Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Uttryck, rening, kristallisering, och enzym analyser av Fumarylacetoacetat Hydrolase Domain-innehållande proteiner

Published: June 20, 2019 doi: 10.3791/59729
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 1, 3, 3, 4, 1,2
1Research Institute for Biomedical Aging Research, University of Innsbruck Austria, 2Center for Molecular Biosciences Innsbruck (CMBI), University of Innsbruck Austria, 3Division of Genetic Epidemiology, Medical University of Innsbruck Austria, 4Faculty of Chemistry, Department of Organic Chemistry, University of Vienna Austria

Summary

Uttryck och rening av fumarylacetoacetat hydrolas domän-innehåll ande proteiner beskrivs med exempel (uttryck i E. coli, FPLC). Renade proteiner används för kristallisation och anti kropp produktion och användas för enzym analyser. Utvalda Foto metriska analyser presenteras för att Visa multifunktionaliteten hos FAHD1 som oxaloacetat dekarboxylas och acylpyruvate hydrolase.

Abstract

Fumarylacetoacetat hydrolas (Fah) domän-innehållande proteiner (Fahd) är identifierade medlemmar i Fah superfamiljen i eukaryotes. Enzymer i denna superfamilj visar i allmänhet multi-funktionalitet, som huvudsakligen involverar hydrolas och dekarboxylas mekanismer. Denna artikel presenterar en serie av på varandra följande metoder för uttryck och rening av FAHD proteiner, främst FAHD protein 1 (FAHD1) ortologer bland arter (människa, mus, nematoder, växter, etc.). Omfattade metoder är protein uttryck i E. coli, affiniskromatografi, jonbyteskromatografi, preparativ och analytisk gel filtrering, kristallisation, röntgen diffraktion och foto metriska analyser. Koncentrerat protein med hög renhets grad (> 98%) kan användas för kristallisation eller anti kropps produktion. Proteiner av liknande eller lägre kvalitet kan användas i enzym analyser eller användas som antigener i detektions system (Western-blot, ELISA). I diskussionen av detta arbete, de identifierade enzymatiska mekanismerna i FAHD1 beskrivs för att beskriva dess hydrolas och dekarboxylas bi-funktionalitet mer i detalj.

Introduction

Den fumarylacetoacetat hydrolas (Fah)1,2 superfamiljen av enzymer beskriver en grupp av enzymer som delar den mycket bevarade katalytiska Fah domän3,4,5,6 , 7 för att , 8 , 9 för att , 10. Trots deras gemensamma katalytiska centrum, dessa enzymer är multifunktionella, och de flesta finns i prokaryoter, där de används för att bryta ner föreningar som hämtats från komplexa kol källor3. Endast tre medlemmar av denna familj identifierades i eukaryoter hittills: namnet ger Fah2, liksom Fah domän-innehållande protein 1 (FAHD1)11,12,13,14 ,15 och Fah domän innehåll ande protein 2 (FAHD2). Utarmning av FAHD1 har förknippats med försämrad mitokondriell andning13,16 och associerad med en reversibel typ av cellulär senescens fenotyp14 som är kopplad till intermediär potential brister i elektron transport systemet. Human FAHD1 och dess ortologer i modell system (mus, Nematoden, cancer cellinjer, växter, etc.), samt utvalda punkt mutation varianter, har blivit druggable mål av potentiella intresse. För denna forskning, rekombinant protein i hög renhets grad, liksom information om katalytiska mekanismer som styrs av kristall strukturer och selektiva anti kroppar är avgörande.

Detta manuskript beskriver metoder för FAHD-proteinuttryck i E. coli, affiniskromatografi, jonbyteskromatografi, ammoniumsulfatfällning, preparativ och analytisk gel filtrering, kristallisation, röntgen diffraktion och och foto metriska analyser. Syftet med de metoder och protokoll som beskrivs här är att ge vägledning för forskare som arbetar inom olika områden såsom bakteriologi, växt bio logi, samt studier på djur och människor, för att karakterisera medlemmar i superfamiljen FAH, inklusive okarakteriserade superfamilje medlemmar bör de bli relevanta inom ett visst område. De protokoll som beskrivs här kan ge värdefullt stöd för projekt som syftar till att karakterisera andra prokaryota eller eukaryota Fah superfamiljen medlemmar.

Logiken bakom de metoder som beskrivs här är det faktum att för karakterisering av dåligt beskrivna proteiner (i synnerhet metabola enzymer av okänd fysiologisk relevans), tillvägagångs sättet för att börja med renade rekombinanta proteiner gör att utveckling av ovärderliga, högkvalitativa forsknings verktyg såsom in vitro aktiva enzym preparat, högkvalitativa anti kroppar och potenta och specifika farmakologiska hämmare för utvalda enzymer. De beskrivna metoderna kräver snabb proteinvätskekromatografi (FPLC) och röntgenkristallografi. Alternativa metoder (t. ex. för att uttrycka protein utan kemisk induktion, eller för att Visa protein rening genom centrifugering efter värmebehandling följt av avsaltning och storleks uteslutningskromatografi), kan hittas någon annan stans17. Även om det finns ett bredare spektrum av metoder för uttryck och rening av superfamiljen Fah enzymer2,7,9,17,18, fokuserar detta arbete på uttryck och rening av FAHD-proteiner i synnerhet.

I diskussionen delar upp av detta manuskript, de katalytiska mekanismerna som identifieras för det FAHD1 proteinet (hydrolase, decarboxylase)15 beskrivas i mer specificerar, för att visa det kemiska teckenet av de katalyserade reaktionerna. De uppgifter som erhållits baserat på tidigare arbete7,15,18 (PDB: 6fog, PDB: 6foh) innebär en tredje aktivitet av enzymet som keto-Enol isomeras.

Protocol

1. uttryck för FAHD-proteiner i kompetenta E. coli

  1. Transformation av E. coli med vektorer för uttryck av Fahd-protein
    Anmärkning: stegen som diskuteras i följande avsnitt sammanfattas i skiss i figur 1a, B. Samma protokoll gäller för alla FAHD-proteiner, inklusive punktmuterade varianter. Sådana varianter kan erhållas via platsstyrd mutesis och PCR-teknik19 (såsom DUBBELS IDIG SOE PCR-20) från Vildtyps-cDNA.
    Figure 1
    Figur 1 : Amplifiering av kompetent E. coli och induktion av protein uttryck.
    (A) införande av pET Vector i kompetenta BL21 (DE3) plyss E. coli bakterier, som beskrivs i avsnitt 1. (B) heat shock protokoll och plätering av pET omvandlas E. coli bakterier, som beskrivs i steg 1 i protokollet. Transformerade bakterier är pläterade på LB agar plattor med antibiotika för val. (C) förstärkning av pET -transformerade E. coli -bakterier som beskrivs i avsnitt 1. Kolonier plockas från en LB-agar tallrik och förstärks i närande medium (LB eller NZCYM) tills bakterie tätheten nådde den empiriska tröskeln för 0,4. D induktion av protein uttryck via DE3-Iptg-pET -systemet, beskrivet i avsnitt 1 och skissat i figur 2. Protein produktionen inleds med tillämpning av kemikalien IPTG. I slutet av avsnitt 1 skördas den bakterie pellets som innehåller proteinet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
    1. Skaffa kompetenta BL21 (DE3) Plyss E. coli -bakterier och en pET-uttrycksvektor (se material tabell). Företrädes vis välja en pET-vektor som också kodar en N-Terminal his-tag eller relaterade fånga tag för bekvämlighet för att förenkla följande renings steg.
    2. Skaffa cDNA för det FAHD-protein som du väljer och sätt in det i den aktiva klonings platsen för pET-uttrycksvektorn, mellan T7-Promotorn och T7-terminatorwebbplatserna.
    3. Efter lyckad Plasmid amplifiering och verifiering [via sekvensering av en kommersiell leverantör (T7 primers kan användas med pET-systemet för enkelhetens skull: T7 promotor, framåt primer: TAATACGACTCACTATAGGG; T7 Terminator, Reverse primer: GCTAGTTATTGCTCAGCGG)], sätt in 5 – 10 ng Plasmid i 100 μL av kompetenta BL21 (DE3) Plyss E. coli bakterier på isen. Aspirera inte upp och ner, men något knacka röret med för att blanda innehållet.
    4. Håll bakterierna på isen i 30 min, försiktigt knacka röret varannan minut.
    5. Värm en uppvärmnings anordning eller vatten bad till 42 ° c (exakt). Sätt röret som innehåller bakterierna i apparaten och hålla dem för 90 s (exakt). Sätt dem på isen omedelbart (figur 1a).
    6. Efter 5 – 10 min på isen, tillsätt 600 μL NCZYM medium (se material tabell) och Lägg röret i en bakterieinkubator. Skaka röret vid medelhastighet orienterad längs skaknings riktningen vid 37 ° c i 1 h.
    7. Platta 200 μL av bakterie kulturen på en 10 cm LB-agar tallrik (se tabell över material), som innehåller urvals antibiotika val [t. ex. en specifik för BL21 (DE3) plyss motstånd (kloramfenikol), och en för motståndet på pET -vektorn (kanamycin eller ampicillin, figur 1b)].
    8. Odla bakterierna på LB-agar plattan i en bakteriell inkubator vid 37 ° c över natten.
  2. Uttryck för FAHD-proteiner genom IPTG-induktion
    Anmärkning: de första stegen som diskuteras i följande avsnitt sammanfattas som en skiss i figur 1c, D. T7 uttrycks systemet via kombination av den bakteriella DE3 kassetten och pET Vector system sammanfattas i figur 2.
    Figure 2
    Figur 2 : Den DE3 kassett/pET vektor Dual system förklaras.
    (A) den skissade arvs massan av PET Vector omvandlas BL21 (DE3) plyss E. coli bakterier. Den infödda bakteriell genomet bär en DE3 kassett (se panel B), samt en Lac gen som ständigt uttrycker Lac repressormolekyl enheter. Den icke-infödda pET Vector bär protein genen infogas mellan en T7 polymeras promotor och Terminator sekvens. Mer information i panel B. (b) DE3- kassetten för den infödda bakteriens genom kodar informationen för T7 polymeras i termer av en E. coli RNA-polymeras operon. Detta protein är dock inte uttryckt eftersom Lac repressormolekyl enheten förhindrar RNA-polymeras protein från bindning. Därför uttrycks ingen T7-polymeras och inget exogent protein uttrycks. (C) tillämpningen av den kemiska IPTG (material tabell) snedvrider strukturen av Lac repressormolekyl enheter och hindrar dem från att binda till DE3 kassett. Som ett resultat kan RNA-polymeras nu binda till kassetten, för vilken T7 polymeras uttrycks, som är exogent protein så småningom. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
    1. Efter lyckad koloni formation, plocka en enda koloni (utan satellit kolonier) och skingra den i 5 mL NZCYM eller LB medium med antibiotika, väljs som tidigare (steg 1.1.7). Kultur i bakterieinkubator vid 37 ° c över natten (figur 1c).
    2. Efter framgångs rik bakterie tillväxt, förstärka bakterierna i 250 mL, 500 mL, eller 1 L partier av medium, beroende på efter frågan av proteinkvantiteten.
      1. Lämplig för volymen, tillämpa antibiotika valt som gjort i steg 1.1.7 och tillsätt ca 1%-2% av tät bakteriell pre-kultur (dvs. 2.5-5.0 mL till 250 mL volym medium, etc.). Ta ett prov som ska användas i steg 1.2.5 (1 mL eller mer) och kontrol lera den optiska densiteten (OD) vid 600 Nm. Odlings bakterier i bakterieinkubator vid 37 ° c i 2 – 3 timmar (figur 1c).
    3. Efter 2 – 3 timmar, dra ett prov för foto metrisk analys. Om OD vid 600 Nm har nått 0,4, applicera 200 μM upp till 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG, se tabell över material).
      Anmärkning: det faktiska värdet är empiriskt för varje FAHD-protein eller punkt mutation variant, där 1 mM IPTG är det högsta som bör tillämpas. Detta inducerar protein uttryck (figur 1d, figur 2C).
    4. Efter 3 – 5 timmar i bakterieinkubator vid 37 ° c är protein uttrycket uttömt.
      Obs: se diskussions sektionen för kommentarer om temperatur kontroll. Längre än 5 timmar skakning efter induktion rekommenderas inte. Ta ett prov för användning i steg 1.2.5 (1 mL eller mer) och kontrol lera den optiska densiteten (OD) vid 600 Nm.
      1. Skörda den bakteriella pelleten via centrifugering vid 5 000 x g i 5 min. Kassera supernatanten och frys pelleten vid-80 ° c för längre förvaring eller-20 ° c för kort förvaring (figur 1d).
    5. Kontrol lera induktion via de två hämtade foto metriska proverna, som är märkta "-I" (före induktion) och "+ I" (efter induktion). Efter centrifugering och resuspension av den bakteriella pelleten, analysera de två proverna med SDS-PAGE genom att fylla på samma mängd totalt protein.
      Anmärkning: "+ I"-provet ska visa ett starkt band associerat med molekyl vikten för det valda proteinet, medan "-I"-provet inte bör innehålla detta band. En låg induktions nivå är ett vanligt problem för produktion av proteiner, men nivån av uttryckt protein är ofta tillräcklig för följande steg. En hög induktions nivå är en fördel men är inte obligatoriskt.

2. Lys av bakterie pellets och filtrering av skräp

  1. Beroende på om det valda proteinet är hans-märkta eller omärkta, Välj ni-nta Löpbuffert (his-Tagged, se tabell över material) eller iskallt HIC kör buffert (otaggad).
  2. För varje 250 mL av den ursprungliga bakterie SUS pensionen, applicera 5 mL av den valda bufferten på den bakteriella pelleten (5 mL för 250 mL, 10 mL för 500 mL, etc.). Tillsätt 10 μL β-merkaptoetanol (β-ME) per 5 mL tillämpad buffert. Använd en 10 mL Pasteur Pipettera för att mekaniskt tvinga pelleten till SUS pension genom att skrapa och Pipettera (Undvik luft bubblornas formation vid pipettering). Så småningom överföra all SUS pension till 1 50 mL tub.
  3. Helst Sonikera (6x för 15 s på medel lång kraft) SUS pensionen.
  4. Centrifugera i 30 minuter med hög hastighet (10 000 x g) vid 4 ° c. Filtrera supernatanten efter varandra med filter enheter (t. ex. 0,45 μm, 0,22 μm) på isen.
    Obs: beroende på föregående centrifugering steg, filtrering direkt genom en liten filter porstorlek kan vara tråkiga och kräver oftast pre-filtrering genom en större porstorlek. DNAse kan läggas till för bättre resultat.
  5. Förvara provet på is och fortsätt omedelbart med antingen avsnitt 3 eller 4, beroende på om proteinet är hans-märkta eller omärkta.

3. rening av hans-märkta Fahd proteiner med ni-nta affiniskromatografi

Obs: ni2 + joner binds via nitrilotriättiksyra (NTA) till en AGA ros harts som används i affinitetskromatografi (immobiliserad metalljonkromatografi, iMac, figur 3a). Poly-histidin aminosyra Taggar binder starkt till detta ni-Chelate, och hans-märkta proteiner kan separeras från de flesta kvarvarande proteiner. Ett alternativ till den beskrivna beredningen av ni-NTA-kolonnerna är att använda färdigförpackade ni-NTA-kolonner och ett FPLC-system.

Figure 3
Figur 3 : Skissade illustrationer av vanliga typer av kromatografi.
A ) kådan i en ni-nta-kolonn. NTA har bivalent nickel joner som används i form av immobiliserade metalljonaffiniskromatografi (IMAC). Poly-histidin Taggar binda helst till detta motiv och kan vara elueras av Imidazol. B) den typiska beläggningen av kiseldioxidpartiklar i en fenylbaserad hydrofob interaktionskromatografi (HIC-fenyl). Hydrofoba proteiner interagerar med beläggnings materialet och fördröjs i sin migration medan andra inte är det. (C) den typiska beläggningen av kiseldioxid partiklar i Joniska interaktionskromatografi. Polariserade och laddade proteiner interagerar med beläggnings materialet och fördröjs i sin migration medan andra inte är det. (D) harts av en kiselgel i storlek-uteslutningskromatografi (SEC). Baserat på definierade porer i kiseldioxid materialet kan proteiner separeras av deras storlek (i en första närhet som motsvarar deras molekyl massa). Små proteiner genomsyrar det porösa kolonnmaterialet och är fördröjda, medan stora proteiner migrerar snabbare runt de porösa partiklarna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Fortsätt från steg 2,5 (dvs, proteinet är i ni-NTA löpbuffert och filtreras av 0,22 μm filter enheter på is).
  2. Förbered en tom plast eller glas kolumn genom att tvätta den tomma kolonnen och bifoga den till en stabil hållare. Välj storlek på kolonnen beroende på volymen av protein SUS pensionen.
  3. För varje 10 ml protein SUS pension, applicera 500 μl av ni-nta AGA ros flyt gödsel i kolonnen (skaka kraftigt före användning). Applicera flyt gödsel långsamt och droppvis på botten filtret av kolonnen med hjälp av en pipett. Låt kolumnen bosätta sig, vilket tar några sekunder.
  4. Fyll kolumnen helt med ni-nta löpningsbuffert, se till att inte störa AGA ros harts. Låt bufferten springa igenom genom gravitation. Processen kan påskyndas genom att använda tumtryck på vätskan (med hjälp av ett lock eller handske och tumme tryck), men var noga med att inte förvränga AGA ros harts.
  5. Applicera protein SUS pensionen. Som tidigare, låt provet springa igenom genom gravitation. Accelererande detta steg med tumme tryck rekommenderas inte, som bindning av proteiner till kolonnen förstärks om flödet är låg. Samla in genomflödet i ett rör (material tabell).
  6. När provet har passerat, fyll hela kolumnen igen med ni-NTA löpningsbuffert. Var noga med att inte störa AGA ros harts. Låt provet springa igenom genom gravitation, men i motsats till föregående steg, påskynda processen via tumme trycket rekommenderas, som potentiella föroreningar på grund av ospecifika interaktioner kan störas på detta sätt. Samla tvätt lösningen i ett rör. Upprepa det här steget.
  7. Placera en UV-genomskinlig kyvetten under kolonnen och applicera 1 mL ni-NTA elutionsbuffert. Samla in provet utan att tillämpa något tumtryck på kådan.
  8. Kontrol lera provets optiska densitet (OD) vid 280 nm vs. ett blind prov (dvs. ni-NTA-elutionsbuffert). Optimalt, visar provet en OD större än 2,5. En OD under 0,5 anger att ingen signifikant mängd protein finns i provet.
    Anmärkning: enligt beskrivningen i diskussions avsnittet kan salt-och imidazolkoncentrationerna i elutionsbufferten behöva anpassas individuellt för varje FAHD-protein.
  9. Upprepa steg 3.1.7 och 3.1.8 tills OD sjunker under 0,5. Pool alla prover med högre OD i ett rör på is.
  10. Börja om igen med steg 3.1.4, genom att använda genomflödet från steg 3.1.5 som ny ingång för denna upprepning av steg 3.1.5. Upprepa denna process tills det första provet som samlats in i steg 3.1.6 visar en OD under 0,5.
    Obs: som beskrivs i fel söknings delen av avsnittet diskussion, hans-märkta proteiner kan binda otillräckligt till ni2 +-harts. I sådana fall krävs upprepning av detta steg eller alternativa metoder (t. ex. jonbyteskromatografi).
  11. Ta prover av alla mellanliggande fraktioner för SDS-PAGE analys.
  12. FAHD-proteiner i ni-NTA elutionsbuffert fälls ut vid frysning och upptining. Dialysera därför proteinet mot en annan buffert (övernattning på is, med 1 μL DTT per 100 mL dialys buffert). Använd låg salt buffert baserat på vilken typ av jonbytarkromatografi som ska utföras efter detta steg. Använd vanliga cellulosa slangar med en typisk molekyl vikt cut-off av 14 kDa (tabell över material).
  13. Efter övernattning dialys, eventuellt koncentrera proteinet med hjälp av Ultra-centrifugering filter enheter. Utför SDS-PAGE analys (12,5% Running gel, 4% stapling gel) för att kontrol lera om potentiell förlust av protein, otillräcklig eluering, och protein renhet i allmänhet. Om allt är bra, gå vidare till avsnitt 5.

4. rening av otaggade FAHD-proteiner via hydrofoba interaktionskromatografi (HIC)

Anmärkning: fenyl-grupper på beläggningen ytan av en kiselgel i en HIC kolumn för FPLC (figur 3b) möjliggör separation av proteiner enligt hydrofoba karaktär. De beskrivna stegen ska utföras med ett FPLC-system utrustat med en 5 mL HIC-fenyl-kolonn. Kolonnerna kan tvättas med 1 M NaOH för att återanvändas för olika proteiner. Kolonner som används för en typ av FAHD-protein bör dock återanvändas för endast denna typ av protein.

  1. Ammoniumsulfat (AS) nederbörd
    1. Gå vidare från steg 2,5. Proteinet är ikallt HIC rinnande buffert (bordlägga av material).
    2. Bedöm volymen av den beredda protein lösningen exakt till mikroliter (Vinitial). Sakta och Drop-Wise lägga förkyld HIC kör buffert AS lösning, tills en 35 volym-% AS mättnad uppnås: Vsom tillagd = vinitial * 0,538. Rör om lösningen varsamt i 30 min. Centrifugera i 15 minuter med hög hastighet (≥ 10 000 x g) vid 4 ° c.
    3. Filtrera supernatanten med hjälp av en 0,22 μm filter enhet på isen. Du kan också ta ett prov för SDS-PAGE analys: späd 1:4 och värme omedelbart vid 95 ° c för 5 min annars provet kommer klump. Provet kan frysas vid denna punkt (-20 ° c) för att fortsätta en annan dag.
  2. FPLC med hjälp av en HIC-kolumn
    1. Ställ in FPLC-systemet och jämvikt en 5mL HIC-fenyl kolonn med 5 kolumn volymer (CV) på 20% EtOH (i H2o) följt av 5 CV av h2o.
    2. Blanda 260 mL HIC rinnande buffert (exakt) med 140 mL HIC kör buffert AS (exakt). Detta resulterar i en 35 volym-% AS-lösning. Kontrol lera pH-värdet (7,0). Detta är buffert A. buffert B är 250 mL av körningsbufferten. Tillsätt 1 mM DTT till båda buffertarna A och B, och förvara dem sedan på isen.
    3. Jämvikt i kolonnen med 8 mL buffert A, 8 mL buffert B och 8 mL buffert A i denna sekvens. Applicera provet som förberetts i protokoll steg 4,1. Tvätta med buffert A, tills den optiska absorptionen vid bas linjen vid 280 nm når 1000 – 500 mAU.
    4. Tillämpa en blandning av buffertar A och B, så att koncentrationen av som är 33% (w/v). Tvätta med 1 CV, vilket resulterar i en platå i kromatogrammet. Ställ in en gradient för buffert B (upp till 100% buffert B över tid): 1,5 mL buffert B i 3,8 min (dvs. 5,7% buffert B med 1% B/mL lutning). När UV-signalen vid 280 nm stiger, börja samla fraktionen och placera den på is omedelbart.
    5. I ändan, Tvätta kolonnen med buffert B. Ta prover av alla fraktioner för SDS-PAGE analys. Frys alla prover med flytande kväve och förvara dem vid-80 ° c.
    6. Utför en analys av SDS-PAGE (och Western blot) för att detektera FAHD-proteinet i de insamlade fraktionerna. Fraktioner som innehåller proteinet poolas och appliceras på ytterligare rening, som beskrivs i följande protokoll steg. Tvätta kolonnen med H2o och 20% EtOH (i h2o).

5. rening av FAHD-proteiner via jonbyteskromatografi

Obs: molekyler med laddade funktionella grupper är bundna till en kiseldioxid partikel kolumn för FPLC (figur 3c). Detta möjliggör differentiering av proteiner enligt deras Joniska karaktär, såsom ytladdning. De beskrivna stegen ska utföras med en FPLC-maskin och tillhör ande know-how. Den beskrivna metoden är densamma för antingen katjoniska eller anjonkromatografi, men de buffertar som ska användas är något annorlunda.

  1. Valde katjonkromatografi-eller anioniskt utbytes system. Detta val är empiriskt och kan variera mellan FAHD-proteiner. Optimalt kan båda metoderna användas efter varandra.
  2. Ställ in FPLC-systemet och Tvätta kolonnen med 5 CV på 20% EtOH (i H2o), följt av 5 CV av h2o. jämvikt KOLONNEN med 1 CV av låg-salt buffert, hög-salt buffert, och igen låg-salt buffert i denne ordningsföljd.
  3. Applicera provet (dialyserat mot rätt låg saltbuffert från steg 3.1.11) på kolonnen. Samla in genomflödet. Tvätta kolonnen för 1 CV med låg saltbuffert.
  4. Ställ in en gradient eluering: 100% hög salthalt i 30 min vid en flödes hastighet på 1 mL/min, eller 60 min med en flödes hastighet på 0,5 mL/min. Detta kan väljas på nytt baserat på ett redan känt FPLC-kromatogram, för att optimera reningen. Samla alla topp fraktioner.
    Hög salthalt kan variera mellan FAHD-proteiner, vilket beskrivs i diskussions avsnittet.
  5. När övertoningen är klar kör du med hög salt buffert tills inga fler toppar upptäcks över intervallet 1 CV (samla bråk).
  6. Ta prover av alla insamlade fraktioner och utföra SDS-PAGE analys (12,5% Running gel, 4% stapling gel). Frys de enskilda proverna i flytande kväve och förvara dem vid-80 ° c.
  7. Efter att SDS-PAGE-analysen är slutförd, kan du ta prover som innehåller FAHD-proteinet och kassera de andra. Alternativt, koncentrera proteinet med hjälp av Ultra-centrifugering filter enheter.
  8. Applicera 1 mL 25% SDS i 0,5 M NaOH (eller andra rengörings medel) för att rengöra kolonnen. Tvätta kolonnen med H2o och 20% EtOH (i h2o).
  9. Du kan också upprepa avsnitt 5 med den alternativa kolumnen (katjonkromatografi eller anionisk utbytes Proteinet som erhålls från denna metod är tillräckligt rent för att utföra grundläggande aktivitets analyser eller kan användas vid screening analyser för kristallografi. För avancerade program, Fortsätt med avsnitt 6.

6. rening av FAHD-proteiner via storlek-uteslutningskromatografi (SEC)

Obs: porösa partiklar i en kiselgel-kolonn för FPLC möjliggör differentiering av proteiner enligt molekyl storlek, såsom hydrodynamisk radie (figur 3D). De beskrivna stegen ska utföras med ett FPLC-system, med hjälp av SEC-kolumner.

  1. Välj en SEC-kolumn, beroende på molekyl vikter av föroreningar fortfarande närvarande, som upptäcks via SDS-PAGE och silver färgning. Den beskrivna metoden lämpar sig för båda kolumnerna. Tvätta kolonnen över natten med 400 ml H2O och jämvikt med SEC-löpningsbuffert. Det rekommenderas att skriva ett program för FPLC-systemet för att automatisera detta steg.
  2. Tillsätt 1 mM DTT till 300 mL SEC-körningsbuffert och Lägg den på is. Detta är löpbufferten. Applicera 60 mL av denna buffert i kolumnen.
  3. Centrifugera protein provet (10 000 x g i 10 min) för att avlägsna eventuell mikrofällning. Applicera supernatanten i kolonnen. Det rekommenderas generellt att filtrera supernatanten före FPLC.
  4. Använd löpbufferten till kolumnen tills allt protein är eluerat. Samla alla toppar i fraktioner av lämplig volym (t. ex. 2 mL). Ta prover för SDS-PAGE och frys alla fraktioner med flytande kväve. Förvara de frysta fraktionerna vid-80 ° c.
  5. Efter analys av SDS-PAGE (och Western blot) samlar och poolas alla fraktioner som innehåller FAHD-proteinet. Silver färgning rekommenderas för att upptäcka mindre föroreningar som fortfarande kan förekomma.
  6. Använd Ultra-centrifugering filter enheter för att koncentrera proteinet. Även om det inte är obligatoriskt för FAHD-proteiner, rekommenderas i allmänhet ett avsaltning steg (t. ex. genom dialys) för enzym analyser och kristallisation.
  7. Upprepa steg 6.3 – 6.6 flera gånger med olika flödes hastigheter och saltkoncentrationer (empiriska) för att förbättra renheten hos FAHD-proteinet. Tvätta kolonnen över natten med H2o och 20% EtOH (i h2o).

7. grundläggande FAHD aktivitet analyser med substrat oxaloacetat och acetylpyruvate

Obs: Fahd protein 1 (FAHD1) visar aktiviteten oxaloacetat dekarboxylas (ODX) och acylpyruvate hydrolas (APH). Detta beskrivs mer detaljerat i diskussions avsnittet. På grund av destabilisering av keto-Enol tautomerization i vatten lösning (dvs., enolization), oxaloacetat sönderfaller av sig själv över tiden (Auto-Decarboxylation) som en funktion av kofaktor koncentration och pH. Vid ungefär ett pH av 7 och temperatur på 25 ° c, denna effekt är inte dramatisk, men analyser måste vara utelämnat att redogöra för både Auto-dekarboxylering och enzym koncentration. Pipettsystemet beskrivs i figur 4a. I allmänhet är det rekommenderat att använda väl kalibrerade Pipetter för denna analys, eftersom det är ganska känsligt för mindre pipettering fel.

Figure 4
Figur 4 : Skiss pipettering för enzymanalyser.
(A) ett skissat pipettschema för basiska GRUNDBASERADE Fahd-proteinenzymanalyser. Substrat blank:-S/-E; substrat prov: + S/-E; enzym blank:-S/+ E; enzym prov: + S/+ E (S: substrat, E: enzym). Se protokoll steg 7 för mer information. (B) ett skissat pipettschema för bedömning av Michaelis-menten kinetik av Fahd-protein. Substrat blank:-S/-E; substrat prov: + S/-E; enzym blank:-S/+ E; enzym prov: + S/+ E (S: substrat, E: enzym). Se avsnitt 8 i protokollet för mer information. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Starta en mikroplattläsare och jämvikt i 30 min vid 25 ° c. Setup ett program för att läsa 12 brunnar (som beskrivs i figur 4a) vid 255 nm. Det rekommenderas att använda 25 flera avläsning med 5 MS tids fördröjning. Ställ in en cykel för att mäta 15x var 2 min (30 min totalt).
  2. Som standard bereds en enzymanalysbuffert (se material tabell) med 1 mm mgcl2 vid pH 7,4. Variant Fahd proteiner kan kräva olika kofaktorer eller pH-nivåer. Mg2 + och mn2 + är kända kofaktorer för FAHD13,11,12,21.
  3. Skapa en 1 μg/μL protein lösning, spädning med enzymanalysbuffert (material tabell).
  4. Ställ in 1 mL 20 mM lösning av ett substrat som ska testas (hittills identifierade substrat av FAHD proteiner listas på andra ställen3) i enzymanalysbuffert.
  5. Bered det enzym tomma och prov brunnarna enligt pipettschemat som visas i figur 4a: pipettera 90 μl enzymanalysbuffert (material tabell) i brunnarna med 5 μl (5 μg) enzym lösning.
  6. Preparera substratet och prov brunnarna enligt pipetteringsordningen som visas i figur 4a: pipettera 95 μl enzym analysbuffert i brunnarna.
  7. Applicera 5 μL enzymanalysbuffert i de sex tomma brunnarna precis före mätningen. Tillsätt 5 μL av 20 mM substrat lösningen till provbrunnarna. Det rekommenderas att använda en flerkanalspipett.
  8. Använd en flerkanalspipett på 50 μL för att försiktigt blanda alla brunnar. Börja med Tom rummen och fortsätt med provbrunnarna. Var noga med att inte skapa några bubblor. För in plattan i en mikroplattläsare och mät varje brunn vid 255 nm (enligt beskrivningen i steg 7,1).
  9. Utför analysen i ett kalkyl blad. Kopiera rå data från foto metern till ett kalkylark och skriv alla inställningar (d.v.s. all dokumentation) till ett annat ark. Genomsnittlig data för de tre brunnarna i vart och ett av de fyra preparaten. Subtrahera det tomma från provet. Beräkna även standard avvikelser och summera avvikelserna för blank och prov.
  10. Rita dessa data (y: optisk densitet, x: tid i min). En exponentiellt minskande kurva ska visas. Beroende på vilken typ av substrat som används, en initial ökning inom de första 10 min kan observeras, varefter signalen minskar. Detta tillskrivs den keto-Enol tautomerization av substratet, som beskrivs mer i detalj i diskussionen avsnittet.
  11. Dela upp de optiska signal data över tiden med det maximala värdet av tomten, för att skala data ner i intervallet [0,1] (ett exempel finns i figur 5a). Identifiera kurvans linjära omfång, med början vid den initiala minskningen, och beräkna den negativa lutningen (1/min).
  12. Tids förloppet för minskningen av OD är associerat till substratet via dess initiala koncentration: 100 nmol/brunn * lutning. Med hjälp av den bedömda protein koncentrationen c0 beräknas den specifika aktiviteten: 100 nmol/brunn * lutning * 1/c0. Uttrycker c0 i μg/well, den specifika aktiviteten beräknas detta sätt uttrycks med hjälp av enheten nmol/min/μg, vilket motsvarar μmol/min/mg.

8. bedömning av Michaelis-menten kinetik av FAHD proteiner

Anmärkning: att bedöma Michaelis-menten kinetik av FAHD proteiner är tråkigt, eftersom den specifika protein aktiviteten är beroende av både den relativa protein-substrat koncentration och fysisk volym där reaktionen äger rum. Steady-State kinetik måste fastställas för att uppnå tillförlitliga resultat. Ett testat protokoll på en 96 väl UV transparent plattan beskrivs i följande steg. Varje steg måste utföras med stor omsorg, eftersom mindre fel brukar förstöra experimentet. Det rekommenderas att behärska de analyser som beskrivs i avsnitt 7 innan du försöker den mer komplicerade analysen som beskrivs nedan.

Figure 5
Figur 5 : Exemplariska resultat av enzym analyser.
(A) en exemplarisk UV-absorptionskurva som erhållits för grundläggande substrat-baserade Fahd-proteinenzymanalyser (normaliserade i intervallet 0 till 1) med standard avvikelse. Den optiska densiteten (OD) [OD (t)/OD (0)] vid en given tidpunkt t [OD (t)] normaliseras till den initiala OD [t = 0; OD (0)]. Se avsnitt 7 i protokollet för mer information. (B) exemplarisk Michaelis-menten kinetik av det humana FAHD1 proteinet med standard avvikelse. Se avsnitt 8 i protokollet för mer information. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Starta en mikroplattläsare och jämvikt i 30 min vid 25 ° c. Ställ in ett program för att läsa 72 brunnar (som beskrivs i figur 4b) vid 255 nm. Det rekommenderas att använda 25 flera avläsningar med en 5 MS tids fördröjning. Ställ in en cykel för att mäta 15x varje 2 min (30 min totalt).
  2. Utför steg 7,2 och 7,3. Ställ sedan in 1 mL 100 mM substrat lösning i enzymanalysbuffert.
  3. Bered Utspädningar av substrat lösningen i enzymanalysbuffert: 40 mM, 20 mM, 10 mM, 6 mM, 4 mM, 2 mM. Analysen utförs med Pairwise ("justerade") enzym-/substrat koncentrationer. För detta, Förbered följande spädningar av enzym lösningen i enzymanalysbuffert: 0,5 μg/μL, 0,4 μg/μL, 2,5 μg/μL, 2 μg/μL, 1,5 μg/μL, 1 μg/μL.
  4. I alla brunnar som avbildas i figur 4b gäller 180 μl enzymanalysbuffert. Applicera 10 μL enzymanalysbuffert i alla brunnar för substratet (tomt och prov). Applicera 10 μL av den beredda protein utspädnings serien i brunnarna för enzymet (blind prov). Applicera 10 μL enzymanalysbuffert i alla brunnar för brunnar för substratet och det tomma enzymet.
  5. Före mätningen skall 10 μL av den preparerade substrat utspädnings serien appliceras i brunnarna för substrat provet och enzym provet.
  6. Använd en flerkanalspipett på 50 μL för att försiktigt blanda alla brunnar, med början i ämnena, och gå vidare till provbrunnarna. Var noga med att inte skapa några bubblor.
  7. För in plattan i en mikroplattläsare och mät varje brunn vid 255 nm, enligt beskrivningen i steg 8,1. Utför analysen i ett kalkyl blad. Kopiera rå data från foto metern till ett kalkyl blad, skriv alla inställningar (d.v.s. all dokumentation) till ett annat ark.
  8. Utför individuell data analys per punkt i utspädnings serien som beskrivs i steg 7,11. till 7,14. Så småningom, få alla specifika aktiviteter och observations området mot den initiala substrat koncentrationen: 2 mM, 1 mM, 0,5 mM, 0,3 mM, 0,2 mM, 0,1 mM.
  9. Visa alla data punkter med individuella standard avvikelser. Computer Michaelis-menten kinetik via icke-linjär kurva montering, eller via Lineweaver-burk analys. Det kan krävas att en ny mätning av enskilda punkter och att anpassa enskilda koncentrationer av protein koncentration/substrat-koncentrations par i steg 8,5 och 8,6. Michaelis-menten-diagrammet för mänskliga FAHD1 finns i Figur 5b.

9. kristallisering av FAHD proteiner

Anmärkning: kristallisering av FAHD-proteiner (Human FAHD1 beskrivna tidigare15) kan uppnås genom den hängande DROPP ångdiffusions metoden i ett 24-välformat (figur 6a). Ett steg-för-steg-protokoll om kristallisering av mänskliga FAHD1 med denna teknik presenteras nedan15. En mer detaljerad beskrivning finns i diskussions avsnittet.

Figure 6
Figur 6 : Kristallisation av FAHD-proteiner.
(A) kristalliserings plattor i standard 24 väl eller 96 väl SBS fot avtryck. Se avsnitt 9 för mer information. (B) bas plattans inställnings process vid kristallisation av Fahd-proteiner. Denna siffra ritas om med tillstånd23. Se avsnitt 9 för mer information. C) humana FAHD1-kristaller och motsvarande diffraktions mönster (små skär). Den närmaste gitter avståndet indikeras i skären som ett mått för diffraktions kvalitet av kristallerna. Lägre siffror indikerar högre upplösning och därmed mer informativa data. Se avsnitt 9 i protokollet för mer information. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Se till att proteinet dialyseras mot SEC löpbuffert. FAHD1-proteinet ska finnas tillgängligt vid höga koncentrationer (2 – 5 mg/mL). Vid lägre koncentrationer, kan proteinet inte kristallisera på grund av brist på spontan nukleation.
  2. Bered ≥ 20 mL av reservoarlösningen för kristallisation. Gör tre lager lösningar med destillerat eller avjoniserat vatten som lösnings medel: 1 M na-HEPES (minst 25 mL, justerat till pH 7,5), 50% (vikt/volym) polyetylenglykol 4000 (PEG4k) (minst 65 mL) och 1 M MgCl2 (10 ml).
  3. Ställ in ett rutnät av 4 x 6 (24 totalt) olika 15 mL rör. Märk dem enligt motsvarande positioner på plattan (t. ex. rad (A, B, C, D) resp. kolumn (1 – 6) som "a1", "B5", "D6" osv.). Pipettera 1 mL 1 M na-HEPES i varje tub.
  4. Pipettera 1 mL 50% (w/v) PEG4k i rad A i rören, 2 mL i rad B, 3 mL i rad C och 4 mL i rad D. Pipettera 100 μL 1 M MgCl2 till kolumn 1 i rören, 250 μl i kolumn 2 , 500 μL till kolumn 3, 1,0 mL i kolumn 4, 1,5 mL i kolumn 5 och 2,0 mL i kolumn 6.
  5. Fyll alla rör upp till en volym på 10 mL med destillerat eller avjoniserat vatten, där skalan på rören är tillräckligt noggrann.
  6. Ta det humana FAHD1 protein provet (~ 5 mg/mL) från kyl skåpet (eller från isen) och snurra med högsta hastighet med en bordscentrifug vid 4 ° c i minst 10 min. Om co-kristallisation med oxalat önskas, tillsätt oxalat från en stam lösning så att proteinet provet innehåller en slutlig oxalatkoncentration av 2 mM. Applicera 1 mM DTT och förvara på isen.
  7. Under tiden, packa upp en 24 väl kristallisation tallrik, helst i ett temperaturkontrollerat rum vid 18 ° c. Fördela ett tunt lager paraffin olja på fälgen ovanpå varje brunn av 24 brunn plattan med hjälp av en tunn glas eller plast stav. Tillsätt 800 μL av de beredda kristalliserings drinkarna (a1 till D6) i varje motsvarande brunn av kristalliserings plattan.
  8. Placera färska 22 mm täckglas på en ren yta. Undvik att förorena täckglasen med smuts eller damm. Om det behövs, ta bort eventuellt skräp från täckglasen med tryck luft eller en Duster spray.
  9. Efter centrifugering är klar, undvika att skaka proteinet provet så att de snurrade-Down aggregat och skräp på botten av röret inte flyter upp igen. I följande steg, Pipettera från protein provet strax under ytan av lösningen för att undvika omrörning upp aggregat och inlåning från botten.
  10. För varje brunn (se figur 6b) Pipettera 1 μl protein lösning till mitten av en täckslip och tillsätt 1 μl av respektive reservoarcocktail till protein droppeten och Undvik bubblor. Vänd täckglasen upp och ned och placera den på toppen av brunnen så att oljan tätar brunnen med täckglasen lufttät. Upprepa tills 24-välplattan är klar.
  11. Förvara plattan vid 18 ° c och observera dropparna på ett progressivt schema med rätt Mikroskop. Mänskliga FAHD1 kristaller visas vanligt vis över natten (se figur 6C).

Representative Results

Börjar med en för beredd kloning vektor och köpt BL21 (DE3) Plyss E. coli, Plasmid sätts in i bakterierna via värme chock eller någon lämplig alternativ metod (figur 1). Efter en kort period av förstärkning, de transformerade bakterierna är pläterade på LB agar tallrikar, för att växa över natten. Plattorna på denna punkt kan se annorlunda ut, beroende på en mängd olika potentiella fel källor. Plattorna kan vara tomma (dvs. inga kolonier), helt igenväxda av bakterier, eller något däremellan, respektive. Två exempel på LB-agar plåtar efter optimal och icke-optimal omvandling avbildas i figur 7a. Alltför många bakteriekolonier visar antingen att alltför många bakterier har pläterat (sannolikt) eller att antibiotika i användning kan vara passerat (osannolikt). För få bakteriekolonier kan tyda på att antingen inte tillräckligt Plasmid användes för omvandlingen (Använd mer nästa gång) eller att för mycket antibiotika användes för att välja bakterier. I vilket fall som helst, om kolonier är närvarande, bör de vara bra, eftersom användning av två selektiva antibiotika innebär en ganska obetydlig chans att icke omvandlade bakterier att växa. Inga kolonier alls tyder dock på att antingen bakterierna förlorat sin omvandlings kompetens (på grund av fel lagring eller lagring under längre perioder, upprepad frysning och Tina, etc.), var värme chocken inte framgångs rik (ingen Plasmid upptag eller bakterie döden av för mycket värme), kloningen vektorn är skadad, eller av misstag en felaktig uppsättning selektiva antibiotika användes (kontrol lera motståndet genen på Plasmid vektor).

Figure 7
Figur 7 : Representativa resultat för bakterie omvandling och iMac.
A representativa lb-agar-plattor med TRANSFORMERADE BL21 (DE3) E. coli, erhållna genom följande protokoll steg 1,1. Vänster: en tallrik med välfördelade kolonier (positivt exempel). Höger: en tallrik med endast en enda koloni (negativt exempel). Vita cirklar markerar bra kolonier. Den röda cirkeln markerar kolonier som växer för nära varandra och bör inte plockas så länge isolerade kolonier finns tillgängliga. B) en analys av en serie induktions kontroller på 12,5% akrylamid (SDS-Page) ("-" indikerar före iptg-induktion. "+" indikerar efter IPTG-induktion, före pelletskörningen), justerat till lika stora mängder av totalt protein. Detta beskrivs i steg 1,2. (C) en exemplarisk 12,5% akrylamid SDS-Page analys av ni-nta rening av hans-märkta FAHD1 protein. Detta beskrivs i avsnitt 3 i protokollet. Affinitetskromatografi ger protein av hög renhet (> 70%, svart pil), men flera små föroreningar observeras också (Röda pilar). Dessa föroreningar består av icke-FAHD-proteiner som binder till kolonnen, och från proteiner som binder till FAHD-proteinet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Validerade kolonier väljs och plockas. Efter amplifiering i närande medium, protein uttryck utlöses genom tillämpning av den kemiska IPTG. Den bakterie pellets som innehåller det uttryckta proteinet i milligram kvantiteter skördas, och uttryck verifieras via SDS-PAGE (se till exempel figur 7b). Vissa problem kan uppstå under denna annars enkla process. För det första, vissa proteiner bildar inkludering organ, eftersom de tydligen på något sätt störa den naturliga metabolismen av värd bakterier. Detta observerades för någon punkt mutationer av mänskliga FAHD1 och FAHD2. I sådana fall kan andra uttrycks system som insekts celler vara lämpligare och bör övervägas. Efter skörd av en pellet från insekts celler, till exempel, rening av proteiner följer samma steg som beskrivs i detta protokoll. För det andra, DE3-pET -systemet är ibland visat sig vara "läckande" (dvs., protein är redan uttrycks i viss utsträckning före iptg induktion). Den potentiella orsaken till detta är inte väl förstått, men det kan bidra till att uttrycka proteinet långsamt över natten i ett kallt rum inkubator. För det tredje uttrycks inget protein. Detta är förmodligen det värsta scenariot, eftersom det sannolikt tyder på en skadad Plasmid vektor och därför tillrådligt att sekvenera plasmid.

Om en his-tag användes för att tagga proteinet är affinitetskromatografi med ni-nta AGA ros en enkel och billig fångst metod som eliminerar de flesta kontamineringar (figur 7c). Liknande metoder finns för andra taggsystem (t. ex. STREP-II). Om ingen tagg användes kan en kombination av ammoniumsulfatfällning och på varandra följande hydrofobiska växlingskromatografi också separera proteinet från de flesta andra proteiner (figur 8a). Men om man jämför de två metoderna (figur 7c jämfört med figur 8a) kan ni-nta-metodernas ÖVERLÄGSENHET PÅVISAS genom SDS-Page-analys. Med hjälp av hans-märkta protein rekommenderas därför.

Figure 8
Figur 8 : Representativa resultat för FPLC-experiment (HIC, JONBYTE, SEK).
A en typisk kromatogram-och 12,5-procentig akrylamid, SDS-Page-analys av HIC-fenylkromatografi efter ammoniumsulfat (as) utfällning av OTAGGADE FAHD1-protein, enligt beskrivningen i avsnitt 4 i protokollet. Den gröna linjen återspeglar övertoningen av bufferten B som inte innehåller AS. Under processen som gradvis tvättas bort från systemet. Om man jämför denna panel med figur 7c visar den kraften hos ni-nta affiniskromatografi jämfört med HIC-fenyl-metoden, och fördelen med att använda ett his-tag-system för protein rening. B en exemplarisk kromatogram och 12,5% akrylamid SDS-Page-analys av katjonbyteskromatografi av hans-märkta Fahd efter ni-nta-rening. Med en saltgradient separeras det applicerade provet i enskilda proteiner. C) ett exemplariskt kromatogram och 12,5% akrylamid SDS-Page-analys av G75-storlek exkluderings kromatografi av hans-märkta Fahd efter katjonbyteskromatografi. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Efter varandra separeras proteinet ytterligare från överblivna föroreningar med katjonkromatografi (t. ex. se figur 8b), följt av storleks-uteslutningskromatografi (t. ex. se figur 8c). Det rekommenderas att upprätta en initial renings strategi i denna ordning; dessa kolonner bör dock användas i kombination, därefter och i variation, tills proteinet är tillräckligt rent.

Enkel aktivitet analyser, för att testa för "ja eller nej" beslut om aktiva substrat och/eller kofaktorer, kan utföras med hans-märkta proteiner efter ni-nta rening, eller omärkta proteiner efter den joniska utbytet kolonn. Specifika aktiviteter och kinetiska konstanter måste bestämmas med protein av högsta renhet. Kristallisation kan prövas med proteiner efter den joniska utbytet kolonn, men kvaliteten på kristaller nästan alltid korrelerar med protein renhet. Polyklonala anti kroppar kan höjas mot proteiner i något skede av renings protokollet. men här kvaliteten också korrelerar med proteinet renhet.

Discussion

Kritiska steg

FAHD-proteiner är mycket känsliga för saltkoncentrationer. Vid låga NaCl-koncentrationer kan proteinerna fällas ut vid upptining, men de kan vanligt vis rekonstitueras vid högre saltkoncentrationer. Det är, om ett FAHD-protein fälls av någon anledning, det kan återvinnas eller omvikas med högre saltkoncentrationer (> 300 μM). Vissa mer hydrofoba proteiner kan dock inte återvinnas (till exempel Human FAHD2), men rengörings medel som CHAPS (högst 1%) eller glycerol (10%) kan användas för att hålla dem i stabil lösning. I alla fall, chock-frysning med flytande kväve och lagring vid-80 ° c rekommenderas, eftersom det är en mild och långsam process av upptinning.

Några oväntade problem kan uppstå under ni-NTA rening i steg 3.1.10. Av anmärkning, en högre OD i det andra insamlade provet än i det första provet indikerar en alltför hög volym av AGA ros harts (ta en anteckning och använda mindre harts i nästa experiment). Också, den AGA ros harts själv leder till en OD-signal vid 280 nm (dvs., störningar av AGA ros harts sängen kommer att ge artificiella signaler). I tveksamma fall, det rekommenderas att använda andra metoder som en Bradford eller BSA-analys för att bestämma proteinkoncentrationer.

I enzymatiska analyser, det finns tre kritiska aspekter som skall övervägas. För det första är det viktigt att bedöma protein koncentrationen för att få rätt specifika aktiviteter. Proteiners renhets grad påverkar resultatet och måste uppskattas. I fråga om märkt protein måste massan av taggdelen beräknas, och den specifika verksamheten måste korrigeras på motsvarande sätt. För enkla analyser som beskrivs i avsnitt 7 i protokollet är ni-NTA-renhets graden tillräcklig för att skilja mellan aktiva och inaktiva substrat, koffeor osv. När det gäller mer komplexa Michaelis-menten kinetik, alla reaktant och substrat koncentrationer måste bestämmas korrekt. Speciellt när du använder oxaloacetat (som Auto-decarboxylates över tiden) den enzymatiska delen av reaktionen måste korrigeras för Auto-Decarboxylation (under antagande att båda reaktionerna uppträder samtidigt). Initiala förändringar i den optiska densiteten signalen riktas till keto-Enol tautomerization av substratet måste övervägas. För det tredje måste koncentrationerna och volymerna justeras. En reaktion med definierade koncentrationer av enzym och substrat kan ge olika resultat beroende på analys volymen. Om det finns för mycket enzym per brunn, vidhäftning av vätskan kan i själva verket bias resultatet.

För bedömning av Michaelis-menten kinetik rekommenderas att utföra inledande experiment i 100 μL, 200 μL, och 300 μL partier för att hitta den optimala kombinationen. Liknande aspekter gäller förhållandet mellan enzym-substrat koncentrationer för kinetiska analyser. För mycket enzym per substrat eller för mycket substrat per enzym sätta systemet utanför den linjära Steady-State Michaelis sortiment. Initiala experiment krävs för att optimera dessa villkor. Exemplarisk justering för humant FAHD1 (vild-typ) protein finns i avsnitt 8, vilket resulterar i kinetiska diagram (som visas i Figur 5b, till exempel).

För kristallisering pipetteras en droppe protein lösning i mitten av en täckslip och blandas med en droppe kristalliserings cocktail, som vanligt vis består av en buffert (t. ex. Tris-HCl, Hepes) och en utfällande (t. ex. polyetylenglykol, ammonium eller sulfat). En droplet av inhibitor lösning för co-kristallisering (såsom oxalat i detta protokoll) kan eventuellt tillämpas. Täckglasen placeras sedan upp och ner ovanför en brunn av reservoar innehåll ande kristalliserings cocktail, tätning av brunnen lufttät med hjälp av tätnings olja (figur 6b). Helst sker ingen nederbörd inom den droppe i början av experimentet vilket innebär att proteinet förblir i lösning. Eftersom precipitationskoncentrationen i reservoaren är högre än i DROPPEN, börjar droppen att tappa vatten genom avdunstning i brunnen tills jämvikt med reservoaren uppnås. Spridningen av vatten i reservoaren orsakar en långsam volym minskning av minskningen som i sin tur orsakar en ökning av både protein och utfällande koncentration i DROPPEN. Om protein lösningen når det tillstånd som krävs av Super-mättnad och därmed meta-stabilitet, spontan kärn bildning följt av kristall tillväxt kan inträffa. Att nå övermättat tillstånd är ett nödvändigt men inte tillräckligt villkor för kristallisation. Kristallisation av proteiner behöver båda, gynnsamma termodynamiska och kinetiska förhållanden, och tungt beror på de oförutsägbara egenskaperna hos proteinet som skall kristalliseras22.

Ändringar och fel sökning

Uttryck av protein i E. coli kan vara ineffektiv. Varierande IPTG-koncentrationer, uttrycks temperatur och förstärknings tid, till exempel rums temperatur i flera timmar eller i kallt rum över natten, kan behöva testas för varje nytt protein för att hitta optimala förhållanden. Utfällning av protein i inklusionssamorgan observeras ibland för mer hydrofoba FAHD-proteiner. I sådana fall rekommenderas protein uttryck i andra modell system som insektsceller, eftersom inkluderingkroppar är mindre benägna att bilda26.

Eftersom FAHD-proteiner är känsliga för salt-och kofaktorkoncentrationer, samt pH-värde, kan renings strategier för olika homologer, ortologer och punktmutationsvarianter skilja sig åt i enskilda miljöer. De beskrivna renings metoderna är utvecklade för det vildtyps-humana och mus FAHD1 proteinet. Koncentrationer av kemikalier, såsom NaCl och Imidazol, samt pH, kan behöva anpassas för enskilda proteiner med en annan isoelektrisk punkt (pI). Också notera, inte varje hans-märkta protein kan binda väl till en ni-nta harts. Om proteinbindningen till ni-NTA-kolonnen är ineffektiv, kan anpassade koncentrationer av NaCl och Imidazol, samt varierande pH-förhållanden i den löpande bufferten för ni-NTA, bidra till att förbättra kvaliteten på resultatet. Om inte, hoppa över ni-NTA steg och gå vidare till den joniska växlingskromatografi kan också leda till en framgångs rik renings strategi. Om ett protein binder till ni-NTA-kolonnen men inte kan elueras från kolonnen, kan tillsats av några mM EDTA hjälpa till att störa ni2 + -komplexet.

När det gäller processen för kristallisation, måste det förstås att själv organisering av stora och komplexa protein molekyler i en regelbunden periodiska gitter är en inneboende osannolikt process som är starkt beroende av svårt att kontrol lera kinetiska parametrar. Även små förändringar i set-up som används för kristallisation kan dramatiskt förändra resultatet och inga kristaller kommer att bildas. Protein renhet är i allmänhet av största vikt. Som en tumregel, en tungt överbelastad SDS-PAGE gel bör inte Visa andra band. Sekvensen där åtgärder utförs kan också påverka resultatet. Som ett exempel, för att säkerställa reproducerbarhet, är det ofta nödvändigt att hålla pipettsekvensen samma, sedan först tillsätt proteinet, och slutligen lägga utfällande till kristallisation droplet (eller tvärtom). Oavsett vilken metod som används, bör den hållas densamma när du försöker reproducera eller skala upp experiment. Om inga kristaller observeras efter detta protokoll, kan den kemiska utfällande sammansättning, pH, droppe storlek, och protein-till-precipitat förhållandet varieras i små steg. Tålamod och konsekventa observationer av dropparna är dygd.

Anmärkningar till katalytiska mekanismer av FAHD1

De presenterade metoderna har utvecklats speciellt för att erhålla FAHD1 proteiner av hög kvalitet. Detta möjliggjorde tillväxt av FAHD1 kristaller såväl som iscensätta av kristaller som innehåller FAHD1 komplex till en inhibitor (oxalate, PDB: 6fog). Röntgen strukturerna ger en 3D-arkitektur av enzymets katalytiska hålighet. Dessa resultat ger en omfattande beskrivning av rester som kan vara viktiga för den katalytiska mekanismen hos detta spännande enzym. FAHD1 beskrevs först för att kunna klyva acylpyruvates (acetylpyruvate, fumarylpyruvate)11. Senare, det konstaterades att FAHD1 fungerar också som en dekarboxylas av oxaloacetat12. Även om substrat acylpyruvate och oxaloacetat är olika kemiska bestånds delar, den kemiska transformationer dela mekanistiskt den strategiska klyvning av en gemensam enda C3-c4 Bond, energiskt underlättat om C3 -C4 Bond orbitaler bo ortogonal till π-orbitaler av C2-Carbonyl15. En sådan kon formation tillåter resonans stabilisering av C3-carbanion övergående bildas under klyvning processen. De FAHD1 substrat (oxaloacetat och acylpyruvates) är flexibla molekyler och kan finnas i tautomeriska (keto-Enol) samt C2-hydrerade former (figur 9a). Equilibrien mellan de olika arterna bestäms huvudsakligen av arten av buffertsammansättning som används, pH och förekomst av metall joner. I det följande diskuterar vi hypotetiska mekanistiska scenarier inspirerade från analys av röntgen kristall strukturer som avslöjade den katalytiska centrum av FAHD1.

Figure 9
Figur 9 : Detaljer om den föreslagna katalytiska mekanismen för mänskliga FAHD1.
(A) oxaloacetat finns i kris tal lin tillstånd samt i neutral lösning huvudsakligen i Z-Enol form24. Emellertid under Fysiologiskt pH-villkorar 2en-keto bildar är den dominera framställningen25. (B) kemisk skiss av hFAHD1 hålighet15 med mg-bundet oxaloacetat (vänster) och acylpyruvate (höger, med R1 som organisk vila; den röda pilen betecknar en nukleofil attack av angränsande stabiliserad vatten molekyl) (se diskussion). (C) jämförelse av gynnade kon formationer för C3-c4 klyvning i dekarboxylas (b till c) och hydrolas (b ' till C) mekanism av FAHD1: båda processerna resulterar i mg-complexed pyruvate-enolat (se diskussion). Intermediaterna b och b förväntas stabiliseras med Q109, enligt skiss i panel B (se diskussion). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Den decarboxylase aktiviteten hos FAHD1

Oxaloacetat finns i kristallint tillstånd samt i neutral lösning främst i Z-Enol form24. Men det visades att under fysiologiska pH-villkor (buffertförhållanden vid pH 7,4) den 2-keto formen är den dominerande representationen av oxaloacetat25 (figur 9a), och att enolization är inte en förutsättning för dekarboxylering27 . Av anmärkning, mg2 + joner har ingen inverkan på förhållandet mellan de oxaloacetat arterna vid ett pH av 7,4 eller under28. Införlivandet av oxaloacetat keto form i den katalytiska centrum av FAHD1 (styrs av den bundna oxalat i det komplexerade enzymet (PDB: 6FOG15)) avslöjade rester Q109 som en överensstämmandet regulator av den bundna oxaloacetat15. Som beskrivs i en annan artikel15, vätebindning till karbamol grupp Q109 stabiliserar en oxaloacetat-kon formation till följd av rotation runt C2-C3 Bond (figur 9b, vänster panel). Som en följd av denna rotation, C3-C4 Bond (att klyvas) antar en nära ortogonala disposition i förhållande till π-orbitaler av c2-Carbonyl (figur 9c). Koldioxid kan släppas ut. Den primära produkten av denna process skulle vara resonans stabiliserad mg-enolate av Pyruvat. Det är känt från undersökningar av oxaloacetat-mg komplex att enolate bildar den mest stabila komplex28,29. Förutsatt en jämförbar stabilitet för en mg-pyruvate enolate-komplex kofaktor av FAHD1 kunde blockeras, men lysinrester K123 kan protonate den pyruvate-enolate i en jämvikt för att förbjuda förlust av kofaktor15.

Den givna tolkningen antyder Pyruvat Enol som en distinkt mellanliggande i den katalytiska ODX funktion FAHD1. I detta steg i hypoteser modell, experimentella data ger inte någon ytterligare indikation på varför det slutna locket bör öppna för att frigöra produkten. Det kan dock härledas att den föreslagna mekanismen ser ut som en enzym hämning av produkten: kristall strukturen avslöjar en bevarade vatten molekyl som hålls i riktad riktning mot FAHD1 katalytiska centrum av rester H30 och E33 som presenteras i en kort Helix15, som induceras på ligand bindning och lock stängning. Om den primära Enol skulle stanna i en jämvikt med enolat, den resonans stabiliserade enolate kunde släckas till Pyruvat av vatten molekylen. Den resulterande hydroxylgrupp skulle vara kapabel att förflytta Pyruvat från mg-cofactor på vilken locket skulle öppna. Slutligen skulle den katalytiska centrum återställas i mitokondriell miljö. I detta hypotetiska scenario skulle kaviteten vatten molekyl fungera som en syra, respektive.

Hydrolase aktivitet av FAHD1

Hydrolase aktivitet av ett enzym kräver implicit den mellanliggande bildandet av en hydroxylnucleophile. Denna mekanism finns vanligt vis i kombination med syra-bas katalytisk aktivitet. Över gångs tillståndet för reaktionen måste förberedas via kon Formations kontroll av kritiska aminosyrans sido kedjor i håligheten. I analogi med diskussionen om dekarboxylas funktion, enzym-bundna acylpyruvate i 2-keto form kommer att sättas under kon Formations kontroll av väte-bindning av 4-karbonyl syre till Q109 (figur 9b, höger panel). Kristallen struktur oxalate-bunden FAHD1 (PDB: 6FOG) avslöjar en bevarade vatten molekyl som hålls i riktning riktning mot FAHD1 katalytiska centrum av rester H30 och E33 presenteras i en kort Helix15. Den E33-H30 dyad är behörig att deprotonate riktad placerad vatten och den resulterande hydroxylgrupp är i ideal disposition för att attackera 4-Carbonyl av acylpyruvate presenteras under överensstämningskontroll med Q10915.

En liknande mekanism har föreslagits för FAH18. Angrepp av hydroxylnucleophile förväntas resultera i en oxyanion arter, som stabiliseras vid orbital kontrollerad C3-C4 Bond klyvning (figur 9c). I denna modell, C3-C4 Bond rotation (figur 9c) händer efter den nukleofiliska attacken av bildade hydroxylgrupp anges i figur 9b (dvs, det förbereder acylpyruvate för bindningen klyvning). De primära produkterna skulle vara ättiksyra och mg-Pyruvat enolate. I detta hypotetiska scenario, ättiksyra kunde släcka Enol till Pyruvat och därefter hjälpa förskjutning av produkten. Ovanför ett pH av 7,5 och i närvaro av mg joner, acylpyruvates finns i en jämvikt mellan keto-och Enol-former, den senare i liten preferens30. Troligen båda formerna är kapabla att binda till kofaktor av FAHD1 under påföljande lock stängning. Behandling av enolsyra acylpyruvate substrat av enzymet hämmas på grund av den plana strukturen av Enol-form. C3-C4 klyvning skulle resultera i en papperba carbanion utan resonans stabilisering.

Därför föreslår vi en katalytisk ketonization steg för att förbereda sig för angrepp av hydroxylnucleophile på Acyl Carbonyl. Denna process av ketonization skulle dock kräva kontroll över Proton införlivandet av FAHD1 rester, vilket skulle tillskriva en inneboende Isomerase aktivitet till FAHD1. Det rapporteras att surheten hos mg-bunden Enol väte avslöjar en 10000-faldig ökning jämfört med den un-komplexerade formen28. En deprotonation av mg bunden Enol-form skulle vara genomförbart genom un-protonated K123. Deprotonation av K123 kan biträdas av karboxylatet av D102. Ett väteobligationsnät bestående av rester D102-K47-K123 skulle kunna fungera som det nödvändiga protonreläet i den katalytiska mitten av FAHD115. En sådan-bildade mellanliggande enolate kunde därefter släckas av en E33-H30-H20 triad under ketonization av substraten15. Den 2-keto form skulle komma under överensstämme kontroll av Q109, och den samtidigt bildade hydroxylgrupp skulle attackera Acyl Carbonyl. Den sammanfattade diskussionen innebär en kontroll av FAHD1 om en vatten molekyl för att växla mellan syra och bas genom samspel mellan kavitetsbildande rester.

Framtida tillämpningar eller anvisningar för metoden

Framtida tillämpningar av de metoder som beskrivs här är många. En uppsjö av prokaryotiska medlemmar i FAH superfamiljen väntar fortfarande funktionell karakterisering. Till och med den tillgängliga informationen om den katalytiska verksamheten hos kända superfamiljmedlemmar i FAH är knapp och i de flesta fall baserad på teoretiska antaganden snarare än experimentella data. Tillämpning av de metoder som beskrivs här för prokaryotiska Fah superfamiljen medlemmar beror på de specifika forsknings intressen i bakteriologi. Å andra sidan, den senaste tidens demonstration att eukaryota Fah superfamiljen medlemmar spela viktiga roller i olika cellulära fack (t. ex. Cytosol vs mitokondrier) belyser behovet av att bättre karakterisera dessa proteiner (varav tre har varit identifierats hittills), särskilt eftersom aktuella data tyder på att vissa okaraktäriserade proteiner kan utföra olika funktioner i samband med mitokondriell biologi, åldrande forskning och cancer forskning. Det föreslås att den fullständiga molekyl ära och fysiologiska karakteriseringen av dessa eukaryotiska FAH superfamiljemedlemmar kan ge viktig insikt i viktiga områden av samtida forskning inom den biomedicinska sektorn. Mer forskning om mekanismerna för FAHD1 (och relaterade enzymer) behövs för att bättre förstå mekanismerna bakom bi-funktionaliteten hos FAHD1, som fortfarande inte är helt klarlagt. Ytterligare studier med FAHD1 mutanter, NMR-utredningar, och strukturella studier på inhibitor komplex kan bidra till att lösa de verkliga mekanistiska scenarier som FAHD1 verkar vara kompetent. Dessutom, datorstödd design av Enol härmar kan binda till mg-kofaktor kommer så småningom att leda till potenta hämmare av FAHD1.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja och inte deklarera några konkurrerande ekonomiska intressen. H. G. är CEOCSO på MoleculeCrafting. kram EU och förutsatt acylpyruvates för denna studie via anpassad syntes. Arbetet i P. J. D. ' s Lab stöddes av den österrikiska Science Fund (FWF): projekt nummer P 31582-B26. Publicerings avgifterna för detta manuskript har delvis täckts av den österrikiska vetenskaps fonden (FWF) under projekt nummer P 31582-B26. A. N. och B. R. stöttas av den österrikiska vetenskaps fonden (FWF) under projektera P28395-B26.

Acknowledgments

Författarna är mycket tacksamma för expert tekniskt bistånd av Annabella Pittl och pilot metod utveckling av Haymo Pircher.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21(DE3) pLysS competent E. coli Promega L1195 High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site
pET E. coli T7 Expression Vectors MERCK - http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav
0.45 µm filter units MERCK SLHP033NS Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril
0.22 µm filter units MERCK SLGP033RS Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril
Eppendof tubes 1.5 mL VWR 525-1042 microcentrifugal tubes; autoclaved
15 mL Falcon VWR 734-0451 centrifugal tubes
50 mL Falcon VWR 734-0448 centrifugal tubes
PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro VWR 30622-758 VIS transparent cuvettes
UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro VWR 47727-024 UV/VIS transparent cuvettes
isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) ROTH 2316 chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system
imidazole ROTH X998 chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin
Glass Econo-Column Columns Bio-Rad - http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&pcp_loc=catprod
chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378 antibiotic for bacterial growth selection; resistance endióded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 µg/mL final concentration
kanamycin Sigma-Aldrich 60615 antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 µg/mL final concentration
ampicillin Sigma-Aldrich A1593 antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 µg/mL final concentration
Ultra-15, MWCO 10 kDa Sigma-Aldrich Z706345 centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de®ion=AT
Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units Sigma-Aldrich Z677108 centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&region=AT&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2
oxaloacetic acid Sigma-Aldrich O4126 TCA metabolite
sodium oxlalate Sigma-Aldrich 71800 a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes
Dialysis tubing cellulose membrane Sigma-Aldrich D9277 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable
Ni-NTA agarose Thermo-Fischer R90101 a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence
96-Well UV Microplate Thermo-Fischer 8404 UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo-Fischer 26616 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616
ÄKTA FPLC system GE Healthcare Life Sciences - using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system
HiTrap Phenyl HP column GE Healthcare Life Sciences - https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630
Mono S 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences - https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723
Mono Q 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences - https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608
HiLoad Superdex column 75 pg (G75) GE Healthcare Life Sciences - https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800
HiLoad Superdex column 200 pg (G200) GE Healthcare Life Sciences - https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283
TECAN microplate reader TECAN Life Sciences - https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers
acetylpyruvate MoleculeCrafting.HuGs e.U. - custom synthesis
benzoylpyruvate MoleculeCrafting.HuGs e.U. - custom synthesis
VDX™ plate (24 wells) Hampton HR3-142 24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion
paraffin oil Hampton HR3-411 used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion
coverslips (22 mm) Karl Hecht KG 14043 coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion
Luria broth (LB) medium self-prepared - a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar
NZCYM medium self-prepared - a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4
Luria broth (LB) agarose plates self-prepared - autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/
Ni-NTA running buffer self-prepared - 20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
Ni-NTA elution buffer self-prepared - 20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
HIC running buffer self-prepared - 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7
HIC running buffer AS self-prepared - HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0
Mono S low salt buffer self-prepared - 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
Mono S high salt buffer self-prepared - 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
Mono Q low salt buffer self-prepared - 20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0
Mono Q high salt buffer self-prepared - 20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0
G75 / G200 running buffer self-prepared - 15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4
enzyme assay buffer self-prepared - 50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2
protein crystallization buffer self-prepared - G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT
reservoir solution for crystallization self-prepared - 100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brouns, S. J. J., et al. Structural Insight into Substrate Binding and Catalysis of a Novel 2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate Dehydratase Illustrates Common Mechanistic Features of the FAH Superfamily. Journal of Molecular Biology. 379, 357-371 (2008).
  2. Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase. Structure (London, England: 1993). 7, 1023-1033 (1999).
  3. Weiss, A. K. H., Loeffler, J. R., Liedl, K. R., Gstach, H., Jansen-Dürr, P. The fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) superfamily of enzymes: multifunctional enzymes from microbes to mitochondria. Biochemical Society Transactions. 46, 295 (2018).
  4. Guimarães, S. L., et al. Crystal Structures of Apo and Liganded 4-Oxalocrotonate Decarboxylase Uncover a Structural Basis for the Metal-Assisted Decarboxylation of a Vinylogous β-Keto Acid. Biochemistry. 55, 2632 (2016).
  5. Zhou, N. Y., Fuenmayor, S. L., Williams, P. A. nag genes of Ralstonia (formerly Pseudomonas) sp. strain U2 encoding enzymes for gentisate catabolism. Journal of Bacteriology. 183, 700 (2001).
  6. Izumi, A., et al. Structure and Mechanism of HpcG, a Hydratase in the Homoprotocatechuate Degradation Pathway of Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 370, 899-911 (2007).
  7. Manjasetty, B. A., et al. X-ray structure of fumarylacetoacetate hydrolase family member Homo sapiens FLJ36880. Biological Chemistry. 385, 935-942 (2004).
  8. Tame, J. R. H., Namba, K., Dodson, E. J., Roper, D. I. The crystal structure of HpcE, a bifunctional decarboxylase/isomerase with a multifunctional fold. Biochemistry. 41, 2982-2989 (2002).
  9. Ran, T., et al. Crystal structures of Cg1458 reveal a catalytic lid domain and a common catalytic mechanism for the FAH family. The Biochemical Journal. 449, 51-60 (2013).
  10. Ran, T., Wang, Y., Xu, D., Wang, W. Expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of Cg1458: A novel oxaloacetate decarboxylase from Corynebacterium glutamicum. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 67, 968-970 (2011).
  11. Pircher, H., et al. Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase. Journal of Biological Chemistry. 286, 36500-36508 (2011).
  12. Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290, 6755-6762 (2015).
  13. Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells. Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).
  14. Etemad, S., et al. Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 – a new regulator of mitochondrial function and senescence. Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).
  15. Weiss, A. K. H., et al. Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1. Biochemical Journal. 475, 3561-3576 (2018).
  16. Taferner, A., et al. FAH domain-containing protein 1 (FAHD-1) Is required for mitochondrial function and locomotion activity in C. elegans. PLoS ONE. 10, 1-15 (2015).
  17. Mizutani, H., Kunishima, N. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63, 792-794 (2007).
  18. Bateman, R. L., Bhanumoorthy, P., Witte, J. F., McClard, R. W., Grompe, M., Timm, D. E., et al. Mechanistic Inferences from the Crystal Structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a Bound Phosphorus-based Inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 276, 15284-15291 (2001).
  19. Zeng, F., et al. Efficient strategy for introducing large and multiple changes in plasmid DNA. Scientific Reports. 8, 1714 (2018).
  20. Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Research. 16, 7351-7367 (1988).
  21. Jansen-Duerr, P., Pircher, H., Weiss, A. K. H. The FAH Fold Meets the Krebs Cycle. Molecular Enzymology and Drug Targets. 2, 1-5 (2016).
  22. Rupp, B. Origin and use of crystallization phase diagrams. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71, 247-260 (2015).
  23. Rupp, B. Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , Garland Science. (2010).
  24. Flint, D. H., Nudelman, A., Calabrese, J. C., Gottlieb, H. E. Enol oxalacetic acid exists in the Z form in the crystalline state and in solution. The Journal of Organic Chemistry. 57, 7270-7274 (1992).
  25. Pogson, C. I. I., Wolfe, R. G. G. Oxaloacetic acid tautomeric and hydrated forms in solution. Biochemical and Biophysical Research Communications. 46, 1048-1054 (1972).
  26. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L., Kost, A. T. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).
  27. Steinberger, R., Westheimer, F. H. Metal Ion-catalyzed Decarboxylation: A Model for an Enzyme System 1. Journal of the American Chemical Society. 73, 429-435 (1951).
  28. Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. The stability constants of the magnesium complexes of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25. Journal of Chemical Society. , 1381-1389 (1964).
  29. Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. The acid dissociations of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25. Journal of Chemical Society. 1372, 1380 (1964).
  30. Brecker, L., et al. Synthesis of 2,4-diketoacids and their aqueous solution structures. New Journal of Chemistry. 23, 437-446 (1999).

Tags

Biokemi FAH FAHD FAHD1 ODx ApH hydrolase decarboxylase oxaloacetat acetylpyruvat fumarylpyruvat acylpyruvate oxalat Pyruvat MiDAS
Uttryck, rening, kristallisering, och enzym analyser av Fumarylacetoacetat Hydrolase Domain-innehållande proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weiss, A. K. H., Holzknecht, M.,… More

Weiss, A. K. H., Holzknecht, M., Cappuccio, E., Dorigatti, I., Kreidl, K., Naschberger, A., Rupp, B., Gstach, H., Jansen-Dürr, P. Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins. J. Vis. Exp. (148), e59729, doi:10.3791/59729 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter