Uttrykk og rensing av fumarylacetoacetate Hydrolase som inneholder proteiner er beskrevet med eksempler (uttrykk i E. coli, FPLC). Renset proteiner brukes for krystallisering og antistoff produksjon og ansatt for enzym analyser. Utvalgte fotometriske analyser presenteres for å vise multi-funksjonaliteten til FAHD1 som oxaloacetate decarboksilaza og acylpyruvate Hydrolase.
Fumarylacetoacetate Hydrolase (FAH) domene inneholder proteiner (FAHD) er identifisert medlemmer av FAH overfamilie i Landplantenes. Enzymer i denne overfamilie generelt vise multi-funksjonalitet, involverer hovedsakelig Hydrolase og decarboksilaza mekanismer. Denne artikkelen presenterer en rekke påfølgende metoder for uttrykk og rensing av FAHD proteiner, hovedsakelig FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues blant arter (menneskelig, mus, nematoder, planter, etc.). Dekkede metoder er protein uttrykk i E. coli, affinitet kromatografi, ion Exchange kromatografi, preparativ og analytisk gel filtrering, krystallisering, X-ray Diffraksjon, og fotometriske analyser. Konsentrert protein av høy grad av renhet (> 98%) kan være ansatt for krystallisering eller antistoff produksjon. Proteiner av tilsvarende eller lavere kvalitet kan anvendes i enzym analyser eller brukes som antigener i deteksjons systemer (Western-Blot, ELISA). I diskusjonen om dette arbeidet, er de identifiserte enzymatisk mekanismer for FAHD1 skissert for å beskrive sin Hydrolase og decarboksilaza bi-funksjonalitet i mer detalj.
Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah)1,2 overfamilie av enzymer beskriver en gruppe enzymer som deler den svært bevarte katalysator Fah domene3,4,5,6 , 7 andre er , 8 på alle , 9 andre priser , 10. til tross for deres felles katalysator sentrum, disse enzymene er multi-funksjonell, og de fleste er funnet i prokaryoter, hvor de brukes til å bryte ned forbindelser Hentet fra komplekse karbon kilder3. Bare tre medlemmer av denne familien ble identifisert i Landplantenes så langt: navnet gir Fah2, så vel som Fah domene-inneholdende protein 1 (FAHD1)11,12,13,14 ,15 og Fah domene-inneholdende PROTEIN 2 (FAHD2). Forringelse av FAHD1 har blitt assosiert med nedsatt mitokondrie åndedrett13,16 og assosiert med en reversibel type mobil senescence fenotype14 som er knyttet til mellomliggende potensial mangler i elektron transportsystemet. Human FAHD1 og dens orthologues i modellsystemer (mus, nematode, kreftcelle linjer, planter, etc.), samt utvalgte punkt mutasjon varianter, har blitt druggable mål av potensiell interesse. For denne forskningen er rekombinant protein på høye nivåer av renhet, samt informasjon om katalysatorer styrt av krystallstrukturer og selektive antistoffer avgjørende.
Dette manuskriptet beskriver metoder for FAHD protein uttrykk i E. coli, affinitet kromatografi, ion Exchange kromatografi, ammonium sulfat nedbør, preparativ og analytisk gel filtrering, krystallisering, X-ray Diffraksjon, og fotometriske analyser. Formålet med metoder og protokoller er beskrevet her er å gi veiledning for forskere som arbeider i ulike felt som bakteriologi, plante biologi, samt dyre-og menneskelige studier, å karakterisere medlemmer av FAH overfamilie, inkludert uncharacterized overfamilie medlemmer skulle de bli relevante i et bestemt felt. Protokollene beskrevet her kan gi verdifull støtte til prosjekter som tar sikte på å karakterisere andre prokaryote eller eukaryote FAH overfamilie medlemmer.
Begrunnelsen bak metodene som er beskrevet her er det faktum at for karakterisering av dårlig beskrevet proteiner (spesielt, metabolske enzymer av ukjent fysiologisk relevans), tilnærmingen til å starte med renset rekombinant proteiner gjør utvikling av uvurderlig, høy kvalitet forskningsverktøy som in vitro aktive enzym preparater, høy kvalitet antistoffer, og potente og spesifikke farmakologiske hemmere for utvalgte enzymer. De beskrevne metodene krever raske protein flytende kromatografi (FPLC) og røntgen crystallography. Alternative metoder (f. eks, for å uttrykke protein uten kjemisk induksjon, eller for å vise protein rensing av sentrifugering etter varmebehandling etterfulgt av avsaltingsspisser overlegne sammenlignet og størrelses eksklusjon kromatografi), kan finnes andre steder17. Mens et bredere spekter av metoder er tilgjengelig for uttrykk og rensing av Fah overfamilie enzymer2,7,9,17,18, fokuserer dette arbeidet på uttrykket og spesielt rensing av FAHD proteiner.
I diskusjons delen av dette manuskriptet er katalysatoren som identifiseres for FAHD1-proteinet (Hydrolase, decarboksilaza)15 , nærmere beskrevet, for å demonstrere den kjemiske karakteren til de katalysert reaksjonene. Dataene innhentet basert på tidligere arbeid7,15,18 (pdb: 6FOG, pdb: 6FOH) innebærer en tredje aktivitet av enzymet som keto-ENOL isomerase.
Kritiske trinn
FAHD proteiner er svært følsomme for salt konsentrasjoner. Ved lave NaCl konsentrasjoner, kan proteinene utløse ved tine, men de kan vanligvis være fullt rekonstituert ved høyere salt konsentrasjoner. Det vil si at hvis et FAHD protein precipitates av en eller annen grunn, kan det utvinnes eller ombrettes med høyere salt konsentrasjoner (> 300 μM). Noen mer hydrofobe proteiner, men kan ikke gjenopprettes (for eksempel humant FAHD2), men vaskemidler som gutter (maks 1%) eller glyserol (10%) kan brukes til å holde dem i stabil løsning. I alle fall anbefales sjokk frysing med flytende nitrogen og lagring ved-80 ° c, da det er en skånsom og langsom prosess med tine.
Noen uventede problemer kan oppstå under ni-NTA rensing i trinn 3.1.10. Av notatet, en høyere OD i den andre samlet prøven enn i den første prøven indikerer et for høyt volum av agarose harpiks (ta et notat og bruke mindre harpiks i neste eksperiment). Også, den agarose harpiks selv fører til en OD signal på 280 NM (dvs. avbrudd av agarose harpiks seng vil gi kunstige signaler). I tilfelle tvil, er det anbefalt å bruke andre metoder som en Bradford eller BSA-analysen for å bestemme protein konsentrasjoner.
I enzymatisk analyser, er det tre kritiske aspekter som skal vurderes. Først vurdere proteinkonsentrasjon er avgjørende for å få de riktige spesifikke aktiviteter. Nivået av renhet av proteinet er å påvirke resultatet og må anslås. I tilfelle av Tagged protein, massen av tag-delen må beregnes, og den spesifikke aktiviteten må være tilsvarende korrigert. For enkle analyser beskrevet i punkt 7 i protokollen, er ni-NTA renhet tilstrekkelig til å skille mellom aktive og inaktive underlag, kofaktorer, etc. I tilfelle av mer komplekse Michaelis-Menten Kinetics, må alle reaktant og substrat konsentrasjoner fastsettes riktig. Spesielt når du bruker oxaloacetate (som automatisk decarboxylates over tid) enzymatisk del av reaksjonen må rettes for Auto-dekarboksylering (under forutsetning av at begge reaksjonene oppstår samtidig). Initial endringer i den optiske tettheten signal adressert til keto-ENOL tautomeri av underlaget må vurderes. For det tredje må konsentrasjonen og volumene justeres. En reaksjon med definerte konsentrasjoner av enzym og substrat kan gi ulike resultater avhengig av analysen volum. Hvis det er for mye enzym per brønn, kan vedheft av væsken faktisk bias resultatet.
For å vurdere Michaelis-Menten Kinetics anbefales det å utføre innledende eksperimenter i 100 μL, 200 μL og 300 μL-batcher for å finne den optimale kombinasjonen. Lignende aspekter gjelder forholdet mellom enzym-substrat konsentrasjoner for kinetisk analyser. For mye enzym per substrat eller for mye substrat per enzym sette systemet utenfor den lineære steady-state Michaelis rekkevidde. Første eksperimenter er nødvendig for å optimalisere disse forholdene. Eksemplarisk justering for humant FAHD1 (vill-type) protein er gitt i punkt 8, noe som resulterer i kinetisk diagrammer (som presentert i figur 5B, for eksempel).
For krystallisering en dråpe protein løsning er Pipet tert i sentrum av en dekkglass og blandet med en dråpe av krystallisering cocktail, som vanligvis består av en buffer (f. eks, Tris-HCl, HEPES) og en overilet (f. eks, polyetylen glykol, ammonium sulfat). En dråpe av hemmer løsning for co-krystallisering (for eksempel oksalat i denne protokollen) kan eventuelt brukes. Dekkglass blir deretter plassert opp-ned over en brønn av reservoar som inneholder krystallisering cocktail, tetting av brønnen luften tett ved hjelp av tetningsmasse olje (figur 6b). Ideelt sett skjer det ingen nedbør i løpet av begynnelsen av eksperimentet, noe som betyr at proteinet forblir i løsningen. Siden overilet konsentrasjon i reservoaret er høyere enn i drop, begynner drop å miste vann ved fordampning i atmosfæren av brønnen til likevekt med reservoaret er nådd. Spredningen av vann inn i reservoaret fører til en langsom volumreduksjon av dråpe som igjen fører til en økning av både, protein og overilet konsentrasjon i drop. Hvis protein løsningen når ønsket tilstand av super-metning og dermed meta-stabilitet, spontan kjernedannelse etterfulgt av krystallvekst kan forekomme. Å nå overmettet tilstand er en nødvendig, men ikke tilstrekkelig forutsetning for krystallisering. Krystallisering av proteiner trenger begge, gunstige termodynamisk og kinetisk forhold, og avhenger sterkt av de uforutsigbare egenskapene til proteinet som skal krystallisert22.
Modifikasjoner og feilsøking
Uttrykk for protein i E. coli kan være ineffektiv. Varierende IPTH-konsentrasjoner, uttrykks temperatur og forsterknings tid, for eksempel romtemperatur i flere timer eller i kaldt rom over natten, må kanskje testes for hvert nye protein for å finne optimale forhold. Nedbør av protein i inkludering organer er noen ganger observert for mer hydrofobe FAHD proteiner. I slike tilfeller, protein uttrykk i andre modellsystemer som insekt celler anbefales, som inkludering organer er mindre sannsynlighet for å danne26.
Som FAHD proteiner er følsomme for salt og kofaktor konsentrasjoner, samt pH, rensing strategier for ulike homologe, orthologues, og punkt mutasjon varianter kan variere i individuelle innstillinger. Den rensing metoder beskrevet er utviklet for vill-type menneske og mus FAHD1 protein. Konsentrasjoner av kjemikalier, slik som NaCl og imidazole, samt pH, må tilpasses for individuelle proteiner med et annet isoelectric punkt (pI). Også av notatet, ikke alle hans-Tagged protein kan binde godt til en ni-nTa harpiks. Hvis proteinbinding til ni-NTA kolonnen er ineffektiv, tilpassede konsentrasjoner av NaCl og imidazole, samt varierende pH-forhold i ni-NTA kjører buffer kan bidra til å forbedre kvaliteten på utfallet. Hvis ikke, hoppe over ni-NTA trinn og fortsetter til trinn av ioniske utveksling kromatografi kan også føre til en vellykket rensing strategi. Hvis et protein binder seg til ni-NTA kolonnen, men kan ikke eluert fra kolonnen, tillegg av noen mM EDTA kan bidra til å forstyrre ni2 + kompleks.
Når det gjelder prosessen med krystallisering, må det forstås at selv-organisering av store og komplekse protein molekyler i en vanlig periodisk gitter er en iboende usannsynlig prosess som avhenger tungt på vanskelig å kontrollere kinetisk parametre. Selv små endringer i oppsettet brukes for krystallisering kan dramatisk endre resultatet og ingen krystaller vil danne. Protein renhet er generelt av største betydning. Som en tommelfingerregel, en tungt overbelastet SDS-side gel bør ikke vise andre band. I tillegg kan rekkefølgen som trinnene utføres i, påvirke utfallet. Som et eksempel, for å sikre reproduserbarhet, er det ofte nødvendig å holde pipettering sekvensen det samme, så først legge til protein, og til slutt legge overilet til krystallisering dråpe (eller vice versa). Uansett hvilken metode som brukes, bør det holdes det samme når du prøver å reprodusere eller skalere opp eksperimenter. Hvis ingen krystaller observeres etter denne protokollen, kan den kjemiske overilet sammensetning, pH, dråpestørrelse og protein-til-utfelling ratio varieres i små trinn. Tålmodighet og konsekvente observasjoner av dråpene er av dyd.
Bemerkninger til katalysatorer av FAHD1
De presenterte metodene er utviklet spesielt for å oppnå FAHD1 proteiner av høy kvalitet. Denne aktiverte veksten av FAHD1 krystaller samt prosjektering av krystaller som inneholder FAHD1 complexed til en hemmer (oksalat, PDB: 6FOG). The X-ray strukturer gir en 3D-arkitektur av enzymet ‘ s katalysator. Disse resultatene etablere en omfattende beskrivelse av rester potensielt viktig for katalysatoren av dette spennende enzymet. FAHD1 ble først beskrevet for å kunne holde acylpyruvates (acetylpyruvate, fumarylpyruvate)11. Senere ble det funnet at FAHD1 opererer også som en decarboksilaza av oxaloacetate12. Selv om underlaget acylpyruvate og oxaloacetate er forskjellige kjemiske andeler, den kjemiske transformasjoner dele mechanistically den strategiske kløften av en felles singel C3-C4 Bond, energisk tilrettelagt hvis C3 -C4 Bond orbitale bo ortogonale til π-orbitale i C2-karbonyl15. En slik konformasjon tillater resonans stabilisering av C3-carbanion midlertidig dannet under kløften prosessen. Den FAHD1 underlag (oxaloacetate og acylpyruvates) er fleksible molekyler og kan eksistere i tautomeric (keto-ENOL) samt C2-hydrert skjemaer (figur 9a). Equilibria mellom de ulike artene bestemmes hovedsakelig av arten av buffer sammensetning som brukes, pH og tilstedeværelsen av metall ioner. I det følgende diskuterer vi hypothetic mekanistisk scenarier inspirert av analyse av X-ray krystallstrukturer som avslørte katalysatoren sentrum av FAHD1.
Figur 9 : Detaljer om den foreslåtte katalysatoren for menneskelig FAHD1.
(A) Oxaloacetate finnes i krystallinsk tilstand så vel som i nøytral løsning hovedsakelig i Z-ENOL skjema24. Men under Fysiologiske pH-forhold på 2-keto skjemaet er den dominerende representasjon25. (B) kjemisk skisse av hFAHD1 hulrom15 med mg-Bound oxaloacetate (venstre) og acylpyruvate (høyre, med R1 som økologisk hvile, den røde pilen betegner et nukleofil angrep av tilstøtende stabilisert vann molekyl) (se diskusjon). (C) sammenligning av favoriserte konformasjonen for C3-C4 kløft i decarboksilaza (b til C) og Hydrolase (b ‘ til c) mekanisme FAHD1: begge prosessene resultere i mg-complexed pyruvat-enolate (se diskusjon). Mellom produkter b og b forventes å bli stabilisert av Q109, som skissert i panel B (se diskusjon). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Den Decarboksilaza aktivitet av FAHD1
Oxaloacetate finnes i krystallinsk tilstand så vel som i nøytral løsning hovedsakelig i Z-ENOL skjema24. Men det ble vist at under Fysiologiske pH-forhold (buffer forholdene ved pH 7,4) den 2-keto form er den dominerende representasjon av oxaloacetate25 (figur 9a), og at enolization er ikke en forutsetning for dekarboksylering27 . Av notatet, mg2 + ioner har ingen innflytelse på forholdet mellom de oxaloacetate artene ved en pH på 7,4 eller under28. Transponering av oxaloacetate keto form i katalysatoren sentrum av FAHD1 (guidet av den bundne oksalat i complexed enzymet (PDB: 6FOG15)) avdekket rester Q109 som en conformational regulator av bundet oxaloacetate15. Som beskrevet i en annen artikkel15, er hydrogen binding til Carbamoyl gruppe Q109 stabiliserer en oxaloacetate-konformasjon som følge av rotasjon rundt C2-C3 Bond (figur 9B, venstre panel). Som en konsekvens av denne rotasjonen, C3-c4 Bond (skal kløyvde) vedtar en nær ortogonale disposisjon i forhold til π-orbitale av C2-karbonyl (figur 9C). Karbondioksid kan frigis. Det primære produktet av denne prosessen vil være resonans stabilisert mg-enolate av pyruvat. Det er kjent fra undersøkelser av oxaloacetate-mg komplekser at enolate danner den mest stabile kompleks28,29. Forutsatt en sammenlignbar stabilitet for en mg-pyruvat enolate-kompleks kofaktor av FAHD1 kan bli blokkert, men lysin rester K123 kan protonere pyruvat-enolate i en likevekt for å forby tap av kofaktor15.
Den gitte tolkningen antyder pyruvat ENOL som en distinkt mellomliggende i katalysatoren-funksjonen til FAHD1. På dette trinnet i hypotetisk gjennomsnitt modellen, gir eksperimentelle data ikke noen ytterligere indikasjon på hvorfor det lukkede lokket skal åpne for å løsne produktet. Det kan utledes imidlertid at den foreslåtte mekanismen ser ut som et enzym hemming av produktet: krystallstrukturen avslører en bevart vann molekyl holdt i retningsbestemt orientering mot FAHD1 katalysatorer sentrum av rester H30 og E33 presentert i en kort Helix15, som er indusert ved ligand binding og lokk lukking. Hvis den primære ENOL ville bo i en likevekt med enolate, kan resonans stabilisert enolate være slukket å pyruvat av vann molekylet. Den resulterende hydroksyl ville være i stand til å fortrenge pyruvat fra mg-kofaktor hvorpå lokket ville åpne. Til slutt vil katalysatoren bli restaurert i mitokondrie miljø. I denne hypothetic scenario, ville hulrom vann molekylet operere som en syre, henholdsvis.
Hydrolase aktivitet av FAHD1
Hydrolase aktivitet av et enzym implisitt krever den mellomliggende dannelsen av en hydroksyl nukleofilen. Denne mekanismen er vanligvis funnet i kombinasjon med syre-base katalysator aktivitet. Overgangs staten reaksjonen må være forberedt via conformational kontroll av kritiske aminosyre side kjeder i hulrommet. I analogi til drøfting av decarboksilaza funksjon, enzym-bundet acylpyruvate i 2-keto form vil bli satt under conformational kontroll av hydrogen-binding av 4-karbonyl oksygen til Q109 (figur 9B, høyre panel). Krystallstrukturen av oksalat-bundet FAHD1 (PDB: 6FOG) avslører en bevart vann molekyl holdt i retningsbestemt orientering mot FAHD1 katalysator sentrum av rester H30 og E33 presentert i en kort Helix15. Den E33-H30 Dyad er kompetent til å deprotonate retningsbestemt posisjonert vann og den resulterende hydroksyl er i ideell disposisjon for å angripe 4-karbonyl av acylpyruvate presentert under conformational kontroll av Q10915.
Av notatet, en lignende mekanisme har blitt foreslått for FAH18. Angrep av hydroksyl nukleofilen forventes å resultere i en oxyanion Art, som er stabilisert på orbital kontrollerte C3-C4 Bond kløft (figur 9C). I denne modellen, C3-c4 Bond rotasjon (figur 9C) skjer etter nukleofil angrepet av dannet hydroksyl indikert i figur 9B (dvs. forbereder acylpyruvate for obligasjons kløften). De primære produktene vil være eddiksyre og mg-pyruvat enolate. I dette hypothetic scenariet kan eddiksyre slukke ENOL til pyruvat og deretter bistå forskyvning av produktet. Over en pH på 7,5 og i nærvær av mg ioner, acylpyruvates finnes i en likevekt mellom keto-og ENOL-former, sistnevnte i liten preferanse30. Mest sannsynlig begge formene er i stand til å binde til kofaktor av FAHD1 under påfølgende lokk lukking. Behandling av enolic acylpyruvate underlag av enzymet er hemmet på grunn av den flate strukturen av ENOL-formen. C3-c4 kløft vil resultere i en vinyliske carbanion uten resonans stabilisering.
Derfor foreslår vi en katalysator ketonization skritt for å forberede for angrep av hydroksyl nukleofilen på acyl karbonyl. Denne prosessen av ketonization, men ville kreve kontroll over Proton transpositions av FAHD1 rester, som ville attributt en iboende isomerase aktivitet til FAHD1. Det er rapportert at Surhet av mg-bundet ENOL hydrogen avslører en 10000-fold økning i forhold til un-complexed form28. En deprotonering av mg bundet ENOL-form vil være gjennomførbart ved un-protonerte K123. Deprotonering av K123 kan bli assistert av carboxylat av D102. Et hydrogen bånd nettverk dannet av rester D102-K47-K123 kunne operere som den nødvendige Proton relé i katalysatoren sentrum av FAHD115. En slik dannet mellomliggende enolate kan da bli slukket av en E33-H30-H20 triaden under ketonization av underlaget15. Den 2-keto form ville komme under conformational kontroll av Q109, og samtidig dannet hydroksyl ville angripe acyl karbonyl. Sammendraget diskusjonen innebærer en kontroll av FAHD1 om et vann molekyl for å bytte mellom syre og base gjennom samspillet mellom hulrom-forming rester.
Future søknader eller retninger av metoden
Fremtidige anvendelser av metodene som er beskrevet her er mange. En overflod av prokaryote medlemmer av FAH overfamilie fremdeles venter funksjonell karakterisering. Selv tilgjengelig informasjon om katalysatorer av kjente FAH overfamilie medlemmer er knappe, og i de fleste tilfeller, basert på teoretiske forutsetninger snarere enn eksperimentelle data. Anvendelse av metodene som er beskrevet her for prokaryote FAH overfamilie medlemmer avhenger av spesifikke forskningsinteresser i bakteriologi. På den annen side, den siste demonstrasjonen som eukaryote FAH overfamilie medlemmer spille viktige roller i ulike cellulære rom (f. eks stoffer g. mitokondrier) fremhever behovet for å bedre karakterisere disse proteinene (tre av dem har vært identifisert så langt), spesielt fordi dagens data tyder på at noen uncharacterized proteiner kan utføre ulike funksjoner i sammenheng med mitokondrie biologi, aldring forskning, og kreftforskning. Det er foreslått at full molekylær og fysiologisk karakterisering av disse eukaryote FAH overfamilie medlemmer kan gi viktig innsikt i viktige felt av moderne forskning i biomedisinsk sektor. Mer forskning på mekanismer for FAHD1 (og beslektede enzymer) er nødvendig for å bedre forstå mekanismer underliggende bi-funksjonaliteten til FAHD1, som fortsatt ikke er fullt avklart. Ytterligere studier med FAHD1 mutanter, NMR-undersøkelser, og strukturelle studier på inhibitor komplekser kan bidra til å løse de sanne mekanistisk scenarier som FAHD1 synes å være kompetent. Videre, dataassistert design av ENOL etterligner stand til å binde til mg-kofaktor vil til slutt føre til potente hemmere av FAHD1.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er svært takknemlig for ekspert teknisk assistanse av Annabella Pittl og pilot metoden utvikling av Haymo Pircher.
BL21(DE3) pLysS competent E. coli | Promega | L1195 | High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site |
pET E. coli T7 Expression Vectors | MERCK | – | http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav |
0.45 µm filter units | MERCK | SLHP033NS | Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril |
0.22 µm filter units | MERCK | SLGP033RS | Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril |
Eppendof tubes 1.5 mL | VWR | 525-1042 | microcentrifugal tubes; autoclaved |
15 mL Falcon | VWR | 734-0451 | centrifugal tubes |
50 mL Falcon | VWR | 734-0448 | centrifugal tubes |
PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro | VWR | 30622-758 | VIS transparent cuvettes |
UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro | VWR | 47727-024 | UV/VIS transparent cuvettes |
isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | ROTH | 2316 | chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system |
imidazole | ROTH | X998 | chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin |
Glass Econo-Column Columns | Bio-Rad | – | http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&pcp_loc=catprod |
chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | antibiotic for bacterial growth selection; resistance endióded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 µg/mL final concentration |
kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 µg/mL final concentration |
ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 µg/mL final concentration |
Ultra-15, MWCO 10 kDa | Sigma-Aldrich | Z706345 | centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de®ion=AT |
Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units | Sigma-Aldrich | Z677108 | centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de®ion=AT&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2 |
oxaloacetic acid | Sigma-Aldrich | O4126 | TCA metabolite |
sodium oxlalate | Sigma-Aldrich | 71800 | a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes |
Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma-Aldrich | D9277 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable |
Ni-NTA agarose | Thermo-Fischer | R90101 | a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence |
96-Well UV Microplate | Thermo-Fischer | 8404 | UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates |
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | Thermo-Fischer | 26616 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616 |
ÄKTA FPLC system | GE Healthcare Life Sciences | – | using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system |
HiTrap Phenyl HP column | GE Healthcare Life Sciences | – | https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630 |
Mono S 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences | – | https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723 |
Mono Q 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences | – | https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608 |
HiLoad Superdex column 75 pg (G75) | GE Healthcare Life Sciences | – | https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800 |
HiLoad Superdex column 200 pg (G200) | GE Healthcare Life Sciences | – | https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283 |
TECAN microplate reader | TECAN Life Sciences | – | https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers |
acetylpyruvate | MoleculeCrafting.HuGs e.U. | – | custom synthesis |
benzoylpyruvate | MoleculeCrafting.HuGs e.U. | – | custom synthesis |
VDX™ plate (24 wells) | Hampton | HR3-142 | 24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion |
paraffin oil | Hampton | HR3-411 | used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion |
coverslips (22 mm) | Karl Hecht KG | 14043 | coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion |
Luria broth (LB) medium | self-prepared | – | a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar |
NZCYM medium | self-prepared | – | a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4 |
Luria broth (LB) agarose plates | self-prepared | – | autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ |
Ni-NTA running buffer | self-prepared | – | 20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins |
Ni-NTA elution buffer | self-prepared | – | 20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins |
HIC running buffer | self-prepared | – | 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7 |
HIC running buffer AS | self-prepared | – | HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0 |
Mono S low salt buffer | self-prepared | – | 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins |
Mono S high salt buffer | self-prepared | – | 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins |
Mono Q low salt buffer | self-prepared | – | 20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0 |
Mono Q high salt buffer | self-prepared | – | 20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0 |
G75 / G200 running buffer | self-prepared | – | 15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4 |
enzyme assay buffer | self-prepared | – | 50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2 |
protein crystallization buffer | self-prepared | – | G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT |
reservoir solution for crystallization | self-prepared | – | 100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2 |