Fin nål aspirasjon er en teknikk, der cellene er Hentet fra en lesjon eller organ ved hjelp av en tynn nål. Pustende materialet er smurt, beiset og undersøkt under et mikroskop for diagnose eller brukes til molekylærbiologi, flowcytometri eller in vitro analyse. Det er billig, enkel, rask og forårsaker minimale traumer.
Fine Needle aspirasjon (FNA) er en rutinemessig diagnostisk prosedyre avgjørende for både medisinsk og veterinær praksis. Den består av perkutan aspirasjon av celler og/eller mikroorganismer fra håndgripelig massene, organer eller effusions (væskeansamling i en kropp hulrom) ved hjelp av en tynn nål som ligner på den vanlige nålen brukes for venøs punktering. Materialet som samles inn av FNA er generelt svært mobilnettet, og de hentet aspirer blir deretter smurt, luft tørket, våt-fast, beiset og observert under et mikroskop. I den kliniske konteksten, er FNA et viktig diagnostisk verktøy som fungerer som en guide til den aktuelle terapeutiske ledelsen. Fordi det er enkelt, raskt, minimalt invasiv og krever begrenset investering i laboratoriet og menneskelige ressurser, er det mye brukt av veterinær utøvere, hovedsakelig i innenlandsk, men også i husdyr. I studier ved hjelp av dyremodeller, har FNA den fordelen at det kan utføres flere ganger i samme dyr, slik at langsgående studier gjennom innsamling av celler fra svulster og organer/vev i løpet av sykdommen. I tillegg til rutinemessig mikroskopi, kan Hentet materiale også brukes til immuncytokjemi, elektron mikroskopi, biokjemiske analyse, flyt flowcytometri, molekylærbiologi eller in vitro analyser. FNA har blitt brukt til å identifisere protozoan parasitten Trypanosoma brucei i gonader av infiserte mus, åpne muligheten for en fremtidig diagnose i storfe.
Fine Needle aspirasjon (FNA) er mye brukt i diagnostisering av kreft og ikke-neoplastic sykdommer, både i menneskelige og innenlandske dyr. Teknikken har blitt standardisert gjennom årene og er beskrevet i mange lærebøker1,2.
Det består i stor grad av perkutan aspirasjon av håndgripelig massene, organer eller effusions med en tynn nål montert på en tom sprøyte, ved hjelp av negativt Trykk for å trekke celler eller væske fra massen1,3. Nåler er vanligvis 22 til 25 G (gauge tilsvarende nålen indre diameter), og bruk av en større bore nål (stor diameter, f. eks, 21 G) er nyttig å øke cellularitet, selv om dette kan gi overdreven blod forurensning. Nållengde vil avhenge av dybden av massen, men 1 eller 11/2 tommer er ofte brukt for overfladiske massene. Sprøyter er vanligvis 5 til 10 mL, med større sprøyter oppnå høyere vakuum, som igjen øker aspirer yield. Ikke-håndgripelig dyptliggende massene kan også være pustende, med lengre nåler og under bilde veiledning (ultralyd). De hentet aspirer kan deretter smøres ut, lufttørkes, våt-fast, beiset og observert under et mikroskop for å oppnå en diagnose3 (figur 1).
Dette er en enkel, billig, smertefri og minimalt invasiv teknikk i hovedsak brukt i preoperativ innstillingen for å oppnå en diagnose på håndgripelig massene og også for organer, som lymfeknuter, skjoldbruskkjertelen, prostata eller til og med ytre mannlige reproduktive strukturer 1. i tillegg til å være et diagnostisk verktøy, kan denne teknikken brukes til innsamling av celler til andre formål også, nemlig cytogenetikk, elektron mikroskopi (figur 1d), Flow analytiske karakterisering4,5 ,6,7, etablering av cellekulturer8. Et vanlig eksempel i klinisk praksis er sperm henting for in vitro befruktning9.
Aspirasjon kan gjentas flere ganger i samme masse for å få flere flekker. I tilfelle av en heterogen lesjon, f. eks, et solid område og en cystisk mellomrom, er det viktig at cellene er pustende fra hver region. Materialet som samles inn av FNA er generelt svært mobilnettet, som i de fleste tilfeller gir mulighet for diagnostisering av sykdommer uten behov for en vevs biopsi. Spesielle flekker, immunofluorescence. immuncytokjemi (figur 1d), og molekylære teknikker kan også utføres i flekker innhentet gjennom Fna, for eksempel for identifisering av smittsomme midler når den ikke gjenkjennes av morfologi alene10. En kort oversikt over de generelle applikasjonene og utstyret og forsyningene som trengs for FNA er oppsummert i henholdsvis tabell 1 og 2.
Den første rapporten om bruk av nålen punktering for diagnostiske formål er beskrevet i tidlige skrifter av arabisk medisin, men det er i begynnelsen av 20th Century at moderne nål aspirasjon teknikker ble gjennomført11. Spesielt, kanskje den første rapporten som antyder bruk av FNA for diagnostisering av smittsomme sykdommer var en studie i 1904, der Grieg og Gray rapporterte nål ambisjoner av lymfeknuter fra pasienter med sovende sykdom avslørt aktive trypanosomes12 . Forfatterne rapporterte tilstedeværelsen av trypanosomes i både tidlig og avansert tilfeller, og i en høyere tetthet enn det sett i blod flekker, hvor disse er ofte sjeldne hendelser12.
Nåværende diagnostisering av Sovesyke i storfe er avhengig av direkte observasjon av parasitter i blodet, lymfe eller i immunodiagnostic teknikker13,14,15. Vi har tidligere vist at i eksperimentelle Trypanosoma infeksjoner i musen, Trypanosoma brucei (T. brucei) har en bemerkelsesverdig tropism til fettvev16 og også til noen av de ytre mannlige reproduktive strukturer, nemlig bitestikkel17. Parasitter akkumuleres i stroma av disse vev i stort antall16.
Protokollen avbildet nedenfor beskriver en detaljert trinn-for-trinn teknisk prosedyre for FNA i levende mus, rettet mot aspirasjon av trypanosomes stede i ytre mannlige reproduktive strukturer (testikkel, bitestikkel, og epididymale fett), etterfulgt av konvensjonelle Cytologi og immunostaining for spesifikke parasitt proteiner (VSG)16,17. Aspirasjon ble utført 6 dager etter at infeksjonen og sikkerhetsprosedyrer som gjelder er de som vanligvis er etablert for rutinemessig håndtering av forsøksdyr. Ytterligere tiltak er nødvendig for dyr som har uimottakelig mangler (iført en damp-sterilisert kappe, maske, hår panseret, sterile hansker, og sikre aseptisk teknikk til alle tider) for å redusere utilsiktet eksponering for opportunistiske patogener.
Fine Needle aspirasjon (FNA) er en metode mye brukt til å diagnostisere sykdom i menneskelige og innenlandske dyr. Teknikken har blitt standardisert over mange år1,2, som gjør bruk av en liten nål til å aspirer celler eller væske fra en håndgripelig masse eller organ1,3. Den aspirer er da vanligvis smurt på et glass Slide og beiset for mikroskopisk observasjon for å oppnå en diagnose, men teknikken kan også brukes til å hente celler til andre formål4,5,6, 7 andre er , 8 på alle , 9i.
Prosedyren er rask (< 5 min per mus, for en erfaren forsker) og risikoen for komplikasjoner er minimal, lik den risikoen som påløper når gjennomgår enkel venøs punktering. Av denne grunn, for FNA av håndgripelig massene, anestesi er bare nødvendig for sensitive anatomiske steder eller når en god immobilisering av dyret og stabilisering av orgelet eller massen som skal pustende er ekstremt avgjørende for optimale resultater. Dette er hyppig for små forsøksdyr, som sikker og effektiv tilbakeholdenhet av en liten gnager med en hånd samtidig som den sikrer den beste tilgangen til området for aspirasjon med den andre hånden, er vanskelig å oppnå uten anestesi. Kortsiktig anestesi er i de fleste tilfeller tilstrekkelig, likevel nødvendig, for en god FNA i musen. En god immobilisering maksimerer sjansene for å få en aspirer som er representativt for cellulære komponenter av lesjon og også minimerer sjansene for externalizing tuppen av nålen mens negativt trykk påføres.
Selv om prosedyren i seg selv er svært enkel, koordinert søknad og frigjøring av vakuum er de mest kritiske trinnene. Etter innsetting av nålen trekkes stempelet på sprøyten inn for å oppnå et kontrollert vakuum (sug), og nålen kan bare fjernes fra massen etter at det negative trykket slippes ved å slippe stempelet (figur 2); ellers aspirer suges inn i fatet av sprøyten og er så veldig vanskelig å komme seg. Et annet svært viktig skritt er utarbeidelse av høy kvalitet smøres utover. Det finnes ulike metoder for å lage en smøre, men uavhengig av metoden, smøres utover bør være forberedt umiddelbart etter at materialet er plassert på glasset. Det biologiske materialet bør spres forsiktig for å unngå celle knuse artefakter. Bruk av en dekkglass kan bidra til å forhindre disse gjenstandene. Men anvendelsen av for mye kraft samtidig som smøre vil bryte dekkglass. En god kvalitet smøre vanligvis har det meste av cellen befolkningen distribueres som monolag slik at de lett kan overføre lys. Cellular materiale bør ikke være overdrevent fanget i blodpropp.
Målet med en FNA er å samle celler fra en masse, vev eller organ. Bruk av større barnåler er nyttig å øke cellularitet, men kan være forbundet med overdreven blod forurensning, mens prøvetaking med mindre nåler gir høyere kvalitet, men mindre rikelig materiale. I vårt tilfelle, perkutan aspirasjon av ytre mannlige reproduktive strukturer hos mus eksperimentelt smittet med T. brucei, ble utført med 22-gauge nåler koplet til en 5 ml sprøyte. Mus var anesthetized, testikkel ble stabilisert med en hånd og punktering og aspirasjon guidet og fremført med den andre hånden. Vi hentet en rekke trypanosomes admixed med bakterieceller, spermatozoa, epitelceller og stromal celler, som ble smurt og immunostained for parasitter overflate proteiner (VSG) (Figur 4).
Det er alltid den potensielle sampling feil i prøvemålingsaspirasjoner gir negative resultater fordi selv om flere områder av en gitt lesjon kan samples flere ganger, er dette en blind aspirasjon der vi ikke visualisere nålen spissen og målet orgel eller masse. Dette er svært relevant i en klinisk setting, hvor en negativ FNA av en mistenkelig lesjon ikke obviate videre undersøkelser, men det er ikke så relevant i dyremodeller av sykdom. Dermed generelle begrensninger omfatter hovedsakelig falske negative resultater, og mindre ofte falske positive resultater (f. eks, fra blod forurensning), men den viktigste begrensningen i innstillingen av dyr eksperimentering er mangelen på informasjon om vev arkitektur17, som vi har med histopatologi, for eksempel distribusjon mønster av parasitter, av immunceller, og celle-celle interaksjon funksjoner. Likevel, fordelene er at FNA er en ikke-Terminal prosedyre som gir mulighet for gjentatt prøvetaking i samme dyr over tid og alltid gir bedre bevart cellulær morfologi (figur 5). Alternativer til FNA for høsting vert celler, immunceller eller mikroorganismer fra en mus alltid stole på euthanizing musen til å samle massen eller organer av interesse.
Til vår kunnskap, er det bare noen få rapporter om bruk av FNA i små forsøksdyr, en fra 1949 tilsvarende til aspirasjon av benmarg med 22 G nål for å studere hematopoiesen18, og alle andre i kombinasjon med Flow flowcytometri til kvantifisere enten tumor-assosiert inflammatoriske celler eller endothelial celler7,19,20. Vårt arbeid viser at denne teknikken kan utvides til diagnostisering og studier av smittsomme sykdommer modeller og kan kombinere cytologi med teknikker som immuncytokjemi eller elektron mikroskopi. To av de store fordelene med metoden i forsøksdyr er: (1) denne prosedyren er ikke Terminal, det vil si, kan utføres i levende mus; og (2) på grunn av sin milde alvorlighetsgrad det gir mulighet for serielle ambisjoner i samme dyr. Derfor færre mus er nødvendig for hver studie, og sammenhengen mellom progresjon av klinisk sykdom og utviklingen av cellulære og molekylære funksjoner av en sykdom og/eller mikroorganismen kan enkelt utføres, og dermed muliggjør langsgående studier.
Kanskje den første rapporten om bruk av FNA for å diagnostisere en smittsomme sykdommer er en studie av Grieg og Gray i 1904 som rapporterer nål ambisjoner av lymfeknuter fra pasienter med sovende sykdom, som avslørte aktive trypanosomes12. Hvis våre funn i laboratoriet mus finne oversettelse til storfe, det vil si at hvis Trypanosoma lett kan SAMPLET av Fna fra eksterne mannlige reproduktive strukturer, kan man forvente at denne teknikken vil være nyttig for veterinærer for diagnostisering av dyr Sovesyke på gården, i husdyr.
The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet ble finansiert av Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino Superior (MCTES) gjennom Fundos do Orçamento de Estado (Ref.: ID/BIM/50005/2019). LMF er en undersøker av Fundação para en Ciência e Tecnologia (IF/01050/2014) og laboratoriet er finansiert av ERC (FatTryp, REF. 771714). Publisering av dette arbeidet ble også finansiert UID/BIM/50005/2019 prosjekt finansiert av Fundação para en Ciência e en Tecnologia (FCT)/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino Superior (MCTES) gjennom Fundos do Orçamento de Estado. Vi takker Andreia Pinto fra histologi og sammenlignende patologi Laboratory av iMM for ekspert Electron mikroskopi assistanse, og Sandra Trindade, Tiago Rebelo og Henrique Machado (iMM) for deling av vev fra infiserte mus.
Atipamezole (ANTISEDAN 10 mL) | Bio 2 | 7418046 | Anesthesia reversal |
Cover slips (24 x 60 No.1) | VWR | 631-0664 | Smear making |
DAB | Dako | K3468 | Immunocytochemistry |
Entellan (500 mL) | VWR | 1.07961.0500 | Mounting media |
Envision Flex antibody diluent | Dako | 8006 | Immunocytochemistry |
EnVision Flex conjugated w/ HRP (anti-rabbit) | Dako | K4010 | Immunocytochemistry |
Envision Flex Wash Buffer | Dako | K8007 | Immunocytochemistry |
Giemsa stain | Atom Scientific Ltd | RRSPSS-A | Smear staining |
Glass slides (Superfrost Plus) | VWR | 631-9483 | Smear making |
Harris Haematoxylin | Bio-optica | 05-06004E | Immunocytochemistry |
Hydrogen Peroxidase solution | Sigma | H1009-500ML | Immunocytochemistry |
Hypodermic needles Microlance 3 (23G) | Henry Schein | 902-8001 | Aspiration technique |
Ketamin (IMALGENE 1000 – 10 mL) | Bio 2 | 7410928 | Anesthesia |
Medetomidine (DOMITOR 10 mL) | Bio 2 | 7418335 | Anesthesia |
Methanol | Merck | 1.06009.2511 | Smear fixative |
Pap pen | Merck | Z377821-1EA | Immunocytochemistry |
Protein Block Serum free | Dako | X0909 | Immunocytochemistry |
Syringes (5 mL, 10 mL) | Henry Schein | 900-3311, 900-3304 | Aspiration technique |