fumarylacetoaceate hydrolase डोमेन युक्त प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शुद्धि उदाहरण के साथ वर्णित है (ई. कोलाईमें अभिव्यक्ति , FPLC). शुद्ध प्रोटीन क्रिस्टलीकरण और एंटीबॉडी उत्पादन के लिए उपयोग किया जाता है और एंजाइम assays के लिए कार्यरत हैं. चयनित photometric परख oxaloaceate decarboxylase और acylpyruvate hydrolase के रूप में FAHD1 की बहु कार्यक्षमता प्रदर्शित करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं.
फ्यूमैरिलेस्टोऐसीटेट हाइड्रोलेस (एफएएच) डोमेन युक्त प्रोटीन (एफएएचडी) यूकैरियोट में एफएएच सुपरफैमिली के सदस्यों की पहचान की जाती है। इस superfamily के एंजाइमों आम तौर पर बहु कार्यक्षमता प्रदर्शित, मुख्य रूप से hydrolase और decarboxylase तंत्र को शामिल. यह लेख एफएएचडी प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए लगातार तरीकों की एक श्रृंखला प्रस्तुत करता है, मुख्य रूप से एफएएचडी प्रोटीन 1 (एफएएचडी1) प्रजातियों के बीच ऑर्थोलॉग (मानव, माउस, सूत्रकृमि, पौधे, आदि)। कवर तरीकों ई कोलाई,आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी, आयन विनिमय क्रोमैटोग्राफी, तैयारी और विश्लेषणात्मक जेल निस्पंदन, क्रिस्टलीकरण, एक्स-रे विवर्तन, और photometric परख में प्रोटीन अभिव्यक्ति कर रहे हैं। शुद्धता के उच्च स्तर का केंद्रित प्रोटीन (gt; 98%) क्रिस्टलीकरण या एंटीबॉडी उत्पादन के लिए नियोजित किया जा सकता है. समान या निम्न गुणवत्ता के प्रोटीन एंजाइम assays में नियोजित किया जा सकता है या पता लगाने प्रणाली में प्रतिजन के रूप में इस्तेमाल किया (पश्चिमी ब्लॉट, एलिसा). इस कार्य की चर्चा में, FAHD1 की पहचान एंजाइमी तंत्र और अधिक विस्तार में अपने hydrolase और decarboxylase द्वि-कार्यक्षमता का वर्णन करने के लिए रेखांकित कर रहे हैं.
फुमरीलेटोऐसीट हाइड्रोलेस (एफएएच)1,एंजाइमों के2 सुपरफैमिली एंजाइमों के एक समूह का वर्णन करते हैं जो अत्यधिक संरक्षित उत्प्रेरक एफएएच डोमेन3,4,5,6 का हिस्सा है , 7 , 8 , 9 , 10.अपने सामान्य उत्प्रेरक केंद्र के बावजूद, ये एंजाइम बहु-कार्यात्मक होते हैं, और अधिकांश प्रोकैरियोट में पाए जाते हैं, जहां उनका उपयोग जटिल कार्बन स्रोतों से प्राप्त यौगिकों को तोड़ने के लिए किया जाताहै 3. इस परिवार के केवल तीन सदस्यों की पहचान अब तक यूकैरियोट में की गई है: एफएएच2देने का नाम, साथ ही साथ एफएएच डोमेन युक्त प्रोटीन 1 (एफएएफडी1)11,12,13,14 ,15 और FAH डोमेन युक्त प्रोटीन 2 (FAHD2). FAHD1 की कमी बिगड़ा mitochondrial श्वसन13के साथ जुड़ा हुआ है 13,16 और सेलुलर जीर्णता phenotypeके एक प्रतिवर्ती प्रकार के साथ जुड़ा हुआ है कि मध्यवर्ती क्षमता से जुड़ा हुआ है इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली में कमियों. मानव FAHD1 और मॉडल सिस्टम में इसके orthologues (माउस, सूत्रकृमि, कैंसर सेल लाइनों, पौधों, आदि), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चयनित बिंदु उत्परिवर्तन वेरिएंट, संभावित हित के drugable लक्ष्य बन गए हैं. इस शोध के लिए, शुद्धता के उच्च स्तर पर रिकॉमबिनेंट प्रोटीन, साथ ही क्रिस्टल संरचनाओं और चयनात्मक एंटीबॉडी द्वारा निर्देशित उत्प्रेरक तंत्र पर जानकारी महत्वपूर्ण हैं।
इस पांडुलिपि ई. कोलाईमें FAHD प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए तरीकों का वर्णन, आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी, आयन विनिमय क्रोमैटोग्राफी, अमोनियम सल्फेट वर्षा, पूर्वोक्ति और विश्लेषणात्मक जेल निस्पंदन, क्रिस्टलीकरण, एक्स-रे विवर्तन, और फोटोमितीय परख. यहाँ वर्णित विधियों और प्रोटोकॉल का उद्देश्य बैक्टीरिया, संयंत्र जीव विज्ञान, साथ ही पशु और मानव अध्ययन के रूप में विभिन्न क्षेत्रों में काम कर रहे वैज्ञानिकों के लिए मार्गदर्शन प्रदान करने के लिए है, FAH superfamily के सदस्यों की विशेषता, सहित असामान्य superfamily सदस्यों वे एक विशेष क्षेत्र में प्रासंगिक हो जाना चाहिए. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल अन्य prokaryotic या यूकैरियोटिक एफए superfamily सदस्यों की विशेषता के लिए लक्ष्य परियोजनाओं के लिए मूल्यवान समर्थन प्रदान कर सकते हैं.
यहाँ वर्णित तरीकों के पीछे तर्क तथ्य यह है कि खराब वर्णित प्रोटीन की विशेषता के लिए (विशेष रूप से, अज्ञात शारीरिक प्रासंगिकता के चयापचय एंजाइमों), शुद्ध पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ शुरू करने के लिए दृष्टिकोण की अनुमति देता है इस तरह के इन विट्रो सक्रिय एंजाइम की तैयारी, उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी, और चयनित एंजाइमों के लिए शक्तिशाली और विशिष्ट औषधीय अवरोधकों के रूप में अमूल्य, उच्च गुणवत्ता वाले अनुसंधान उपकरणों का विकास। वर्णित विधियों में तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (एफपीएलसी) और एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक तरीकों (उदाहरण के लिए, रासायनिक प्रेरण के बिना प्रोटीन व्यक्त करने के लिए, या गर्मी उपचार desalting और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के बाद के बाद centrifugation द्वारा प्रोटीन शुद्धि प्रदर्शित करने के लिए), कहीं और पाया जा सकता है17. जबकि तरीकों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम की अभिव्यक्ति और FAH superfamily एंजाइमों की शुद्धि के लिए उपलब्ध है2,7,9,17,18, इस काम अभिव्यक्ति पर केंद्रित है और विशेष रूप से एएफडी प्रोटीन की शुद्धि।
इस पांडुलिपि के चर्चा अनुभाग में, एएचओडी1 प्रोटीन (हाइड्रोलेस, डेकार्बोक्सिलस)15 के लिए पहचाने गए उत्प्रेरक तंत्र को और अधिक विस्तार से वर्णित किया गया है, ताकि उत्प्रेरित प्रतिक्रियाओं के रासायनिक चरित्र को प्रदर्शित किया जा सके। पिछले कामकेआधार पर प्राप्त डेटा 7,15,18 (PDB: 6FOG, PDB:6FOH) के रूप में एंजाइम की एक तीसरी गतिविधि का संकेत है keto-enol isomerase.
महत्वपूर्ण कदम
FAHD प्रोटीन नमक सांद्रता के लिए बहुत संवेदनशील हैं. कम NaCl सांद्रता में, प्रोटीन thawing पर वेग हो सकता है, लेकिन वे आम तौर पर पूरी तरह से उच्च नमक सांद्रता पर पुनर्गठन किया जा सकता है. कि है, अगर एक FAHD प्रोटीन किसी कारण के लिए वेग, यह बरामद किया जा सकता है या उच्च नमक सांद्रता के साथ refolded (gt; 300 $M). कुछ और हाइड्रोफोबिक प्रोटीन, तथापि, बरामद नहीं किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, मानव FAHD2), लेकिन ऐसे CHAPS के रूप में डिटर्जेंट (अधिकतम 1%) या ग्लिसरोल (10%) उन्हें स्थिर समाधान में रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. किसी भी मामले में, -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और भंडारण का उपयोग कर सदमे मुक्त करने की सिफारिश की है, क्योंकि यह thawing की एक कोमल और धीमी प्रक्रिया है.
चरण 3.1.10 में Ni-NTA शुद्धिकरण के दौरान कुछ अनपेक्षित समस्याएँ हो सकती हैं। नोट की, पहले नमूने की तुलना में दूसरे एकत्र नमूने में एक उच्च OD agarose राल की एक बहुत अधिक मात्रा इंगित करता है (एक नोट ले लो और अगले प्रयोग में कम राल का उपयोग करें). इसके अलावा, agarose राल ही 280 एनएम पर एक ओडी संकेत की ओर जाता है (यानी, agarose राल बिस्तर के विघटन कृत्रिम संकेत दे देंगे). संदेह के मामले में, यह प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करने के लिए एक ब्रैडफोर्ड या बीएसए परख की तरह अन्य तरीकों का उपयोग करने की सलाह दी है।
एंजाइमी परख में तीन महत्वपूर्ण पहलुओं पर विचार किया जाना है। सबसे पहले, प्रोटीन एकाग्रता का आकलन सही विशिष्ट गतिविधियों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. प्रोटीन की शुद्धता का स्तर परिणाम को प्रभावित कर रहा है और इसका अनुमान लगाने की आवश्यकता है। टैग किए गए प्रोटीन के मामले में, टैग भाग के द्रव्यमान की गणना की जानी चाहिए, और विशिष्ट गतिविधि को इसी प्रकार से ठीक किया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल के अनुभाग 7 में वर्णित सरल परख के लिए, Ni-NTA शुद्धता सक्रिय और निष्क्रिय substrates, cofactors, आदि के बीच अंतर करने के लिए पर्याप्त है अधिक जटिल माइकलिस-मेन्टेन गतिज के मामले में, सभी reactant और सब्सट्रेट सांद्रता सही ढंग से निर्धारित किया जाना चाहिए. विशेष रूप से जब oxaloacetate का उपयोग कर (जो समय के साथ ऑटो decarboxylates) प्रतिक्रिया के एंजाइमी हिस्सा ऑटो decarboxylation के लिए सही किया जाना चाहिए (इस धारणा के तहत कि दोनों प्रतिक्रियाओं को एक साथ होते हैं). सब्सट्रेट के केटो-इनोल तनातनी को संबोधित ऑप्टिकल घनत्व संकेत में प्रारंभिक परिवर्तन पर विचार किया जाना चाहिए। तीसरा, सांद्रता और मात्रा समायोजित किया जाना चाहिए. एंजाइम और सब्सट्रेट की परिभाषित सांद्रता के साथ एक प्रतिक्रिया परख मात्रा पर निर्भर विभिन्न परिणाम दे सकते हैं. यदि प्रति अच्छी तरह से बहुत अधिक एंजाइम है, तो तरल का आसंजन वास्तव में परिणाम को पूर्वाग्रह कर सकता है।
माइकलिस-मेन्टेन गतिज का आकलन करने के लिए इष्टतम संयोजन खोजने के लिए 100 डिग्री सेल्सियस, 200 डिग्री सेल्सियस, और 300 डिग्री एल बैचों में प्रारंभिक प्रयोगों को करने की सिफारिश की जाती है। इसी तरह के पहलुओं गतिज परख के लिए एंजाइम-सब्सट्रेट सांद्रता के अनुपात के लिए लागू होते हैं। सब्सट्रेट या बहुत ज्यादा सब्सट्रेट प्रति बहुत अधिक एंजाइम रैखिक स्थिर राज्य माइकलिस रेंज के बाहर प्रणाली डाल दिया. प्रारंभिक प्रयोगों के लिए इन शर्तों का अनुकूलन आवश्यक हैं. मानव FAHD1 (जंगली प्रकार) प्रोटीन के लिए अनुकरणीय समायोजन धारा 8 में प्रदान की जाती हैं, जिसके परिणामस्वरूप गतिज आरेख (उदाहरण के लिए चित्र 5Bमें प्रस्तुत किया गया है)।
क्रिस्टलीकरण के लिए प्रोटीन समाधान की एक छोटी बूंद एक coverslip के केंद्र में pipeted और क्रिस्टलीकरण कॉकटेल की एक बूंद है, जो आम तौर पर एक बफर से बना है के साथ मिश्रित है (उदाहरण के लिए, Tris-HCl, HEPES) और एक precipitant (उदाहरण के लिए, polyethylene ग्लाइकोल, अमोनियम सल्फेट)। सह क्रिस्टलीकरण के लिए अवरोध करनेवाला समाधान की एक बूंद (जैसे इस प्रोटोकॉल में oxalate के रूप में) वैकल्पिक रूप से लागू किया जा सकता है. इसके बाद कवरस्लिप को क्रिस्टलीकरण कॉकटेल युक्त जलाशय के कुएं के ऊपर उल्टा रखा जाता है, सीलेंट तेल की सहायता से अच्छी तरह से हवा को टाइट कर दिया जाता है (चित्र 6 ख) । आदर्श रूप में, कोई वर्षा प्रयोग की शुरुआत में ड्रॉप के भीतर होता है जिसका अर्थ है प्रोटीन समाधान में रहता है. चूंकि जलाशय में तेजी से एकाग्रता बूंद की तुलना में अधिक है, ड्रॉप जलाशय के साथ संतुलन तक पहुंच गया है जब तक कि अच्छी तरह से वातावरण में वाष्पीकरण से पानी खोने के लिए शुरू होता है। जलाशय में पानी के प्रसार से बूंद की धीमी मात्रा में कमी आती है जो बदले में ड्रॉप में प्रोटीन और पूर्वाभासी एकाग्रता दोनों की वृद्धि का कारण बनती है। यदि प्रोटीन समाधान सुपर संतृप्ति की आवश्यक स्थिति तक पहुँच जाता है और इस प्रकार मेटा-स्थिरता, क्रिस्टल विकास के बाद सहज नाभिक हो सकता है. अतिसंतृप्त अवस्था तक पहुंचना क्रिस्टलीकरण के लिए एक आवश्यक लेकिन पर्याप्त शर्त नहीं है। प्रोटीनों के क्रिस्टलीकरण के लिए अनुकूल ऊष्मागतिक और गतिज दोनों स्थितियों की आवश्यकता होती है और यह प्रोटीन के अप्रत्याशित गुणों पर निर्भर करता है जिसे क्रिस्टलीकृतकियाजा सकता है।
संशोधन और समस्या निवारण
ई. कोलाई में प्रोटीन की अभिव्यक्ति अक्षम हो सकती है। विभिन्न IPTG सांद्रता, अभिव्यक्ति तापमान, और प्रवर्धन समय, इस तरह के कई घंटे के लिए कमरे के तापमान के रूप में या रात भर ठंडे कमरे में, प्रत्येक नए प्रोटीन के लिए इष्टतम स्थितियों को खोजने के लिए परीक्षण किया जा करने की आवश्यकता हो सकती है. समावेशन निकायों में प्रोटीन की वर्षा कभी कभी अधिक हाइड्रोफोबिक एहद प्रोटीन के लिए मनाया जाता है। ऐसे मामलों में कीट कोशिकाओं जैसी अन्य मॉडल प्रणालियों में प्रोटीन अभिव्यक्ति की सिफारिश की जाती है क्योंकि समावेशन निकायों के26रूपमें होने की संभावना कम होती है।
के रूप में FAHD प्रोटीन नमक और cofactor सांद्रता के प्रति संवेदनशील हैं, साथ ही पीएच, विभिन्न homologues के लिए शुद्धि रणनीतियों, orthologues, और बिंदु उत्परिवर्तन वेरिएंट अलग-अलग सेटिंग्स में अलग हो सकता है. वर्णित शुद्धि विधियों जंगली प्रकार मानव और माउस FAHD1 प्रोटीन के लिए विकसित कर रहे हैं. NaCl और imidazole के रूप में रसायनों की सांद्रता, साथ ही पीएच, एक अलग isoelectric बिंदु (pI) के साथ व्यक्तिगत प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा करने के लिए हो सकता है. इसके अलावा ध्यान दें, नहीं हर उसकीटैग प्रोटीन एक Ni-NTA राल के लिए अच्छी तरह से बाध्य कर सकते हैं. यदि Ni-NTA स्तंभ के लिए प्रोटीन बाध्यकारी अक्षम है, NaCl और imidazole के अनुकूलित सांद्रता, साथ ही साथ Ni-NTA चल बफर में पीएच शर्तों अलग परिणाम की गुणवत्ता में सुधार करने में मदद मिल सकती है. यदि नहीं, तो Ni-NTA कदम लंघन और आयनिक विनिमय क्रोमैटोग्राफी के कदम पर आगे बढ़ने भी एक सफल शुद्धि रणनीति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. यदि कोई प्रोटीन नी-एनटीए कॉलम से बांधता है लेकिन कॉलम से हटाया नहीं जा सकता है, तो कुछ एमएम EDTA के अलावा Ni2+ जटिल को बाधित करने में मदद मिल सकती है।
क्रिस्टलीकरण की प्रक्रिया के संबंध में, यह समझने की जरूरत है कि एक नियमित आवधिक जाली में बड़े और जटिल प्रोटीन अणुओं के आत्म संगठन एक स्वाभाविक संभावना नहीं प्रक्रिया है कि गतिज मापदंडों को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल पर भारी निर्भर करता है. क्रिस्टलीकरण के लिए इस्तेमाल किया सेट अप में भी छोटे परिवर्तन नाटकीय रूप से परिणाम बदल सकते हैं और कोई क्रिस्टल के रूप में होगा. प्रोटीन शुद्धता आम तौर पर सर्वोपरि महत्व का है. अंगूठे के एक नियम के रूप में, एक भारी ओवरलोडेड एसडीएस-पेज जेल अन्य बैंड नहीं दिखाना चाहिए। साथ ही, अनुक्रम जिसमें चरण निष्पादित किए जाते हैं परिणाम को प्रभावित कर सकता है। एक उदाहरण के रूप में, reproducibility सुनिश्चित करने के लिए, यह अक्सर एक ही pipeting अनुक्रम रखने के लिए आवश्यक है, तो पहले प्रोटीन जोड़ने के लिए, और अंत में क्रिस्टलीकरण छोटी बूंद (या इसके विपरीत) के लिए precipitant जोड़ें. जो भी विधि का इस्तेमाल किया, यह एक ही रखा जाना चाहिए जब पुन: पेश करने या पैमाने पर प्रयोगों की कोशिश कर रहा. यदि इस प्रोटोकॉल का पालन करने वाले कोई क्रिस्टल नहीं देखे जाते हैं, तो रासायनिक वेग वेग संरचना, पीएच, ड्रॉप साइज और प्रोटीन-टू-प्रीसिटेट अनुपात को छोटी वेतन वृद्धि में अलग-अलग किया जा सकता है। धैर्य और बूंदों के लगातार टिप्पणियों पुण्य के हैं.
FAHD1 के उत्प्रेरक तंत्र के लिए टिप्पणी
प्रस्तुत तरीकों विशेष रूप से उच्च गुणवत्ता के FAHD1 प्रोटीन प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया है. यह FAHD1 क्रिस्टल के विकास के साथ ही FAHD1 युक्त क्रिस्टल की इंजीनियरिंग एक अवरोध करनेवाला (oxalate, PDB:6FOG) के लिए जटिल सक्षम. एक्स-रे संरचनाओं एंजाइम के उत्प्रेरक गुहा के एक 3 डी वास्तुकला प्रदान करते हैं। इन परिणामों के अवशेषों का एक व्यापक विवरण स्थापित संभावित इस पेचीदा एंजाइम के उत्प्रेरक तंत्र के लिए महत्वपूर्ण है. FAHD1 पहले acylpyruvates (acetylpyruvate, fumarylpyruvate)11छोड़ने में सक्षम होने के लिए वर्णित किया गया था। बाद में, यह पाया गया कि FAHD1 oxaloacetate12के एक decarboxylase के रूप में भी चल रही है. यद्यपि उपस्थाएं ऐसिलपिरुवट और ऑक्सोएसेट विभिन्न रासायनिक moieties हैं, रासायनिक परिवर्तन एक आम एकल सी3-सी4 बांड के रणनीतिक दरार को साझा करते हैं, ऊर्जावान रूप से यदि सी3 -C4 आबंध कक्षक C 2-कार्बोनिल15के र्-कक्षकों में लंबकोणीय रहते हैं। इस तरह के एक अनुरूपता सी3-carbanion क्षणिक दरार प्रक्रिया के दौरान गठित की अनुनाद स्थिरीकरण की अनुमति देता है. FAHD1 substrates (oxaloacetate और acylpyruvates) लचीला अणु हैं और tautomeric में मौजूद हो सकता है (केटो-इनोल) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सी2-hydrated रूपों (चित्र 9A) . विभिन्न प्रजातियों के बीच संतुलन मुख्य रूप से प्रयुक्त बफर संरचना, पीएच और धातु आयनों की उपस्थिति की प्रकृति द्वारा निर्धारित किया जाता है। निम्नलिखित में हम X-रे क्रिस्टल संरचनाओं जो FAHD1 के उत्प्रेरक केंद्र का खुलासा के विश्लेषण से प्रेरित hypothetic मशीनी परिदृश्यों पर चर्चा.
चित्र 9 : मानव FAHD1 के प्रस्तावित उत्प्रेरक तंत्र पर विवरण.
(क) ऑक्सोलोऐसीटेट क्रिस्टलीय अवस्था के साथ-साथ तटस्थ विलयन में मुख्य रूप से जेड-इनॉल रूप24में मौजूद है। हालांकि, शारीरिक पीएच-शर्तों के तहत 2-केटो फार्म प्रमुख प्रतिनिधित्व25है। (बी) एचएफएएचएडी1 गुहा15 का रासायनिक स्केच, जिसमें एमजी-बाउंड ऑक्सोऐसीटेट (बाएं) और ऐसिलपिरुवट (दाएं, आर1 के साथ कार्बनिक आराम के रूप में; लाल तीर आसन्न स्थिर जल अणु के नाभिक हमले को दर्शाता है) (चर्चा देखें)। (ग) सी3-सी के लिए अनुकूल अनुरूपताओं की तुलना (बी से ग) और हाइड्रोलेस (ख से ग) एफएएचडी1 की क्रियाविधि: दोनों प्रक्रियाओं के परिणामस्वरूप एमजी-कॉम्प्लेक्सेड पाइरुटेट-इनोलेट (चर्चा देखें)। इंटरमीडिएट ख और ख’ Q109 द्वारा स्थिर होने की उम्मीद कर रहे हैं, के रूप में पैनल बी में sketched (चर्चा देखें). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
FAHD1 की डेकार्बोक्लेस गतिविधि
ऑक्सालोऐसीटेट क्रिस्टलीय अवस्था के साथ-साथ तटस्थ विलयन में मुख्य रूप से जेड-इनॉल रूप24में मौजूद है . लेकिन यह दिखाया गया था कि शारीरिक पीएच-शर्तों के तहत (पीएच 7-4 पर बफर शर्तें) 2-केटो रूप ऑक्सालोऐसीटेट25 का प्रमुख प्रतिनिधित्व है (चित्र 9 ए) और यह कि enolization decarboxylation के लिए एक शर्त नहीं है27 . ध्यान दें, डह2+ आयनों का ऑक्सालोऐसीटेट प्रजातियों के अनुपात पर 7ण्4 या28से नीचे के पीएच पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। ऑक्सोएसेटेट केटो के स्थानांतरण (संमिश्रित एंजाइम में बाउंड ऑक्सालेट द्वारा निर्देशित (पीडीबी: 6फोग15))ने बाध्य ऑक्सोएलेट15के एक अनुरूप नियामक के रूप में अवशेष Q109 का पता लगाया। जैसा कि एक अन्य अनुच्छेद15में उल्लिखित है , Q109 के कार्बेमोइल समूह में हाइड्रोजन आबंधन एक ऑक्सोऐसीटेट-अनुरूपता को स्थिर करता है जिसके परिणामस्वरूप C2-C3 आबंध के चारों ओर घूर्णन होता है (चित्र 9B, बाएँ फलक)। इस घूर्णन के परिणामस्वरूप ब्3-ब्4 आबंध (अपाख्यान होने के लिए) ब् 2-ऑर्बिटलके सापेक्ष लंबकोणीय स्वभाव को अपनाता है (चित्र 9 ब्)। कार्बन डाइऑक्साइड जारी किया जा सकता है. इस प्रक्रिया का प्राथमिक उत्पाद पाइरुटेट का अनुनाद स्थिर Mg-enolate होगा। यह ऑक्सोऐसीटेट-एमजी परिसरों की जांच से ज्ञात होता है कि एनोलेट सबसे अधिक स्थिर संकुल28,29का रूप धारण करता है। एक Mg-pyruvate enolate-complex के लिए एक तुलनीय स्थिरता को मानते हुए FAHD1 के cofactor अवरुद्ध किया जा सकता है, लेकिन lysine अवशेषK123 एक संतुलन में pyruvate-enolate प्रोटोनेट कर सकते हैं कोकारक15के नुकसान को रोकने के लिए .
दी गई व्याख्या FAHD1 के उत्प्रेरक ODx समारोह में एक विशिष्ट मध्यवर्ती के रूप में pyruvate एनॉल पता चलता है. hypothesized मॉडल में इस कदम पर, प्रयोगात्मक डेटा क्यों बंद ढक्कन उत्पाद जारी करने के लिए खुला होना चाहिए के रूप में किसी भी आगे संकेत प्रदान नहीं करता है. यह deduced हो सकता है, तथापि, कि प्रस्तावित तंत्र उत्पाद द्वारा एक एंजाइम अवरोध की तरह लग रहा है: क्रिस्टल संरचना अवशेषH30 और E33 में प्रस्तुत द्वारा FAHD1 उत्प्रेरक केंद्र की ओर दिशात्मक अभिविन्यास में आयोजित एक संरक्षित पानी अणु का पता चलता है एक लघु हेलिक्स15, जो लिगन्ड बाइंडिंग और ढक्कन बंद करने पर प्रेरित है। यदि प्राथमिक ईनोल एनोलेट के साथ संतुलन में रहता है, तो अनुनाद स्थिर एनोलेट को जल अणु द्वारा पायरुवेट में शमन किया जा सकता है। परिणामस्वरूप हाइड्रेक्सिल चिह् नक को Mg-cofactor जिस पर ढक्कन खुल जाएगा से पायरूटेट विस्थापित करने में सक्षम होगा। अंत में, उत्प्रेरक केंद्र mitochondrial वातावरण में बहाल किया जाएगा. इस hypothetic परिदृश्य में, गुहा पानी अणु क्रमशः एक एसिड के रूप में काम करेंगे.
FAHD1 की हाइड्रोलेस गतिविधि
किसी एंजाइम की हाइड्रोलेस गतिविधि के लिए एक हाइड्रैक्सिल न्यूक्लिओफील के मध्यवर्ती गठन की आवश्यकता होती है। यह तंत्र आमतौर पर एसिड-बेस उत्प्रेरक गतिविधि के संयोजन में पाया जाता है। प्रतिक्रिया की संक्रमणकालीन स्थिति गुहा में महत्वपूर्ण एमिनो एसिड साइड चेन द्वारा conformational नियंत्रण के माध्यम से तैयार किया जाना है. decarboxylase समारोह की चर्चा करने के लिए सादृश्य में, एंजाइम बाध्य acylpyruvate में 2-keto रूप में 4-कार्बोनिल ऑक्सीजन के हाइड्रोजन-बांडिंग द्वारा conformational नियंत्रण के तहत रखा जाएगा Q109 (चित्र 9B, सही पैनल). ऑक्सालेट-बाउंड एएचडी1 (PDB:6FOG) की क्रिस्टल संरचना एक संरक्षित जल अणु का पता चलता है जो एक लघु हेलिक्स15में प्रस्तुत अवशेषों H30 और E33 द्वारा FAHD1 उत्प्रेरक केंद्र की दिशा में दिशात्मक अभिविन्यास में आयोजित किया जाता है। E33-H30 dyad दिशात्मक स्थिति वाले जल को विरूपित करने के लिए सक्षम है और परिणामस्वरूप हाइड्रेक्सिल Q10915द्वारा अनुरूप नियंत्रण के तहत प्रस्तुत acylpyruvate के 4-कार्बनिल पर हमला करने के लिए आदर्श स्वभाव में है।
नोट की बात है, एएफए18के लिए इसी प्रकार का तंत्र प्रस्तावित किया गया है। हाइड्रेक्सिल न्यूक्लिओफी द्वारा हमला एक ऑक्सीएनिऑन प्रजाति में परिणाम होने की संभावना है, जो कक्षीय नियंत्रित ब्3-ब्4 आबंध दरार पर स्थिर होता है ( चित्र9 ब्)। इस निलेण्ड में ब्3-ब्4 आबंध घूर्णन (चित्र9 ब्) चित्र 9ठ में दर्शाए गए संगठित हाइड्रैक्सिल द्वारा न्यूक्लिओफिलिक आक्रमण के बाद होता है (अर्थात्, यह आबंध विदलन के लिए ऐसिलपाइरुटेट तैयार करता है)। प्राथमिक उत्पाद एसिटिक एसिड और Mg-pyruvate enolate होगा. इस hypothetic परिदृश्य में, एसिटिक एसिड pyruvate करने के लिए एनोल बुझाने और बाद में उत्पाद के विस्थापन की सहायता कर सकता है. 7ण्5 के चH के ऊपर तथा च् आयनों की उपस्थिति में ऐसिलपाइरुवट केटो- तथा इनोल-रूपों के बीच संतुलन में विद्यमान होते हैं, जो बाद में थोड़ी वरीयता30होते हैं। सबसे शायद दोनों रूपों बाद में ढक्कन बंद करने के तहत FAHD1 के cofactor के लिए बाध्य करने में सक्षम हैं. एंजाइम द्वारा enolic acylpyruvate substrates के प्रसंस्करण एनॉल रूप की सपाट संरचना के कारण बाधित है. सी3-सी4 दरार अनुनाद स्थिरीकरण के बिना एक vinylic carbanion में परिणाम होगा.
इसलिए, हम ऐसिल कार्बोनिल पर हाइड्रैक्सिल न्यूक्लिओफील के आक्रमण के लिए तैयार करने के लिए उत्प्रेरक केटोनाइजेशन चरण का प्रस्ताव करते हैं। तथापि, केटोनाइजेशन की इस प्रक्रिया में एएचएडी1 अवशेषों द्वारा प्रोटॉन स्थानांतरणों पर नियंत्रण की आवश्यकता होगी, जो एएचएडी1 के लिए एक अंतर्निहित समेमरस गतिविधि का श्रेय देगा। यह बताया गया है कि मिलीग्राम-बाउंड इनॉल हाइड्रोजन की अम्लता से संयुक्त राष्ट्र संघ के रूप28की तुलना में दस-हजार गुना वृद्धि का पता चलता है। Mg bound enol-form का एक deprotonation संयुक्त राष्ट्र द्वारा संभव होगा K123. K123 के deprotonation D102 के carboxylate द्वारा सहायता प्रदान की जा सकती है. अवशेषD102-K47-K123 द्वारा गठित एक हाइड्रोजन आबंध नेटवर्क एएचडी115के उत्प्रेरक केंद्र में आवश्यक प्रोटॉन रिले के रूप में काम कर सकता है। एक ऐसे गठित मध्यवर्ती enolate तो एक E33-H30-H20 त्रय सब्सट्रेट15के ketonization के तहत द्वारा बुझाया जा सकता है. 2-केटो रूप Q109 के अनुरूप नियंत्रण के तहत आ जाएगा, और संयोग से गठित हाइड्रैक्सिल एसिल कार्बोनिल पर हमला करेगा। संक्षेप चर्चा गुहा बनाने अवशेषों की परस्पर क्रिया के माध्यम से एसिड और आधार के बीच स्विच करने के लिए एक पानी के अणु के बारे में FAHD1 के नियंत्रण का तात्पर्य है.
भविष्य अनुप्रयोगों या विधि की दिशा
यहाँ वर्णित विधियों के भविष्य के अनुप्रयोगों के कई हैं. एफएएफ सुपर फैमिली के प्रोकैरियोटिक सदस्यों की एक बहुतायत अभी भी कार्यात्मक विशेषता का इंतजार कर रही है। यहां तक कि ज्ञात FAH superfamily सदस्यों के उत्प्रेरक गतिविधियों पर उपलब्ध जानकारी दुर्लभ है और, ज्यादातर मामलों में, सैद्धांतिक मान्यताओं के बजाय प्रयोगात्मक डेटा के आधार पर. प्रोकैरियोटिक एफए सुपरफैमिली सदस्यों के लिए यहां वर्णित विधियों का अनुप्रयोग जीवाणु विज्ञान में विशिष्ट अनुसंधान हितों पर निर्भर करता है। दूसरी ओर, हाल ही में प्रदर्शन है कि यूकैरियोटिक FAH superfamily सदस्यों विभिन्न सेलुलर डिब्बों में आवश्यक भूमिका निभाते हैं (उदाहरण के लिए, cytosol बनाम mitochondria) बेहतर इन प्रोटीन की विशेषता की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया (जिसमें से तीन किया गया है अब तक की पहचान की), विशेष रूप से, क्योंकि वर्तमान डेटा सुझाव है कि कुछ uncharacterized प्रोटीन mitochondrial जीव विज्ञान के संदर्भ में विभिन्न कार्यों को पूरा कर सकते हैं, उम्र बढ़ने अनुसंधान, और कैंसर अनुसंधान. यह प्रस्ताव है कि इन यूकैरियोटिक एफए सुपरफैमिली सदस्यों की पूर्ण आणविक और शारीरिक विशेषता जैव चिकित्सा क्षेत्र में समकालीन अनुसंधान के प्रमुख क्षेत्रों में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है। FAHD1 के तंत्र पर अधिक अनुसंधान (और संबंधित एंजाइमों) बेहतर FAHD1 की द्वि-कार्यक्षमता अंतर्निहित तंत्र को समझने की जरूरत है, जो अभी भी पूरी तरह से स्पष्ट नहीं है. FAHD1 म्यूटेंट, NMR-जांच, और अवरोधकरनेर परिसरों पर संरचनात्मक अध्ययन के साथ अतिरिक्त अध्ययन सही मशीनी परिदृश्यों जिसके लिए FAHD1 सक्षम होने लगता है को हल करने में मदद कर सकते हैं. इसके अलावा, ईनोल के कंप्यूटर सहायता प्राप्त डिजाइन Mg-cofactor करने के लिए बाध्य करने में सक्षम mimics अंततः FAHD1 के शक्तिशाली inhibitors के लिए नेतृत्व करेंगे.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों Annabella Pittl द्वारा विशेषज्ञ तकनीकी सहायता और Haymo Pircher द्वारा पायलट विधि विकास के लिए बहुत आभारी हैं.
BL21(DE3) pLysS competent E. coli | Promega | L1195 | High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site |
pET E. coli T7 Expression Vectors | MERCK | – | http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav |
0.45 µm filter units | MERCK | SLHP033NS | Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril |
0.22 µm filter units | MERCK | SLGP033RS | Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril |
Eppendof tubes 1.5 mL | VWR | 525-1042 | microcentrifugal tubes; autoclaved |
15 mL Falcon | VWR | 734-0451 | centrifugal tubes |
50 mL Falcon | VWR | 734-0448 | centrifugal tubes |
PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro | VWR | 30622-758 | VIS transparent cuvettes |
UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro | VWR | 47727-024 | UV/VIS transparent cuvettes |
isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | ROTH | 2316 | chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system |
imidazole | ROTH | X998 | chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin |
Glass Econo-Column Columns | Bio-Rad | – | http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&pcp_loc=catprod |
chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | antibiotic for bacterial growth selection; resistance endióded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 µg/mL final concentration |
kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 µg/mL final concentration |
ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 µg/mL final concentration |
Ultra-15, MWCO 10 kDa | Sigma-Aldrich | Z706345 | centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de®ion=AT |
Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units | Sigma-Aldrich | Z677108 | centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de®ion=AT&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2 |
oxaloacetic acid | Sigma-Aldrich | O4126 | TCA metabolite |
sodium oxlalate | Sigma-Aldrich | 71800 | a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes |
Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma-Aldrich | D9277 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable |
Ni-NTA agarose | Thermo-Fischer | R90101 | a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence |
96-Well UV Microplate | Thermo-Fischer | 8404 | UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates |
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | Thermo-Fischer | 26616 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616 |
ÄKTA FPLC system | GE Healthcare Life Sciences | – | using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system |
HiTrap Phenyl HP column | GE Healthcare Life Sciences | – | https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630 |
Mono S 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences | – | https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723 |
Mono Q 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences | – | https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608 |
HiLoad Superdex column 75 pg (G75) | GE Healthcare Life Sciences | – | https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800 |
HiLoad Superdex column 200 pg (G200) | GE Healthcare Life Sciences | – | https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283 |
TECAN microplate reader | TECAN Life Sciences | – | https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers |
acetylpyruvate | MoleculeCrafting.HuGs e.U. | – | custom synthesis |
benzoylpyruvate | MoleculeCrafting.HuGs e.U. | – | custom synthesis |
VDX™ plate (24 wells) | Hampton | HR3-142 | 24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion |
paraffin oil | Hampton | HR3-411 | used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion |
coverslips (22 mm) | Karl Hecht KG | 14043 | coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion |
Luria broth (LB) medium | self-prepared | – | a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar |
NZCYM medium | self-prepared | – | a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4 |
Luria broth (LB) agarose plates | self-prepared | – | autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ |
Ni-NTA running buffer | self-prepared | – | 20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins |
Ni-NTA elution buffer | self-prepared | – | 20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins |
HIC running buffer | self-prepared | – | 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7 |
HIC running buffer AS | self-prepared | – | HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0 |
Mono S low salt buffer | self-prepared | – | 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins |
Mono S high salt buffer | self-prepared | – | 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins |
Mono Q low salt buffer | self-prepared | – | 20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0 |
Mono Q high salt buffer | self-prepared | – | 20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0 |
G75 / G200 running buffer | self-prepared | – | 15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4 |
enzyme assay buffer | self-prepared | – | 50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2 |
protein crystallization buffer | self-prepared | – | G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT |
reservoir solution for crystallization | self-prepared | – | 100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2 |