中力で15s用6x)懸濁液を。
- 4°Cで高速(10,000 x g)で30分間遠心分離機。氷上のフィルター単位(例えば、0.45 μm、0.22 μm)で連続して上清を濾過します。
注:前の遠心分離ステップに応じて、小さなフィルター細孔サイズを通して直接濾過は退屈であり、通常は大きな細孔サイズを介して事前濾過を必要とします。より良い結果を与えるため、DNAse を追加できます。 - サンプルを氷の上に保存し、タンパク質がHisタグであるかタグなしかに応じて、セクション3または4のいずれかに直ちに進みます。
3. Ni-NTA親和性クロマトグラフィーを用いた彼のタグ付きFAHDタンパク質の精製
注:Ni2+イオンは、ニトリロトリアセチン酸(NTA)を介して、親和性クロマトグラフィーに使用されるアガロース樹脂(固定化金属イオンクロマトグラフィー、IMAC、図3A)に結合する。ポリヒスチジンアミノ酸タグは、このNi-キレートに強く結合し、彼のタグ付きタンパク質は、残りのタンパク質の大部分から分離することができます。Ni-NTAカラムの記載された調製に代わるものは、あらかじめパックされたNi-NTAカラムとFPLCシステムを使用することです。
図 3:クロマトグラフィーの一般的なタイプのスケッチイラスト。
(A) Ni-NTAカラムの樹脂。NTAは、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー(IMAC)の観点から使用される二価ニッケルイオンを保持しています。ポリヒスチジンタグは、好ましくは、このモチーフに結合し、イミダゾールによってelutedされてもよい。(B)フェニル系疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC-フェニル)におけるシリカ粒子の典型的なコーティング。疎水性タンパク質はコーティング材料と相互作用し、他のタンパク質は、他のものではない間、その移行に遅れています。(C)イオン相互作用クロマトグラフィーにおけるシリカ粒子の典型的なコーティング。偏光タンパク質と荷電タンパク質はコーティング材料と相互作用し、他のタンパク質は移行が遅れますが、他のタンパク質はそうではありません。(D)サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)におけるシリカゲルの樹脂。シリカ材料中の定義された細孔に基づいて、タンパク質は、その大きさ(その分子量に対応する最初の近似で)によって分離されてもよい。小さなタンパク質は多孔質カラム材料に浸透し、遅れ、大きなタンパク質は多孔質粒子の周りをより速く移動します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- ステップ2.5から進みます(すなわち、タンパク質はNi-NTA実行バッファー内にあり、氷上の0.22 μmフィルター単位で濾過されます)。
- 空のプラスチックまたはガラスの柱を洗浄し、安定したリテーナに取り付けることによって、空のプラスチックまたはガラスの柱を準備します。タンパク質懸濁液の体積に応じてカラムのサイズを選択します。
- タンパク質懸濁液の10 mLごとに、Ni-NTAアガローズスラリーの500 μLをカラムに塗布します(使用前に大きく振ります)。ピペットを使用して、スラリーをゆっくりとドロップして列の下部フィルタに適用します。列を決済し、数秒かかります。
- Ni-NTAの実行中のバッファでカラムを完全に埋め、アガロース樹脂を破壊しないようにします。バッファーを重力で駆け抜けましょう。このプロセスは、(蓋や手袋と親指の圧力を使用して)液体に親指圧を加えることによって加速されるかもしれませんが、アガロース樹脂を歪ませないように注意してください。
- タンパク質懸濁液を塗布します。前と同様に、サンプルを重力で駆け抜けましょう。流量が低い場合、カラムへのタンパク質の結合が強化されるため、親指圧を使用してこのステップを加速することはお勧めしません。チューブ(材料のテーブル)でフロースルーを収集します。
- サンプルが通過した後、Ni-NTA 実行バッファで列全体をもう一度塗りつぶします。アガロース樹脂を破壊しないように注意してください。サンプルを重力で駆け抜けましょうが、前のステップとは対照的に、非特異的な相互作用のために潜在的な汚染がこの方法で中断される可能性があるため、親指圧によるプロセスの加速が推奨されます。洗浄液をチューブに入れます。この手順を繰り返します。
- カラムの下にUV透明キュベットを配置し、Ni-NTA溶出バッファーの1 mLを適用します。樹脂に親指の圧力をかけずにサンプルを採取してください。
- 280 nmとブランクサンプル(すなわち、Ni-NTA溶出バッファー)でサンプルの光学密度(OD)を確認してください。最適に、サンプルには 2.5 より大きい OD が表示されます。0.5未満のODは、サンプル中に有意な量のタンパク質がないことを示します。
注:議論セクションで概説したように、溶出バッファーの塩およびイミダゾール濃度は、各FAHDタンパク質に個別に適合する必要があります。 - OD が 0.5 を下回るまで、手順 3.1.7 と 3.1.8 を繰り返します。氷の上のチューブに高いODを持つすべてのサンプルをプールします。
- ステップ 3.1.4 からもう一度開始し、ステップ 3.1.5 からのフロースルーをステップ 3.1.5 のこの繰り返しの新しい入力として使用します。ステップ 3.1.6 で収集した最初のサンプルに OD が 0.5 未満表示されるまで、この手順を繰り返します。
注:ディスカッションセクションのトラブルシューティングの部分で説明されているように、Hisタグ付きタンパク質はNi2+-樹脂に不十分に結合する可能性があります。このような場合には、この工程または代替方法(例えば、イオン交換クロマトグラフィー)の繰り返しが必要である。 - SDS-PAGE 分析のすべての中間分数のサンプルを取ります。
- Ni-NTA溶出バッファー内のFAHDタンパク質は、凍結および解凍時に沈殿します。したがって、異なるバッファーに対してタンパク質を透析する(氷上で一晩、透析バッファーの100mL当たり1μLのDTTを用いる)。この手順の後に実行するイオン交換クロマトグラフィーの種類に基づいて、低塩バッファーを使用します。14 kDa (材料の表) の典型的な分子量カットオフで一般的なセルロースチューブを使用してください。
- 一晩透析の後、必要に応じて超遠心フィルターユニットを使用してタンパク質を濃縮します。SDS-PAGE分析(12.5%ランニングゲル、4%スタッキングゲル)を実行して、タンパク質の潜在的な損失、不十分な溶出、およびタンパク質純度全般をチェックします。すべてが問題ない場合は、セクション 5 に進みます。
4. 疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)によるタグなしFAHDタンパク質の精製
注:FPLC用HICカラム中のシリカゲルのコーティング表面上のフェニル基(図3B)は、疎水性特性に応じてタンパク質の分離を可能にする。記載されたステップは、HIC-フェニルカラムの5 mLを備えたFPLCシステムで行う必要があります。カラムは、異なるタンパク質に再利用するために1M NaOHで洗浄してもよい。しかし、一度FAHDタンパク質の1種類に使用されたカラムは、このタイプのタンパク質にのみ再利用する必要があります。
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硫酸アンモニウム(AS)沈殿
- 手順 2.5 から進みます。タンパク質は、氷冷HICランニングバッファー(材料の表)にあります。
- マイクロリットル(V初期)に対して調製されたタンパク質溶液の体積を正確に評価する。35 ボリューム%AS 飽和度に達するまで、冷却済みの HIC 実行バッファー AS ソリューションをゆっくりとドロップワイズで追加します: VASが追加 = V初期* 0.538。4°Cで高速(≥10,000 x g)で15分間30分間静急に溶液を静かにかき混ぜます。
- 氷上の0.22 μmフィルターユニットを使用して上清を濾過します。必要に応じて、SDS-PAGE分析用のサンプルを採取します:希釈1:4と95°Cで直ちに5分間加熱するか、またはサンプルが塊になります。試料は、別の日に進むために、この時点(-20°C)で凍結してもよい。
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HIC カラムを使用した FPLC
- FPLCシステムをセットアップし、5mL HIC-フェニルカラムを20%EtOH(H2 O)の5カラムボリューム(CV)で平衡化し、続いてH2Oの5 CVを使用します。
- HIC 実行バッファーの 260 mL を 140 mL の HIC 実行バッファー AS (正確) と混合します。これにより、35 ボリューム%AS ソリューションが発生します。pH (7.0) を確認します。これはバッファー A. バッファ B は実行中のバッファーの 250 mL です。バッファー A と B の両方に 1 mM DTT を追加し、氷の上に置きます。
- このシーケンスでは、8 mL のバッファー A、8 mL のバッファー B、および 8 mL のバッファー A でカラムを平衡化します。プロトコル・ステップ4.1で調製したサンプルを適用します。280 nmでベースライン光吸収が1000〜500 mAUに達するまで、バッファーAで洗浄する。
- ASの濃度が33%(w/v)になるように、バッファーAとBの混合物を適用します。1 CVで洗浄し、クロマトグラムに高原をもたらす。バッファ B のグラデーションを設定します (時間の経過と共にバッファー B が最大 100%) : バッファー B の 1.5 mL を 3.8 分 (つまり、1% B/mL 傾斜を持つ 5.7% バッファー B)280 nmの紫外線信号が上昇したら、分数の収集を開始し、すぐに氷の上に置きます。
- 最後に、バッファBでカラムを洗います。SDS-PAGE 分析のすべての分数のサンプルを取ります。液体窒素を使用してすべてのサンプルを凍結し、-80 °C.でそれらを保存します。
- SDS-PAGE(およびウェスタンブロット)解析を実行して、収集された画分内のFAHDタンパク質を検出します。タンパク質を含む分数はプールされ、次のプロトコルステップで概説されているように、さらなる精製に適用されます。H2O および 20% EtOH (H2O) でカラムを洗います。
5. イオン交換クロマトグラフィーによるFAHDタンパク質の精製
注:荷電された官能基を有する分子は、FPLC(図3C)のシリカ粒子カラムに結合している。これにより、表面電荷などのイオン性の特性に応じてタンパク質を分化することができます。記載されたステップは、FPLCマシンと関連するノウハウをそれぞれ使用して実行する必要があります。記載された方法は、カチオンまたはアニオン交換クロマトグラフィーのいずれについても同じですが、使用するバッファはわずかに異なります。
- カチオンまたはアニオン交換クロマトグラフィーシステムを選択した。この選択は経験的であり、FAHDタンパク質によって異なる場合があります。最適には、両方の方法を連続して使用できます。
- FPLCシステムをセットアップし、20%EtOHの5 CV(H2 O)でカラムを洗浄し、続いてH2 Oの5 CVを低塩バッファー、高塩バッファー、および再び低塩バッファーの1 CVで平衡化します。
- サンプル(ステップ3.1.11から正しい低塩バッファーに対して透析)をカラムに適用します。フロースルーを収集します。低塩バッファーで1 CVのカラムを洗います。
- 勾配溶出をセットアップする:流量1mL/minで30分で100%高塩バッファー、または流量0.5mL/分で60分。これは、精製を最適化するために、既知のFPLCクロマトグラムに基づいて再選択されてもよい。すべてのピーク分数を収集します。
注:高塩条件は、議論のセクションで概説されているように、FAHDタンパク質によって異なる場合があります。 - グラデーションが終了したら、1 CV の範囲でピークが検出されないまで、高塩バッファーで実行します (分数を収集します)。
- 収集されたすべての分数のサンプルを採取し、SDS-PAGE分析(12.5%ランニングゲル、4%スタッキングゲル)を実行します。個々のサンプルを液体窒素で凍結し、-80°Cで保存します。
- SDS-PAGE解析が完了したら、FAHDタンパク質を含むサンプルをプールし、他のサンプルを廃棄します。必要に応じて、超遠心フィルターユニットを使用してタンパク質を濃縮します。
- 0.5 M NaOH(または他の洗剤)で25%SDSの1 mLを塗布し、カラムを洗浄します。H2O および 20% EtOH (H2O) でカラムを洗います。
- 必要に応じて、代替カラム(カチオンまたはアニオン交換クロマトグラフィー)でセクション5を繰り返す。この方法から得られたタンパク質は、塩基性活性アッセイを行うために十分に純粋であるか、または結晶学用のスクリーニングアッセイに使用することができる。高度なアプリケーションの場合は、セクション 6 に進みます。
6. サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によるFAHDタンパク質の精製
注:FPLC用シリカゲルカラム中の多孔質粒子は、流体力学半径(図3D)などの分子サイズに応じてタンパク質の分化を可能にします。説明されたステップは、SECカラムを使用してFPLCシステムで実行される予定です。
- SDS-PAGEおよび銀染色によって検出される汚染の分子量に依存するSECカラムを選択してください。輪郭を描く方法は、両方の列に適しています。H2O の 400 mL でカラムを一晩洗い、SEC 実行バッファで平衡化します。このステップを自動化するには、FPLC システム用のプログラムを作成することをお勧めします。
- SECランニングバッファの300 mLに1 mM DTTを追加し、氷の上に置く。これは実行中のバッファーです。このバッファーの 60 mL を列に適用します。
- タンパク質サンプル(10分間10,000 x g)を遠心分離し、マイクロ沈殿物を除去します。列に上清を適用します。一般に、FPLCの前に上清を濾過することをお勧めします。
- すべてのタンパク質がエラスに含めるまで、実行中のバッファーを列に適用します。適切な体積の分数(例えば、2 mL)ですべてのピークを収集します。SDS-PAGEのサンプルを採取し、液体窒素を使用してすべての分画を凍結します。冷凍画分を-80°Cに保管してください。
- SDS-PAGE(およびウェスタンブロット)分析後、FAHDタンパク質を含むすべての分画を収集してプールします。銀染色は、まだ存在する可能性のある小さな汚染を検出することをお勧めします。
- タンパク質を濃縮するために、超遠心フィルターユニットを使用します。FAHDタンパク質には必須ではありませんが、一般に脱塩工程(例えば、透析による)は、酵素アッセイおよび結晶化のために推奨されます。
- FAHDタンパク質の純度を高めるために、異なる流量と塩濃度(経験的)で6.3~6.6の手順を数回繰り返します。H2O および 20% EtOH (H2O) で一晩カラムを洗います。
7. 基板オキサロ酢酸塩とアセチルピルビ酸を使用した基本的なFAHD活性アッセイ
注:FAHDタンパク質1(FAHD1)は、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ(ODx)およびアシルピルベートヒドロラーゼ(ApH)活性を表示します。これについては、ディスカッション セクションで詳しく説明します。水溶液中のケトエノールツオメライゼーションによる不安定化(すなわち、エノライゼーション)のために、オキサロ酢酸塩は、共因子濃度およびpHの関数として時間の経過とともに単独で崩壊する(自動デカルボキシル化)。pH7の周りと25°Cの温度では、この効果は劇的ではありませんが、自動脱カルボキシル化と酵素濃度の両方を考慮してアッセイをブランクする必要があります。ピペッティングスキームの概要は図 4Aです。一般に、このアッセイには十分にキャリブレーションされたピペットを使用することをお勧めします。
図 4: 酵素アッセイ用のスケッチピペッティングスキーム。
(A)基礎基質ベースのFAHDタンパク質酵素アッセイのスケッチピペッティングスキーム。基板ブランク: -S/-E;基板サンプル: +S/-E;酵素ブランク: -S/+E;酵素サンプル:+S/+E(S:基板、E:酵素)。詳細については、プロトコル ステップ 7 を参照してください。(B) FAHDタンパク質のマイケルス・メンテン運動学を評価するためのスケッチされたピペッティングスキーム。基板ブランク: -S/-E;基板サンプル: +S/-E;酵素ブランク: -S/+E;酵素サンプル:+S/+E(S:基板、E:酵素)。詳細については、プロトコルのセクション 8 を参照してください。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- マイクロプレートリーダーを起動し、25°Cで30分間平衡化します。255 nm で 12 ウェル (図 4Aで概説されているように) を読み取るためのプログラムをセットアップします。5 ミリ秒の遅延で 25 の複数の読み出しを使用することをお勧めします。サイクルを設定して、2 分ごとに 15 x (合計 30 分) を測定します。
- デフォルトでは、pH 7.4で1mM MgCl2を持つ酵素アッセイバッファー(材料の表を参照)を調製します。変異型FAHDタンパク質は、異なる共因子またはpHレベルを必要としてもよい。Mg2+および Mn2+は、FAHD13、11、12、21の係合要因として知られています。
- 1 μg/μLタンパク質溶液を作成し、酵素アッセイバッファー(材料表)で希釈します。
- 試験する基質の20mM溶液の1mLを設定する(これまでに同定されたFAHDタンパク質の基質は、酵素アッセイバッファー内の他の場所にリストされている)。
- 図4Aに表示されるピペッティングスキームによれば、酵素ブランクおよびサンプルウェル:酵素アッセイバッファー(材料表)のピペット90μLを酵素溶液の5μL(5 μg)でウェルに調製する。
- 図4Aに表示されるピペッティングスキームによれば、基板ブランクおよびサンプルウェル:ピペ95μLの酵素アッセイバッファーをウェルに調製する。
- 測定の直前に、6つの空白のウェルに5 μLの酵素アッセイバッファーを塗布します。20 mM基板溶液の5 μLをサンプルウェルに塗布します。マルチチャンネルピペットを使用することをお勧めします。
- 50 μL の設定でマルチチャンネルピペットを使用して、すべてのウェルを穏やかに混合します。ブランクから始めて、サンプルウェルを進めます。気泡を作成しないように注意してください。プレートをマイクロプレートリーダーに挿入し、255 nm(ステップ7.1で概説)で各ウェルを測定します。
- スプレッドシートで分析を実行します。フォトメーターの生データをスプレッドシートにコピーし、すべての設定(すべてのドキュメント)を別のシートに書き込みます。4つの調製物のそれぞれの3つの井戸のデータを平均する。サンプルからブランクを減算します。また、標準偏差を計算し、ブランクとサンプルの偏差を合計します。
- このデータをプロットします(Y:光学密度、x:分単位)。指数関数的に減少する曲線を表示する必要があります。使用中の基板の種類に依存して、最初の10分以内の初期増加が観察され、その後、信号が減少する。これは、議論のセクションでより詳細に概説されているように、基板のケトエノールのオートマライゼーションに起因する。
- 時間の経過に伴う光信号データをプロットの最大値で除算し、データを範囲 [0, 1] にスケールダウンするために (図 5Aに例を示します)。最初の減少から始まる曲線の線形範囲を識別し、負の勾配(1 分)を計算します。
- ODの減少の時間経過は、その初期濃度を介して基板に関連付けられています: 100 nmol/ウェル * 傾斜.評価されたタンパク質濃度c0を使用して、特定の活性が計算されます:100 nmol/ウェル* 勾配* 1/c0.μg/ウェルでc0を表し、この方法で計算された特定の活性は、μmol/min/mgに等しい単位nmol/min/μgを使用して表されます。
8. FAHDタンパク質のマイケルス・メンテン運動学の評価
注:FAHDタンパク質のマイケルス・メンテン運動学の評価は、特定のタンパク質活性が反応が起こっている相対タンパク質基質濃度と物理的体積の両方に依存するため、退屈です。信頼性の高い結果を得るためには、定常状態運動学を確立する必要があります。96ウェルUV透明プレート上のテスト済みプロトコルは、次の手順で概説されています。軽微なエラーは通常実験を台無しにするので、すべてのステップは細分的に実行する必要があります。以下に説明するより複雑なアッセイを試みる前に、セクション7に概説されたアッセイを習得することをお勧めします。
図 5: 酵素アッセイの例示的な結果。
(A)標準偏差で基礎基質ベースのFAHDタンパク質酵素アッセイ(0~1の範囲に正規化)のために得られる例示的なUV吸収曲線。任意の時点での光学密度 (OD) 比 [OD(t)/OD(0)] は、初期 OD [t = 0] に正規化されます。OD(0)]。詳細については、プロトコルのセクション 7 を参照してください。(B)標準偏差を伴うヒトFAHD1タンパク質の例示的なマイケルス・メンテン運動学。詳細については、プロトコルのセクション 8 を参照してください。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- マイクロプレートリーダーを起動し、25°Cで30分間平衡化します。255 nm で 72 ウェル (図 4Bで概説されているように) を読み取るためのプログラムをセットアップします。5 ミリ秒の遅延で 25 の複数の読み出しを使用することをお勧めします。サイクルを設定して、2 分(合計 30 分)ごとに 15 倍を測定します。
- 手順 7.2 および 7.3 を実行します。次いで、酵素アッセイバッファーに100mM基板溶液の1mLを設定する。
- 酵素アッセイバッファーで基板溶液の希釈を調製する:40mM、20mM、10mM、6mM、4mM、2mM。アッセイは、対ワイズ(「調整」)酵素/基板濃度で行われます。このために、酵素アッセイバッファー内の酵素溶液の以下の希釈を調製します:0.5 μg/μL、0.4 μg/μL、2.5 μg/μL、2μg/μL、1.5 μg/μL、1μg/μL。
- 図4Bに示すすべてのウェルに180μLの酵素アッセイバッファーを適用する。基板(ブランクおよびサンプル)のすべてのウェルに10 μLの酵素アッセイバッファーを適用します。調製したタンパク質希釈シリーズの10 μLを酵素(ブランクおよびサンプル)のウェルに適用します。基板ブランクと酵素ブランクのウェルのすべてのウェルに10 μLの酵素アッセイバッファーを適用します。
- 測定の直前に、基板試料および酵素試料のウェルに、調製された置換希釈シリーズの10μLを適用する。
- 50 μL の設定でマルチチャンネル ピペットを使用して、ブランクから始めてすべてのウェルを穏やかに混合し、サンプルウェルに進みます。気泡を作成しないように注意してください。
- プレートをマイクロプレートリーダーに挿入し、ステップ8.1で概説されているように、255 nmで各ウェルを測定します。スプレッドシートで分析を実行します。フォトメーターの生データをスプレッドシートにコピーし、すべての設定(すべてのドキュメント)を別のシートに書き込みます。
- 手順 7.11 で概説されているように、希釈系列のポイントごとの個別データ分析を実行します。7.14に。最終的に、初期基板濃度に対するすべての特定の活性およびプロットを得る:2 mM、1 mM、0.5 mM、0.3 mM、0.2 mM、0.1 mM。
- 個々の標準偏差を持つすべてのデータポイントを表示します。コンピュータマイケルス-メンテン運動学は、非線形曲線継手を介して、またはラインウィーバー-バーク分析を介して。個々のポイントを再測定し、ステップ 8.5 および 8.6 で個々のタンパク質濃度/基質濃度対比を適応させる必要がある場合があります。ヒトFAHD1のマイケル・メンテン図は図5Bで提供されている。
9. FAHDタンパク質の結晶化
注:FAHDタンパク質の結晶化(前述の15)は、24ウェルフォーマット(図6A)における吊り下げ水蒸気拡散法によって達成され得る。この技術を用いてヒトFAHD1の結晶化に関するステップバイステッププロトコルを15の下に示す。詳細については、ディスカッション セクションを参照してください。
図 6: FAHDタンパク質の結晶化
(A)標準24ウェルまたは96ウェルSBSフットプリントの結晶化プレート。詳細については、セクション 9 を参照してください。(B) FAHDタンパク質の結晶化における基本的なプレートセットアッププロセス。この図は許可23で再描画されます。詳細については、セクション 9 を参照してください。(C)ヒトFAHD1結晶および対応する回折パターン(小さな挿入物)。最も近い格子間隔は、結晶の回折品質の尺度として挿入物に示されます。数値が小さいほど、解像度が高く、より有益なデータが表示されます。詳細については、プロトコルのセクション 9 を参照してください。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- SECの実行中のバッファーに対してタンパク質が透析されていることを確認します。FAHD1タンパク質は、高濃度(2-5 mg/mL)で利用可能でなければなりません。低濃度では、タンパク質は自発的な核生成の欠如のために結晶化しないことがあります。
- 結晶化のための貯留液の≥20 mLを準備します。蒸留水または脱イオン水を溶媒として使用する3つのストック溶液を作ります:1 M Na-HEPES(最小25mL、pH 7.5に調整)、50%(w/v)ポリエチレングリコール4000(PEG4k)(最小65mL)、および1M MgCl 2(10 mL)。
- 4 x 6 (合計 24) 異なる 15 mL チューブのグリッドをセットアップします。プレート上の対応する位置に従ってラベルを付けます(例えば、行(A、B、C、D)対列(1~6)、"A1"、"B5"、"D6"など)。各管に1 Mナヘペスのピペット1 mL。
- 50% のピペット 1 mL(w/v) PEG4k をチューブの行 A に、2 mL を行 B に、行 C に 3 mL、4 mL を行 D. ピペット 100 μL の 1 M MgCl2の列 1 にチューブの列 1 に、250 μL を列 2 に500 μL を列 3 に、1.0 mL を列 4 に、1.5 mL を列 5 に、2.0 mL を列 6 にします。
- チューブ上のスケールが十分に正確である蒸留水または脱イオン水で10 mLボリュームまですべてのチューブを充填します。
- 人間のFAHD1タンパク質サンプル(または氷から)からヒトFAHD1タンパク質サンプル(〜5mg/mL)を取り出し、少なくとも10分間4°Cのテーブルトップ遠心分離機で最高速度でスピンダウンします。シュウ酸塩との共結晶化が望ましい場合は、タンパク質サンプルに2mMの最終的なシュウ酸濃度が含まれるようにストック溶液からシュウ酸塩を添加します。1 mM DTTを適用し、氷の上に保存します。
- その間、理想的には18°Cで温度制御された部屋の中で、24ウェル結晶化プレートを解凍します。薄いガラスまたはプラスチック棒の助けを借りて、24ウェルプレートのすべての井戸の上の縁にパラフィン油の薄い層を分配します。調製した結晶化カクテル(A1~D6)の800μLを結晶化プレートの各対応ウェルに加えます。
- 新鮮な22mmのカバーリップをきれいな表面に置きます。カバースリップを汚れやほこりで汚染しないようにしてください。必要に応じて、圧縮空気またはダスタースプレーを使用してカバースリップから破片を取り除きます。
- 遠心分離が完了したら、チューブの下部にあるスピンダウン凝集体と破片が再び浮かびないように、タンパク質サンプルを振らないようにしてください。次のステップでは、溶液の表面のすぐ下にあるタンパク質試料からのピペットは、下から凝集体および堆積物をかき混ぜることを避けるために。
- 各ウェル(図6Bを参照)のピペット1μLのタンパク質溶液をカバースリップの中心に、それぞれのリザーバーカクテルの1 μLをタンパク質液滴に加え、気泡を回避します。カバースリップを逆さまにして井戸の上に置き、オイルがカバースリップの気密で井戸を密封するようにします。24ウェルプレートが完成するまで繰り返します。
- プレートを18°Cに保存し、適切な顕微鏡で進行性のスケジュールで滴を観察します。ヒトFAHD1結晶は通常一晩で現れる(図6C参照)。
Representative Results
調製されたクローニングベクターから始まり、BL21(DE3)pLysS大腸菌を購入し、プラスミドをヒートショックまたは任意の適切な代替方法を介して細菌に挿入する(図1)。増幅の短い期間の後、形質転換された細菌は、一晩成長するために、LB寒天プレート上でめっきされます。この時点でのプレートは、さまざまな潜在的なエラー ソースに応じて異なって見える場合があります。プレートは、空(すなわち、コロニーなし)、細菌によって完全に過剰に成長し、またはそれぞれ間に何かであってもよい。最適および非最適な変換後のLB寒天プレートの2つの例を図7Aに示す。あまりにも多くの細菌コロニーは、あまりにも多くの細菌がめっきされた(可能性が高い)か、使用中の抗生物質が期限切れになる可能性があることを示しています(可能性は低い)。あまりにも少ない細菌のコロニーは、十分なプラスミドが変換に使用されなかったか(次回より多くを使用)、または細菌を選択するためにあまりにも多くの抗生物質が使用されたことを示している可能性があります。いずれにせよ、コロニーが存在する場合、2つの選択的抗生物質を使用すると、形質転換されていない細菌が成長する可能性がかなり低いことを意味するので、それらはうまくいくはずです。しかし、コロニーは全く、細菌が変換能力を失ったことを示しています(長期間にわたって間違った貯蔵または貯蔵、繰り返し凍結や解凍などのために)、ヒートショックは成功しませんでした(プラスミド取り込みや細菌は存在しません)。あまりにも多くの熱による死)、クローニングベクターが破損しているか、または誤って選択的抗生物質の間違ったセットが使用された(プラスミドベクター上の耐性遺伝子を検証する)。
図 7:細菌形質転換とIMACの代表的な結果。
(A)形質転換BL21(DE3)大腸菌を用いて代表的なLB寒天板を、以下のプロトコルステップ1.1により得た。左:よく分布したコロニーを持つプレート(正の例)。右: 単一のコロニーだけを持つプレート(負の例)。白い円は良い植民地をマークします。赤い円は、互いに近づきすぎて成長しているコロニーを示し、孤立したコロニーが利用可能である限り選択しないでください。(B)一連の誘導制御の12.5%アクリルアミドSDS-PAGE分析(「-」はIPTG誘導の前を示す。「+」は、IPTG誘導後、ペレット収穫前)を示し、総タンパク質の同量に調整する。これは手順 1.2 で説明します。(C) 彼のタグ付きFAHD1タンパク質のNi-NTA精製の例示的な12.5%アクリルアミドSDS-PAGE分析。これは、プロトコルのセクション 3 で説明します。親和性クロマトグラフィーは、高純度(>70%、黒い矢印)のタンパク質を得るが、いくつかの小さな汚染も観察される(赤い矢印)。これらの汚染は、カラムに結合する非FAHDタンパク質と、FAHDタンパク質に結合するタンパク質から構成されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
検証済みのコロニーが選択され、選択されます。栄養培地で増幅した後、タンパク質発現は化学IPTGの適用によって引き起こされる。発現タンパク質をミリグラム量で含む細菌ペレットを収穫し、発現をSDS-PAGEを介して検証する(例えば図7B参照)。この単純なプロセス中に、いくつかの問題が発生する可能性があります。まず、いくつかのタンパク質は、明らかに宿主細菌の自然代謝を妨げるので、包含体を形成する。これは、ヒトFAHD1およびFAHD2のいくつかの点突然変異について観察された。このような場合、昆虫細胞のような他の発現系がより適切であり、考慮されるべきである。昆虫細胞からペレットを採取した後、例えば、タンパク質の精製は、このプロトコルに記載されているのと同じ手順に従う。第二に、DE3-pETシステムは「漏れ」であることが時々見出される(すなわち、タンパク質はIPTG誘導の前にある程度発現している)。この潜在的な理由はよく理解されていませんが、冷たい部屋のインキュベーターで一晩ゆっくりとタンパク質を発現するのに役立つ可能性があります。第3に、タンパク質は発現しない。これはおそらく最悪のシナリオであり、プラスミドベクターが破損している可能性が高いため、プラスミドを配列することをお勧めします。
His-tagを使用してタンパク質にタグを付けた場合、Ni-NTAアガロースとの親和性クロマトグラフィーは、汚染の大部分を排除する簡単で安価な捕捉方法です(図7C)。 他のタグシステム(STREP-IIなど)にも同様の方法が存在します。タグを使用しなかった場合、硫酸アンモニウム沈殿と連続した疎水性交換クロマトグラフィーの組み合わせは、タンパク質を他のタンパク質の大部分から分離することも得られる(図8A)。しかし、2つの方法(図7C対図8A)を比較すると、Ni-NTA法の優位性はSDS-PAGE解析によって実証することができる。したがって、彼のタグ付きタンパク質を使用することをお勧めします。
図 8: FPLC実験(HIC、イオン交換、SEC)の代表的な結果。
(A)典型的なクロマトグラムおよび12.5%アクリルアミドSDS-PAGE分析は、スルビ酸アンモニウム(AS)後のHIC-フェニルクロマトグラフィーの非タグ付きFAHD1タンパク質の沈殿物を、プロトコルのセクション4に記載する。緑色の線は、AS を含まないバッファ B のグラデーションを反映します。プロセス中にASは徐々にシステムから洗い流される。このパネルを図7Cと比較すると、HIC-フェニル法と比較したNi-NTAアフィニティクロマトグラフィーのパワーと、タンパク質精製にHis-tagシステムを用いた利点を表示します。 (B)Ni-NTA精製後の彼のタグ付きFAHDのカチオン交換クロマトグラフィーの例示的なクロマトグラムおよび12.5%アクリルアミドSDS-PAGE分析。塩勾配を用いて、適用されたサンプルは個々のタンパク質に分離される。(C)例示的なクロマトグラムおよび12.5%アクリルアミドSDS-PAGE分析のG75サイズ排除クロマトグラフィーの彼-タグ付きFAHDのカチオン交換クロマトグラフィーに続く。 この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
連続して、タンパク質は、カチオン/アニオン交換クロマトグラフィーによって残りの汚染からさらに分離され(例えば、図8Bを参照)、その後にサイズ排除クロマトグラフィーが続きます(例えば、図8Cを参照)。この順序で初期精製戦略を設定することをお勧めします。しかし、これらのカラムは、タンパク質が十分に純粋になるまで、その後、その後、バリエーションで組み合わせて使用する必要があります。
単純活性アッセイは、活性基質および/または共因子に関する「はいまたはなし」の決定をテストするために、Ni-NTA精製後のHisタグ付きタンパク質、またはイオン交換カラム後のタグ付けされていないタンパク質で行われてもよい。特定の活性および運動定数は、最高の純度のタンパク質で決定されなければならない。結晶化は、イオン交換カラムの後にタンパク質で試みられるかもしれませんが、結晶の品質は、ほとんどの場合、タンパク質の純度と相関します。ポリクローナル抗体は、精製プロトコルの任意の段階でタンパク質に対して上昇してもよい。しかし、ここでの品質はタンパク質純度とも相関する。
Discussion
重要な手順
FAHDタンパク質は塩濃度に非常に敏感です。低NaCl濃度では、タンパク質は解凍時に沈殿することがありますが、通常は高い塩濃度で完全に再構成することができます。つまり、FAHDタンパク質が何らかの理由で沈殿する場合、より高い塩濃度(>300 μM)で回収または再折り畳みすることができます。しかし、一部の疎水性タンパク質は回収されない(例えば、ヒトFAHD2)が、CHAPSなどの洗剤(最大1%)。またはグリセロール (10%)安定したソリューションに保つために使用できます。いずれにせよ、液体窒素を用いて-80°Cでのショック冷凍と-80°Cでの貯蔵は、解凍の穏やかで遅いプロセスであるので、推奨されます。
ステップ 3.1.10 の Ni-NTA 精製中に予期しない問題が発生する可能性があります。なお、最初のサンプルよりも2番目に採取されたサンプルのODが高いほど、アガロース樹脂の体積が大きすぎる(次の実験では注意を払い、より少ない樹脂を使用する)。また、アガロース樹脂自体は280nmでOD信号を導く(すなわち、アガロース樹脂ベッドの破壊は人工信号を与える)。疑問がある場合は、ブラッドフォードやBSAアッセイのような他の方法を使用してタンパク質濃度を決定することをお勧めします。
酵素アッセイでは、考慮されるべき3つの重要な側面があります。まず、タンパク質濃度を評価することは、正しい特定の活性を得るために重要です。タンパク質の純度のレベルは、結果に影響を与えており、推定する必要があります。タグ付けされたタンパク質の場合、タグ部分の質量を計算する必要があり、それに応じて特定の活性を修正する必要があります。プロトコルのセクション7に記載されている単純なアッセイの場合、Ni-NTA純度は、活性基質と非活性基質、共因子などを区別するのに十分です。より複雑なマイケル・メンテン運動学の場合、すべての反応物および基板濃度を正しく決定する必要があります。特にオキサロ酢酸塩(時間の経過とともに自動脱カルボキシレート)を使用する場合、反応の酵素部分は自動脱カルボキシル化のために補正されなければなりません(両方の反応が同時に起こることを前提に)。基板のケトエノールツオメライゼーションに対応した光密度信号の初期変化を考慮する必要があります。第3に、濃度と体積を調整する必要があります。酵素および基板の定義された濃度との反応は、アッセイ量に依存して異なる結果を与えうる。ウェル当たりの酵素が多すぎると、液体の接着が実際に結果に偏る可能性があります。
マイケルス・メンテン運動学を評価するためには、最適な組み合わせを見つけるために、100 μL、200 μL、および300 μLバッチで初期実験を行うことをお勧めします。同様の側面は、運動アッセイの酵素基板濃度の比率に適用されます。基板当たりの酵素が多すぎるか、酵素当たりの基位が多すぎると、システムは線形定常状態のマイケルスの範囲外に置かされます。これらの条件を最適化するには、初期実験が必要です。ヒトFAHD1(野生型)タンパク質の例示的な調整はセクション8に設けられており、結果的に運動図が得られる(例えば図5Bに示すように)。
結晶化のために、タンパク質溶液の液滴はカバースリップの中心に配管され、通常、バッファー(例えば、トリス-HCl、HEPES)と沈殿物(例えば、ポリエチレングリコール、アンモニウム)で構成される結晶化カクテルの液滴と混合される硫酸塩)。共結晶化のための阻害剤溶液の液滴(このプロトコルではシュウ酸塩など)を任意に適用してもよい。カバースリップは、結晶化カクテルを含む貯水池の井戸の上に逆さまに配置され、シーラントオイルの助けを借りて井戸の空気を密封する(図6B)。理想的には、タンパク質が溶液中に残っていることを意味する実験の開始時にドロップ内に沈殿が起こりません。貯留槽内の降水濃度は落下量よりも高いため、貯留槽との平衡に達するまで井戸の大気中に蒸発して水を失い始める。貯水池への水の拡散は、ドロップのゆっくりとした体積減少を引き起こし、その結果、ドロップ中のタンパク質および沈殿物濃度の両方の増加を引き起こす。タンパク質溶液が超飽和の必要な状態に達し、したがってメタ安定性に達すると、自発的な核生成と結晶成長が起こりう可能性があります。過飽和状態に達することは、結晶化のために必要であるが、十分な条件ではない。タンパク質の結晶化は、良好な熱力学的および運動的条件の両方を必要とし、結晶化されるタンパク質の予測不能な特性に大きく依存する22。
変更とトラブルシューティング
大腸菌中のタンパク質の発現は非効率的でありうみがある。IPTG濃度、発現温度、増幅時間(室温など、室温を数時間または一晩冷たい室で一晩)、最適な条件を見つけるために新しいタンパク質ごとにテストする必要がある場合があります。封入体内のタンパク質の沈殿は、より疎水性FAHDタンパク質のために時々観察される。このような場合、昆虫細胞などの他のモデル系におけるタンパク質発現が推奨され、封入体が26を形成する可能性が低い。
FAHDタンパク質は、塩および共因子濃度、ならびにpHに敏感であるため、異なるホモロゲ、オルソロゲ、および点突然変異変異の精製戦略は、個々の設定で異なる場合があります。記載の精製方法は、野生型ヒトおよびマウスFAHD1タンパク質のために開発される。NaClやイミダゾールなどの化学物質の濃度、ならびにpHは、異なる等電点(pI)を有する個々のタンパク質に適応する必要があります。また、すべてのHisタグ付きタンパク質がNi-NTA樹脂によく結合するわけではありません。Ni-NTAカラムへのタンパク質結合が非効率的である場合、NaClおよびイミダゾールの適応濃度、ならびにNi-NTA実行バッファーにおける様々なpH条件は、結果の品質を向上させるのに役立つ可能性がある。そうでない場合は、Ni-NTAステップをスキップし、イオン交換クロマトグラフィーのステップに進むことも、精製戦略の成功につながる可能性があります。タンパク質がNi-NTAカラムに結合するが、カラムから溶出できない場合、一部のmM EDTAを添加すると、Ni2+複合体を破壊するのに役立つ可能性があります。
結晶化のプロセスに関しては、大きくて複雑なタンパク質分子を定期的な周期格子に自己組織化することは、運動パラメータの制御が困難に大きく依存する本質的にありそうもないプロセスであることを理解する必要があります。結晶化に使用されるセットアップの小さな変更でも、結果を劇的に変更することができ、結晶が形成されません。タンパク質の純度は、一般的に最も重要です。経験則として、過負荷の高い SDS-PAGE ゲルは他のバンドを表示しないでください。また、ステップが実行される順序は、結果に影響を与える可能性があります。一例として、再現性を確保するためには、ピペッティング配列を同じに保ち、まずタンパク質を添加し、最後に結晶化液滴に沈殿物を加える必要が生じることが多い(またはその逆)。どちらの方法を使用しても、実験を再現またはスケールアップしようとする場合は、同じままにしておく必要があります。このプロトコルに従って結晶が観察されない場合、化学的沈殿物組成物、pH、ドロップサイズ、およびタンパク質対沈殿物比は、小さな増分で変化させることができる。滴の忍耐と一貫した観察は美徳です。
FAHD1の触媒機構に関する発言
提示された方法は、高品質のFAHD1タンパク質を得るために特別に開発された。これにより、FAHD1結晶の増殖と、阻害剤に複合化されたFAHD1を含む結晶のエンジニアリング(シュウ酸塩、PDB:6FOG)が可能になりました。X線構造は酵素の触媒腔の3D構造を提供する。これらの結果は、この興味深い酵素の触媒機構にとって潜在的に重要な残渣の包括的な記述を確立する。FAHD1は、アシルピルビン酸(アセチルピルビ酸塩、フメリルピルビ酸)11を切断することができると最初に説明した。その後、FAHD1はオキサロ酢酸12のデカルボキシラーゼとしても動作することがわかった。基質アシルピルベートとオキサロ酢酸塩は異なる化学的部分であるが、化学的変換は、一般的な単一C3-C4結合の戦略的切断を機械的に共有し、C3であれば精力的に促進される-C4結合軌道は、C2-カルボニル15のπ軌道に直交したままである。このような立体構造は、切断プロセス中に一過性に形成されたC3-carbanionの共振安定化を可能にする。FAHD1基質(オキサロ酢酸塩およびアシルピルビン酸)は、柔軟な分子であり、C2-水和形態と同様に、原子間質(ケトエノール)に存在し得る(図9A)。異なる種間の平衡は、主に使用される緩衝組成物、pHおよび金属イオンの存在の性質によって決定される。以下では、FAHD1の触媒中心を明らかにしたX線結晶構造の解析から生得られた仮説的な機械的シナリオについて議論する。
図 9:ヒトFAHD1の提案された触媒機構の詳細。
(A)オキサロ酢酸塩は、主にZ-エノール形24において結晶性状態ならびに中性溶液中に存在する。しかしながら、生理学的pH条件下では、2-keto形態が支配的な表現25である。(B)Mg結合オキサロ酢酸塩(左)及びアシルピルベート(右、R1を有機残量として、赤色矢印は隣接する安定水分子の核性攻撃を示す)を有するhFAHD1空洞15の化学スケッチ(議論を参照)。(C)デカルボキシラーゼ(b to c)およびヒドロラーゼ(b'to c)FAHD1のC3-C4切断に対する好ましい適合性の比較:両方のプロセスは、Mg複合体ピルビン酸エノール酸をもたらす(議論を参照)。中間体bとb'は、パネルBにスケッチされているように、Q109によって安定化される見込みです(議論参照)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
FAHD1のデカルボキシラーゼ活性
オキサロ酢酸塩は、主にZ-エノール形24において結晶性状態ならびに中性溶液中に存在する。しかし、生理学的なpH条件(pH7.4の緩衝条件)の下では、2ケト形態がオキサロ酢酸25(図9A)の支配的な表現であり、エノライゼーションは脱カルボキシレーション27の前提条件ではないことが示された。.なお、Mg2+イオンは、7.4以下のpHでオキサロ酢酸種の比率に影響を与える。 ファハド1の触媒中心へのオキサロ酢酸ケト形態の転位(複合酵素中の結合シュウ酸塩によって導かれる(PDB:6FOG 15))結合オキサロ酢酸塩15の立体構造調節剤として残渣Q109を明らかにした。別の記事15で概説したように、Q109のカルバモイル基への水素結合は、C2−C3結合の周りの回転に起因するオキサロ酢酸立体構造を安定させる(図9B、左パネル)。この回転の結果として、C3-C4結合(切断される)は、C2−カルボニル(図9C)のπ軌道に対して直交性質に近い性質を採用する。二酸化炭素を放出することができます。このプロセスの主な製品は、ピルビン酸のMgエノレートを安定化した共振であろう。エノレートが最も安定な複合体28、29を形成することは、オキサロ酢酸-Mg複合体の調査から知られている。MG-ピルビン酸エノール酸錯誤に対して同等の安定性を仮定すると、FAHD1の共因子は遮断され得るが、リジン残存物K123は、補因子15の損失を禁止する平衡中のピルビン酸エノール酸をプロトレートすることができる。
与えられた解釈は、FAHD1の触媒ODx関数における明確な中間体としてピルビン酸エノールを示唆する。仮説モデルのこのステップでは、実験データは、閉じた蓋が製品を解放するために開くべき理由について、それ以上の指標を提供しません。しかし、提案されたメカニズムは、製品による酵素阻害のように見える可能性があります:結晶構造は、残留物H30およびE33によってFAHD1触媒中心に向かって指向性に保持された保存された水分子を明らかにする。短いらせん15は、リガンド結合および蓋閉鎖時に誘発される。一次エノールがエノレートとの平衡状態にとどまる場合、エノール化安定化した共振は、水分子によってピルビン酸に消光させることができる。得られたヒドロキシルは、蓋が開くMg-共因子からピルビン酸を置き換えることができるであろう。最後に、触媒中心はミトコンドリア環境で復元されます。この仮説的なシナリオでは、空洞水分子はそれぞれ酸として動作します。
FAHD1のヒドロラーゼ活性
酵素のヒドロラーゼ活性は、暗黙的にヒドロキシルヌクレオフィルの中間形成を必要とする。このメカニズムは、通常、酸塩基触媒活性との組み合わせで見出される。反応の遷移状態は、空洞内の臨界アミノ酸側鎖による立体構造制御を介して調製されなければならない。デカルボキシラーゼ機能の議論と同様に、4-カルボニル酸素をQ109に水素結合させることにより、2ケト形態の酵素結合アシルピルベートを立体制御下に置く(図9B、右パネル)。シュウ酸結合FAHD1(PDB:6FOG)の結晶構造は、短いらせん15で提示された残管H30およびE33によってFAHD1触媒中心に向かって向きに保持される保存水分子を明らかにする。E33-H30 dyadは指向性位置水を脱方式化する能力があり、得られたヒドロキシルはQ10915によって立体構造制御下で提示されたアシルピル酸の4-カルボニルを攻撃するのに理想的な性質にある。
注目すべきは、FAH18についても同様のメカニズムが提案されている。ヒドロキシル核球による攻撃は、軌道制御C3-C4結合切断時に安定化するオキシアニオン種をもたらすと予想される(図9C)。このモデルでは、C3-C4結合回転(図9C)は、図9Bに示す形成されたヒドロキシルによる核性攻撃の後に起こる(すなわち、結合切断のためのアシルピル酸を調製する)。主な製品は酢酸とMg-ピルビン酸エノール酸であろう。この仮定のシナリオでは、酢酸は、ピルビン酸にエノールをクエンチングし、その後、製品の変位を支援することができます。7.5のpHの上およびMgイオンの存在下で、ケト型とエノール型との間の平衡中にアシルピルビン酸が存在し、後者はわずかに好み30である。ほとんどの場合、両方の形態は、その後の蓋閉鎖下でFAHD1の共因子に結合することができる。酵素によるエノールアシルピルベート基板の処理は、エノール形態の平坦な構造のために妨げられる。C3-C4切断は共振安定化なしでビニルカルバニを生じるであろう。
そこで、アシルカルボニル上のヒドロキシル核不球の攻撃に備える触媒ケトン化工程を提案する。しかし、このケトン化プロセスでは、FAHD1残基による陽子転移の制御が必要となり、これはFAHD1に固有のイソメラーゼ活性を帰属させる。Mg結合エノール水素の酸性度は、非複合体型28と比較して1万倍の増加を明らかにすることが報告されている。Mg結合エノール形の脱プロトネーションは、非プロトン化されたK123によって実現可能であろう。K123の脱プロトネーションは、D102のカルボキシレートによって補助されてもよい。残留物D102-K47-K123によって形成された水素結合ネットワークは、FAHD115の触媒中心で必要な陽子リレーとして作動することができる。このような形成された中間エノレートは、基板15のケトン化下でE33-H30-H2 0トライアドによってクエンチすることができる。2ケト型はQ109の立体構造制御下に来て、同時に形成されたヒドロキシルはアシルカルボニルを攻撃する。要約された議論は、空洞形成残基の相互作用を介して酸と塩基を切り替える水分子に関するFAHD1の制御を意味する。
今後の応用方法または方法の方向性
ここで説明する方法の将来のアプリケーションは多数あります。FAHスーパーファミリーの原核生物のメンバーの多くは、まだ機能的な特徴付けを待っています。既知のFAHスーパーファミリーメンバーの触媒活動に関する利用可能な情報さえ乏しく、ほとんどの場合、実験データではなく理論的な仮定に基づいています。原核生物FAHスーパーファミリーメンバーのためにここに記載されている方法の適用は、細菌学における特定の研究の利益に依存する。一方、真核生物FAHスーパーファミリーメンバーが様々な細胞コンパートメント(例えば、サイトゾル対ミトコンドリア)で重要な役割を果たしているという最近のデモンストレーションは、これらのタンパク質をより良く特徴付ける必要性を強調しています(そのうちの3つは、特に、現在のデータは、ミトコンドリア生物学、老化研究、がん研究の文脈で異なる機能を果たすことを示唆しているためです。これらの真核生物FAHスーパーファミリーメンバーの完全な分子的および生理学的特徴付けは、生物医学分野における現代研究の主要分野に関する重要な洞察を提供する可能性があることが提案される。FAHD1(および関連酵素)のメカニズムに関するより多くの研究は、FAHD1の二機能性の基礎となるメカニズムをよりよく理解する必要がありますが、まだ完全には明らかになっていません。FAHD1変異体、NMR調査、阻害剤複合体に関する構造研究を用いたさらなる研究は、FAHD1が有能であると思われる真の機械的シナリオの解決に役立つ可能性がある。さらに、Mg-共因子に結合することができるエノール模倣のコンピュータ支援設計は、最終的にFAHD1の強力な阻害剤につながります。
Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を開示し、宣言するものは何もありません。H. G. は分子クラフト.HuGs e.U.のCEOCSOであり、カスタム合成を介してこの研究のためにアシルピルビン酸剤を提供しました。P.J.D.の研究室での作業は、オーストリア科学基金(FWF):プロジェクト番号P 31582-B26によって支援されました。この原稿の出版料は、プロジェクト番号P 31582-B26の下でオーストリア科学基金(FWF)によって部分的にカバーされています。A. N. と B. R. プロジェクト P28395-B26 の下でオーストリア科学基金 (FWF) によってサポートされています。
Acknowledgments
著者は、アナベラ・ピットルによる専門家の技術支援とヘイモ・ピルチャーによるパイロット方法開発に非常に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BL21(DE3) pLysS competent E. coli | Promega | L1195 | High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site |
| pET E. coli T7 Expression Vectors | MERCK | - | http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav |
| 0.45 µm filter units | MERCK | SLHP033NS | Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril |
| 0.22 µm filter units | MERCK | SLGP033RS | Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril |
| Eppendof tubes 1.5 mL | VWR | 525-1042 | microcentrifugal tubes; autoclaved |
| 15 mL Falcon | VWR | 734-0451 | centrifugal tubes |
| 50 mL Falcon | VWR | 734-0448 | centrifugal tubes |
| PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro | VWR | 30622-758 | VIS transparent cuvettes |
| UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro | VWR | 47727-024 | UV/VIS transparent cuvettes |
| isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | ROTH | 2316 | chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system |
| imidazole | ROTH | X998 | chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin |
| Glass Econo-Column Columns | Bio-Rad | - | http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&pcp_loc=catprod |
| chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | antibiotic for bacterial growth selection; resistance endióded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 µg/mL final concentration |
| kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 µg/mL final concentration |
| ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 µg/mL final concentration |
| Ultra-15, MWCO 10 kDa | Sigma-Aldrich | Z706345 | centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de®ion=AT |
| Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units | Sigma-Aldrich | Z677108 | centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de®ion=AT&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2 |
| oxaloacetic acid | Sigma-Aldrich | O4126 | TCA metabolite |
| sodium oxlalate | Sigma-Aldrich | 71800 | a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes |
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma-Aldrich | D9277 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable |
| Ni-NTA agarose | Thermo-Fischer | R90101 | a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence |
| 96-Well UV Microplate | Thermo-Fischer | 8404 | UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates |
| PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | Thermo-Fischer | 26616 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616 |
| ÄKTA FPLC system | GE Healthcare Life Sciences | - | using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system |
| HiTrap Phenyl HP column | GE Healthcare Life Sciences | - | https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630 |
| Mono S 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences | - | https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723 |
| Mono Q 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences | - | https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608 |
| HiLoad Superdex column 75 pg (G75) | GE Healthcare Life Sciences | - | https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800 |
| HiLoad Superdex column 200 pg (G200) | GE Healthcare Life Sciences | - | https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283 |
| TECAN microplate reader | TECAN Life Sciences | - | https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers |
| acetylpyruvate | MoleculeCrafting.HuGs e.U. | - | custom synthesis |
| benzoylpyruvate | MoleculeCrafting.HuGs e.U. | - | custom synthesis |
| VDX™ plate (24 wells) | Hampton | HR3-142 | 24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion |
| paraffin oil | Hampton | HR3-411 | used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion |
| coverslips (22 mm) | Karl Hecht KG | 14043 | coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion |
| Luria broth (LB) medium | self-prepared | - | a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar |
| NZCYM medium | self-prepared | - | a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4 |
| Luria broth (LB) agarose plates | self-prepared | - | autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ |
| Ni-NTA running buffer | self-prepared | - | 20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins |
| Ni-NTA elution buffer | self-prepared | - | 20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins |
| HIC running buffer | self-prepared | - | 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7 |
| HIC running buffer AS | self-prepared | - | HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0 |
| Mono S low salt buffer | self-prepared | - | 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins |
| Mono S high salt buffer | self-prepared | - | 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins |
| Mono Q low salt buffer | self-prepared | - | 20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0 |
| Mono Q high salt buffer | self-prepared | - | 20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0 |
| G75 / G200 running buffer | self-prepared | - | 15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4 |
| enzyme assay buffer | self-prepared | - | 50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2 |
| protein crystallization buffer | self-prepared | - | G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT |
| reservoir solution for crystallization | self-prepared | - | 100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2 |
References
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